CN109010415B - 一种石油醚绿豆提取物及其制备方法和用途 - Google Patents

一种石油醚绿豆提取物及其制备方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种绿豆提取物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：用乙醇溶液提取绿豆后浓缩至浸膏状，加水混悬得到浓缩液；用石油醚对浓缩液进行萃取，分离后石油醚相去溶剂，将石油醚萃取物进行硅胶柱层析，以二氯甲烷‑甲醇溶液进行梯度洗脱，收集二氯甲烷‑甲醇体积比为5:1‑8:1的馏分；馏分去溶剂后，洗涤、干燥，得到绿豆提取物。本发明的石油醚绿豆提取物中活性成分含量高，能够较好的减少炎症反应产生的NO释放，具有良好的抗炎效果；本发明的方法操作简便，原料来源丰富，成本低，可快速得到大量的提取物，可以作为绿豆有效部位应用于药品、保健品、化妆品等中，且使用的有机试剂易去除，能回收利用，可工业化生产。

Description

一种石油醚绿豆提取物及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及植物提取技术领域，具体涉及一种石油醚绿豆提取物及其制备方法和用途。
背景技术
绿豆(Vigna radiatus L.)又名文豆、吉豆、青小豆，是豆科草本植物绿豆的成熟种子，作为豆类中主要的粮食作物在各地被广泛种植，绿豆是我国传统杂粮作物，产量和出口量均居世界首位，至今已有两千多年的栽培史，属高蛋白、低脂肪、中淀粉作物，营养丰富，经济利用价值高。同时，绿豆具有良好食用及药用价值，有“济世之食谷”之说。绿豆含有均衡的营养素，包括蛋白质和膳食纤维，以及含有大量的生物活性物质，如氨基酸、黄酮类、酚类、低聚糖等，是抗氧化、抗炎、抑菌和抗肿瘤的主要活性成分。绿豆药材是《中国药典》2015年版中收载的多个成方制剂，如护肝片、消络痛片、消络痛胶囊和清宁丸的重要组成药味。传统中医认为绿豆味性干寒，内服具有清热解毒、消炎、利水润肤等功效。现在医学则认为绿豆在抗炎、抑菌、降脂、抗肿瘤和解毒方面功效颇佳。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种石油醚绿豆提取物及其制备方法和用途。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种绿豆提取物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)绿豆与乙醇溶液混合进行提取，过滤得到粗提液；
(2)粗提液浓缩至浸膏状，加水混悬得到浓缩液；
(3)用石油醚对浓缩液进行萃取，分离后石油醚相去溶剂，得到石油醚萃取物；
(4)将石油醚萃取物进行硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇溶液进行梯度洗脱，收集二氯甲烷-甲醇体积比为5:1-8:1的馏分；
(5)馏分去溶剂后，洗涤、干燥，得到绿豆提取物。
优选地，步骤(1)中乙醇溶液的中乙醇的体积分数为30～90％，每批次的绿豆提取1～4次，每次提取的绿豆与乙醇溶液的料液比为1:5～1:30kg/L，提取温度为40～80℃，提取时间为1～3小时。
优选地，步骤(1)中乙醇溶液中乙醇的的体积分数为75％，每批次的绿豆提取2次，每次提取的绿豆与乙醇溶液的料液比为1:10kg/L，提取温度为74℃，提取时间为2.5小时。
优选地，步骤(4)中梯度洗脱的方法为：用100:1-0:1的二氯甲烷-甲醇溶液进行洗脱，分8-12个不同比例的梯度，每个梯度洗脱量为2～5倍柱体积。
更优选地，步骤(4)中梯度洗脱的方法为：以二氯甲烷-甲醇体系(100:1、80:1、60:1、40:1、20:1、10:1、8:1、5:1、2:1、1：1、0：1)梯度依次洗脱3～4个柱体积。
优选地，步骤(2)中将浓缩后的浸膏加与浸膏质量相等的水混悬得到浓缩液；步骤(3)中萃取的方法为：用石油醚的体积为浓缩液体积的1-3倍，萃取2-5次。
更有选地，步骤(2)中将浓缩后的浸膏加与浸膏质量相等的水混悬得到浓缩液；步骤(3)中萃取的方法为：用石油醚的体积为浓缩液质量的1.2倍，萃取3次。
优选地，步骤(5)中馏分去溶剂的方式为减压蒸馏，蒸馏温度为45～60℃。
优选地，步骤(5)中干燥的方法为真空干燥或低温冷冻干燥。
本发明还提供一种上述任一所述方法制备的石油醚绿豆提取物。
本发明的石油醚绿豆提取物中活性成分含量高，能够较好的减少炎症反应产生的NO释放，具有良好的抗炎效果。
本发明还提供一种上述石油醚绿豆提取物为在制备抗炎药品、抗炎保健品、抗炎化妆品中的用途。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种石油醚绿豆提取物及其制备方法，本发明的石油醚绿豆提取物中活性成分含量高，能够较好的减少炎症反应产生的NO释放，具有良好的抗炎效果；本发明的方法操作简便，原料来源丰富，成本低，可快速得到大量的提取物，可以作为绿豆有效部位应用于药品、保健品、化妆品等中，且使用的有机试剂易去除，能回收利用，可工业化生产。
附图说明
图1为本发明实施例的绿豆石油醚提取物的高效液相色谱图。
图2为本发明实施例的绿豆石油醚提取物对raw264.7细胞安全浓度的筛选结果图。
图3为本发明实施例的绿豆石油醚提取物对LPS诱导raw264.7产生的NO释放影响实验结果图。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
作为本发明实施例的一种石油醚绿豆提取物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将绿豆成熟种子(2kg)加入至提取罐，第一次加入20L的75％乙醇，80℃提取2.5h，过滤得到滤液1，将残渣再加入20L的75％乙醇，提取2.5h，过滤得到滤液2，合并两次滤液；
(2)减压回收滤液中的乙醇，得到乙醇总浸膏，再将乙醇总浸膏在水中(质量比：1:1)分散，得到浓缩液；
(3)用1.2倍浓缩液体积的石油醚反复萃取3次，每次静置3h，合并回收石油醚层，减压回收石油醚，得到石油醚萃取物；
(4)将500g硅胶(100～200目)用二氯甲烷混匀装柱，压实，将石油醚萃取物(220g)用二氯甲烷溶解，与220g硅胶混匀(100～200目)，挥干二氯甲烷，均匀装入硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇体系(100:1、80:1、60:1、40:1、20:1、10:1、8:1、5:1、2:1、1：1、0：1)梯度依次洗脱3～4个柱体积，经薄层色谱检测，相同成分的流分合并，收集二氯甲烷-甲醇体积比为8:1时的馏分；
(5)将其馏分减压回收，真空干燥，即为本发明所述石油醚绿豆提取物。
实施例2
作为本发明实施例的一种石油醚绿豆提取物的制备方法，本实施所述方法与实施例1的唯一区别为：步骤(4)中，收集二氯甲烷-甲醇体积比为5:1时的馏分。
实施例3
作为本发明实施例的一种石油醚绿豆提取物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将绿豆成熟种子(2kg)加入至提取罐，第一次加入20L的40％乙醇，40℃提取2.5h，过滤得到滤液1，将残渣再加入20L的45％乙醇，提取2.5h，过滤得到滤液2，合并两次滤液；
(2)减压回收滤液中的乙醇，得到乙醇总浸膏，再将乙醇总浸膏在水中(质量比：1:1)分散，得到浓缩液；
(3)用3倍浓缩液体积的石油醚反复萃取3次，每次静置3h，合并回收石油醚层，减压回收石油醚，得到石油醚萃取物；
(4)将500g硅胶(100～200目)用二氯甲烷混匀装柱，压实，将石油醚萃取物(220g)用二氯甲烷溶解，与220g硅胶混匀(100～200目)，挥干二氯甲烷，均匀装入硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇体系(100:1、80:1、60:1、40:1、20:1、10:1、8:1、5:1、2:1、1：1、0：1)梯度依次洗脱3～4个柱体积，经薄层色谱检测，相同成分的流分合并，收集二氯甲烷-甲醇体积比为8:1时的馏分；
(5)将其馏分减压回收，真空干燥，即为本发明所述石油醚绿豆提取物。
实施例4
作为本发明实施例的一种石油醚绿豆提取物的制备方法，所述方法包括以下步骤：
(1)将绿豆成熟种子(2kg)加入至提取罐，第一次加入30L的60％乙醇，40℃提取2.5h，过滤得到滤液1，将残渣再加入30L的75％乙醇，提取2.5h，过滤得到滤液2，合并两次滤液；
(2)减压回收滤液中的乙醇，得到乙醇总浸膏，再将乙醇总浸膏在水中(质量比：1:1)分散，得到浓缩液；
(3)用3倍浓缩液体积的石油醚反复萃取3次，每次静置3h，合并回收石油醚层，减压回收石油醚，得到石油醚萃取物；
(4)将500g硅胶(100～200目)用二氯甲烷混匀装柱，压实，将石油醚萃取物(220g)用二氯甲烷溶解，与220g硅胶混匀(100～200目)，挥干二氯甲烷，均匀装入硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇体系(100:1、80:1、60:1、40:1、20:1、10:1、8:1、5:1、2:1、1：1、0：1)梯度依次洗脱3～4个柱体积，经薄层色谱检测，相同成分的流分合并，收集二氯甲烷-甲醇体积比为8:1时的馏分；
(5)将其馏分减压回收，真空干燥，即为本发明所述石油醚绿豆提取物。
实施例5
供试样品的配制：将本发明实施例1中步骤(4)得到的的馏分，用甲醇超声溶液溶解后，过0.22μm微孔滤膜即得。
液相条件：所制备的样品通过高效液相色谱法进行测定，测试条件为以十八烷基硅氧烷键合硅胶为填充剂(waters Xbridge-C18，4.6×250mm，5μm)，以甲醇-水为流动相；检测波长为268nm。
表1液相检测流动相洗过程序
时间/min 甲醇/％ 水/％
5 10 90
15 30 70
25 40 60
35 45 55
46 80 20
所得色谱图见图1，由图可知，本发明的绿豆提取物共有9个色谱峰，在图中分别标记为阿拉伯数字1～9，可用于绿豆提取物的质量控制。
实施例6
绿豆提取物的抗炎实验。
在正常生理状态下，巨噬细胞分泌的NO及其它炎性因子较少，NO是一种气体信号分子，它可以通过细胞膜参与多种生物过程，如神经递质传递、免疫防御、细胞凋亡和运动的调节等，是主要的炎性介质。在诱发炎症反应的诸多因素中，内毒素是激发炎症反应的一类重要触发剂，它是一种革兰氏阴性菌，其化学本质为脂多糖(LPS)，它可以通过刺激细胞，激活细胞内炎症信号传导通路，从而介导炎性因子的合成和释放，所以当受到外界致炎因子刺激时，巨噬细胞中的NO及其它炎性因子会失去平衡，分泌量显著增加，导致炎症的发生。当加入抗炎药物后，这些炎性因子受到抑制而减少，从而缓解炎症。因此，通过选取NO作为抗炎活性研究指标，可判断药物抗炎作用效果，筛选抗炎活性成分。
样品的配制：精密称取本发明实施例1中步骤(4)得到的的馏分，用含10％胎牛血清的DMEM培养基配成母液，经0.22μm滤器过滤，再用培养基稀释至实验所需浓度使用。
试剂的配制：
MTT(3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐)溶液的配制：精密称取MTT粉末，用PBS缓冲液溶解配制成浓度为5mg/ml的溶液，并用0.22μm的滤器除菌避光4℃保存，备用。
LPS溶液的配制：精密称取LPS固体，用PBS缓冲液配制成浓度为1mg/ml的溶液，并用0.22μm的滤器除菌避光4℃保存，备用。
细胞培养：无菌条件下，将raw264.7细胞接种于含10％胎牛血清的DMEM培养基的培养瓶中，在37℃，5％CO2饱和湿度环境下培养，待细胞生长至近融合状态，加入适量培养基，用一次性滴管吹打细胞，使细胞脱落，吹打均匀后将细胞传代至25cm2培养瓶中，每2d传代1次。
绿豆提取物抗炎作用安全浓度实验方法：
取对数生长期的细胞，加入适量培养基，用一次性滴管吹打细胞，使细胞脱落，吹打均匀后收集，取部分细胞加入台盼蓝，用细胞计数仪计数，调整细胞密度至4×104/mL，将细胞接种于96孔板中，每孔100μL，37℃，5％CO2饱和湿度环境下孵育24h，
添加用培养基配制的样品(10、20、40、80、160μg/mL)100mL，正常组不添加药物，空白组不接种细胞，等量培养基替换，每组设置3个复孔，于37℃，5％CO2饱和湿度环境下孵育24h，后弃培养基，用PBS洗涤一遍，每孔加入100μL DMEM无血清培养基和20μL 5mg/mL MTT溶液，在37℃，5％CO2饱和湿度环境下培养4h后，舍弃上清液，每孔加入150μL DMSO溶液，震荡5-10min，使结晶充分溶解，立即置酶标仪下测A490，实验重复三次。
细胞活性＝((样品处理组A490-空白组A490)/(正常组A490-空白组A490))×100％。
绿豆提取物对细胞的毒性结果见图2，由图可知，在10、20、40μg/ml浓度下raw264.7细胞活性与正常组相比没有显著性差异，80、160μg/ml浓度下细胞活性与正常组相比具有显著性差异(P＜0.05)，故绿豆提取物在10、20、40μg/ml浓度下对raw264.7正常细胞没有毒性。
绿豆提取物对LPS刺激raw264.7细胞产生NO的影响实验
实验分为正常组(培养基)、模型组(1μg/mL LPS)，实验组(石油醚绿豆提取物10、20、40μg/mL)。
取对数生长期的细胞，加入适量培养基，用一次性滴管吹打细胞，使细胞脱落，吹打均匀后收集，取部分细胞加入台盼蓝，用细胞计数仪计数，调整细胞密度至1×105/mL，将细胞接种于96孔板中，每孔100μL，37℃，5％CO2饱和湿度环境下孵育24h后，按分组添加培养基，每组设置3个复孔，于37℃，5％CO2饱和湿度环境下孵育24h后，在96孔板中加入样品培养液上清50μL，再加入室温Griess Reagent Ⅰ，之后各孔中继续加入室温GriessReagent Ⅱ，酶标仪530nm下测定吸光度。
IC50采用SPSS17.0软件计算实验结果。
绿豆提取物对LPS刺激raw264.7细胞释放NO的影响见图3，由图可知，与正常组相比，模型组NO水平显著升高(P＜0.05)；绿豆提取物高中低剂量均能抑制LPS刺激raw264.7细胞释放的NO(P＜0.05)，故表明绿豆提取物具有抗炎活性，可抑制炎症因子NO的释放，IC50为55.56μg/mL，且在此范围内对细胞没有毒性。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种绿豆提取物的制备方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）绿豆与乙醇溶液混合进行提取，过滤得到粗提液；步骤（1）中乙醇溶液的中乙醇的体积分数为75~90%，每批次的绿豆提取1~4次，每次提取的绿豆与乙醇溶液的料液比为1:5~1:30 kg/L，提取温度为40~80℃，提取时间为1~3小时；
（2）粗提液浓缩至浸膏状，加水混悬得到浓缩液；
（3）用石油醚对浓缩液进行萃取，分离后石油醚相去溶剂，得到石油醚萃取物；
（4）将石油醚萃取物进行硅胶柱层析，以100:1-0:1的二氯甲烷-甲醇溶液进行梯度洗脱，分8-12个不同比例的梯度，每个梯度洗脱量为2~5倍柱体积，收集二氯甲烷-甲醇体积比为5:1-8:1的馏分；
（5）馏分去溶剂后，洗涤、干燥，得到绿豆提取物。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中乙醇溶液中乙醇的体积分数为75%，每批次的绿豆提取2次，每次提取的绿豆与乙醇溶液的料液比为1:10 kg/L，提取温度为74℃，提取时间为2.5小时。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中将浓缩后的浸膏加与浸膏质量相等的水混悬得到浓缩液；步骤（3）中萃取的方法为：用石油醚的体积为浓缩液体积的1-3倍，萃取2-5次。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中馏分去溶剂的方式为减压蒸馏，蒸馏温度为45~60℃。
5.一种如权利要求1-4任一所述方法制备的石油醚绿豆提取物。
6.如权利要求5所述的石油醚绿豆提取物为在制备抗炎药品、抗炎化妆品中的用途。
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CN108164571A (zh) * 2018-02-23 2018-06-15 上海悦目化妆品有限公司 一种绿豆α-低聚半乳糖提取物及其提取方法和护肤应用

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