CN112794812B - 从香蕉花中提取的生物碱类化合物及其提取方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物碱类化合物提取的技术领域，具体涉及一种从香蕉花中提取的生物碱类化合物，它由以下步骤提取得到：(1)将新鲜香蕉花晒干，浸提，过滤，减压浓缩，获得乙醇提取物；(2)将乙醇提取物分散至水中，依次采用石油醚和乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯浸膏；(3)将乙醇乙酯浸膏溶解于甲醇中，分别通过洗脱液为甲醇和氯仿‑甲醇的硅胶色谱柱进行洗脱；(4)再通过高效液相色谱和硅胶色谱柱进行洗脱；(5)将依次通过高效液相色谱、硅胶色谱柱、高效液相色谱恒冲，用氯仿‑甲醇洗脱，收集洗脱液，获得生物碱类化合物。通过本发明方法制备的生物碱类化合物收率高，且具有较佳的抑制血小板聚集活性。

Description

从香蕉花中提取的生物碱类化合物及其提取方法

技术领域

本发明属于生物碱类化合物提取的技术领域，具体涉及一种从香蕉花中提取的生物碱类化合物及其提取方法。

背景技术

香蕉花是香蕉成熟采摘后产生了几乎与果实等量的废弃物，每株香蕉产生一个重量约为2kg左右的雄花，按180株/亩的种植密度结合我国香蕉面积可知，我国年产香蕉花约为500万吨以上。中医认为香蕉花味甘但、微辛、性凉、具有化痰消痞，平肝化瘀等功效，适用于胸膈饱胀，肮腹痞疼，吞酸反胃，头目昏眩，风湿疼痛等症。在许多亚洲国家如:斯里兰卡、马来群岛、印尼等国将香蕉花作为蔬菜，他们通常会用煮和油炸的方式进行食用。在印度，香蕉花作为提高女性母乳和减缓痛经的药材食用已有上千年的历史。在我国香蕉产区大量的香蕉花作为废料处理，由于其含水量高，腐烂时间长，容易引起虫害如象鼻虫，不仪造成蕉园环境二次污染，也浪费大量的植物资源，现阶段还未得到充分利用。

香蕉在生产过程中产生了几乎与果实等量的香蕉花、茎叶等废弃物，不利于香蕉的最大价值化,因此如何提高香蕉废弃物的综合利用是目前香蕉产业待解决的问题之一。香蕉花的营养价值较高，有很好的开发前景，国内学者对香蕉花的化学成分研究:其含有含量很高的皂苷、黄酮等物质；国外学者研究表明:香蕉花的水、乙醇和氯仿提取物均具有较强的降血糖功效，而花径和花的内部鲜嫩部分也可当做蔬菜食用。目前，前期对于活性物质的研究主要集中于香蕉花中的黄酮，对于香蕉花中其它成分的研究较少。目前还没有发现关于香蕉花生物碱类化合物及其提取方法的研究，更未见有相关研究报道对香蕉花中新生物碱类化合物的性质和用途进行的研究。

发明内容

本发明旨在解决上述技术问题，提供一种从香蕉花中提取的生物碱类化合物及其提取方法，本发明能够从香蕉花中提取得到新的生物碱类化合物，且该新的生物碱类化合物具有较好的抑制血小板聚集活性。

本发明的技术方案为：

本发明提供从香蕉花中提取的生物碱类化合物，其化学结构式如下：

本发明还提供从香蕉花中提取的生物碱类化合物的提取方法，包括以下提取步骤：

(1)将新鲜香蕉花晒干，用乙醇浸提3次，每次1天，合并提取液，过滤，减压浓缩，获得乙醇提取物；

(2)将乙醇提取物分散至水中，依次采用石油醚和乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯浸膏；

(3)将乙醇乙酯浸膏溶解于甲醇中，通过洗脱液为甲醇的硅胶色谱柱进行洗脱，再通过所述梯度洗脱液为氯仿-甲醇的硅胶色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱依次以氯仿-甲醇体积比为100:1→60:1→30:1→10:1→5:1进行；

(4)将步骤(3)中60:1梯度洗脱部位的接收液浓缩并通过高效液相色谱依次用20％和26％甲醇进行梯度洗脱，再通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，所述梯度洗脱液为氯仿-甲醇，梯度洗脱依次以氯仿-甲醇体积比为100:1→60:1→30:1→10:1进行；

(5)将步骤(4)中30:1梯度洗脱部位的接收液合浓缩并通过高效液相色谱用43％甲醇恒冲，再通过硅胶色谱柱以氯仿-甲醇体积比为15:1进行恒冲，继续通过高效液相色谱用40％甲醇恒冲，用氯仿-甲醇体积比为4:1作为洗脱剂，收集并浓缩Rf值为0.5的洗脱液，得到所需产物。

本发明所述的甲醇百分数均为体积百分数。

在提取生物碱类化合物时，得到的乙醇提取物较稀，为了方便后续纯化，优选地，本发明所述步骤(1)中，所述减压浓缩的温度为25～40℃，压力为(-0.06)～(-0.1)MPa。

为了能够提高提取率，充分提取到生物碱类化合物，优选地，本发明所述步骤(2)中，石油醚和乙酸乙酯分别萃取2-4次。

在浸提前，为了提高提取率，优选地，本发明所述步骤(1)中，在浸提之前对香蕉花作如下处理：将晒干的香蕉花加入乙醇后，均质，动态超高压微射流处理。香蕉花在微射流均质机反应腔中受到强烈剪切、高速撞击、压力瞬时释放、涡旋等综合作用，使得香蕉花原料颗粒在水中更均匀地分散、混合和微粒化；并使香蕉花原料细胞破碎度增大，溶剂利用细胞的通透性或渗透性，更易进入细胞内部，从而和细胞内的有效成分快速达到溶解平衡，更利于提取的进行。

在动态超高压微射流处理时，料液比也是提高收率的重要元素之一，如果液体量过低，提取不能充分进行，如果液体量过大，乙醇提取物相对更加分散，在反应腔内，剧烈作用下，可能造成生物碱类化合物结构受损，降低收率，因此为了提高收率，优选地，本发明香蕉花和乙醇的料液比为1g:40-50ml。

均质也称匀浆，是使悬浮液(或乳化液)体系中的分散物微粒化、均匀化的处理过程，这种处理同时起降低分散物尺度和提高分散物分布均匀性的作用，为了后续动态超高压微射流更好进行，先进行均质处理，优选地，本发明所述均质条件为：压力为15-20MPa，时间为15-20min。

在用动态超高压微射流处理香蕉花原料时，处理的压力、温度和处理时间会影响后续的纯化收率，如果纯化时间不够，达不到最高收率，在一定的时间内，瞬时高压的作用，生物碱类化合物能够在极短的时间充分渗透到溶剂里面，且在一定的时间内溶解快速达到平衡，如果继续延长处理时间，不但不能提高提取率，还延长提取周期，提高成本，另外处理温度升高有利于生物碱类化合物的溶解，提取率会升高，但是太高会破坏生物碱类化合物的结构，不利于生物碱类化合物的提取，而在一定压力范围内，压力增加，有利于细化乙醇提取物颗粒，利于有效物质的溶出，但是压力太大，就有损乙醇提取物，不利于提取。因此，为了提高提取率，优选地，本发明所述动态超高压微射流处理条件为：压力为120-125MPa，温度为50-60℃，时间为50-80min。

发明人发现本发明的生物碱类化合物具有一定的抑制血小板聚集的活性，从而预防和治疗各种血栓和栓塞性的疾病，因此，本发明所述的生物碱类化合物在制备抑制血小板聚集药物中的应用，具有很好的前景。

由于采用上述技术方案，本发明的有益效果为：

1、采用本发明的提取方法能够从香蕉花中提取得到新的生物碱类化合物，产率高，且质量稳定，申请人的试验表明本发明的生物碱类化合物具有抑制血小板聚集的活性，有望用于抑制血小板聚集药物的制备。

2、在浸提之前，将香蕉花打浆后进行均质处理后，再进行动态超高压微射流处理，可以细化香蕉花的固相颗粒，使香蕉花原料细胞壁破裂，传质速度加快，有利于后续纯化，提高收率。

3、本发明以香蕉花为原料提取生物碱，能够变废为宝，降低生产成本，提高香蕉种植业的经济效益。

附图说明

图1为本发明实施例1获得化合物的IR(KBr)光谱；

图2为本发明实施例1获得化合物的ESI-MS图谱；

图3为本发明实施例1获得化合物的HR-ESI-MS图谱；

图4为本发明实施例1获得化合物的¹H-NMR图谱；

图5为本发明实施例1获得化合物的¹³C-NMR图谱；

图6为本发明实施例1获得化合物的¹H-¹H COSY图谱；

图7为本发明实施例1获得化合物的HSQC图谱；

图8为本发明实施例1获得化合物的HMBC图谱。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明中的百分含量若未作具体说明，均为重量百分含量。

实施例1

(1)将7kg新鲜香蕉花晒干，用乙醇浸提3次，每次1天，合并提取液，过滤，在温度为25℃，压力为-0.06MPa下减压浓缩至液体没有味道，获得乙醇提取物；

(2)将乙醇提取物分散基本溶解至水中，依次采用石油醚和乙酸乙酯分别萃取3次，得到965g乙酸乙酯浸膏；

(3)将乙醇乙酯浸膏溶解于甲醇中，加入100目乙醇乙酯浸膏重量2倍的硅胶拌样，待溶剂挥发干后，通过洗脱液为甲醇的硅胶色谱柱进行洗脱，再通过所述梯度洗脱液为氯仿-甲醇的硅胶色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱依次以氯仿-甲醇体积比为100:1→60:1→30:1→10:1→5:1进行；

(4)将步骤(3)中60:1梯度洗脱部位的接收液浓缩并通过高效液相色谱依次用体积百分数为20％甲醇、体积百分数为26％甲醇进行梯度洗脱，再通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，所述梯度洗脱液为氯仿-甲醇，硅胶色谱柱梯度洗脱依次以氯仿-甲醇体积比为100:1→60:1→30:1→10:1进行；

(5)将步骤(4)中30:1梯度洗脱部位的接收液合浓缩并通过高效液相色谱用体积百分数为43％甲醇恒冲，再通过硅胶色谱柱以氯仿-甲醇体积比为15:1进行恒冲，继续通过高效液相色谱用体积百分数为40％甲醇恒冲，用氯仿-甲醇体积比为4:1作为溶剂溶解，用毛细管将溶解液点至薄层层析(TLC)硅胶板上，收集并浓缩Rf值为0.5的洗脱液，TLC板上显示为橘红色，所得结晶用甲醇重结晶得到24mg目标产物，为白色粉末。

对白色粉末进行分析，其波普特性如下：

UV(MeOH)λ_max：221(sh),298nm；IR(KBr)光谱(见图1)中显示含芳香醛基(1639cm^-1)和苯环(1526,1491和1452cm^-1)的特征吸收峰；ESI-MS m/z 284[M+Na]⁺(见图2)；HR-ESI-MSm/z 284.0894[M+Na]⁺(计算值C₁₄H₁₅NO₄Na,284.0893)(见图3)，结合¹H-NMR(见图4)和¹³C-NMR(见图5)谱确定分子式为C₁₄H₁₅NO₄，不饱和度为8。本化合物的¹H-NMR和¹³C-NMR信号全归属见表1，其中：

¹H-NMR谱(acetone-d₆,500MHz)显示15个质子信号，其中δ_H 2.86(2H,br.t,J＝7.8Hz)与4.47(2H,br.t,J＝7.8Hz)为一组互相偶合的亚甲基质子信号，推测结构中含有-CH₂-CH₂片段。在低场区可以观察到醛基质子信号δ_H 9.53(1H,s)；此外，还可以观察到2组互相偶合的芳香质子信号：一组为苯环上ABX偶合质子信号δ_H 6.52(1H,dd,J＝8.0,2.0Hz),6.71(1H,d,J＝8.0Hz)和6.72(1H,d,J＝2.0)；一组为吡咯环上质子信号δ_H 6.94(1H,d,J＝4.0Hz)和6.16(1H,d,J＝4.0Hz)。

¹³C-NMR(acetone-d₆,125MHz)显示14个碳信号，分别为：1个醛基碳；1组苯环碳信号；1组吡咯环碳信号和3个饱和的亚甲基碳信号，结合¹H-¹H COSY(见图6)和HSQC(见图7)可以得到C-3/C-4相连，C-5″/C-6″相连以及C-1′/C-2′相连。上述NMR特征与化合物pyrrolezanthine(见Y.P.Yang,M.J.Chen,C.M.Teng,Y.L.Chang,I.L.Tsai,I.S.Chen,Phytochemistry,2002,61(5),567–572.)很相似，其主要区别在于：pyrrolezanthine中苯环为1″,4″-对位二取代，而本化合物中苯环为1″,3″,4″-三取代。上述苯环取代基位置进一步由HMBC(见图8)确认：H-2″与C-4″相关，H-5″与C-3″相关以及H-6″与C-2″和C-4″相关。

综上所述，上述实施例的白色粉末化合物命名为3″-hydroxypyrrolezanthine，为一个新的生物碱，可以确定所得的白色粉末的化学结构式如下：

上述化合物的重要¹H-¹H COSY

和HMBC

关系如下：

上述化合物的¹H-NMR和¹³C-NMR信号全归属见表1。

表1上述化合物的¹H-NMR和¹³C-NMR谱数据(acetone-d6,δH 2.04,δC 29.8ppm)

实施例2

与实施例1不同的是：(1)将8kg新鲜香蕉花晒干，用乙醇浸提3次，每次1天，合并提取液，过滤，在温度为40℃，压力为-0.1MPa下减压浓缩，获得乙醇提取物；(2)将乙醇提取物分散至水中，依次采用石油醚和乙酸乙酯分别萃取3次，得到976g乙酸乙酯浸膏；其余步骤和参数同实施例1，得到26mg白色粉末状的目标产物。将得到的白色粉末进行质谱和碳谱分析，确定结构如上述实施例1得到的化合物。

实施例3

与实施例2不同的是：将6kg新鲜香蕉花晒干，按料液比为1:40(g/ml)加入乙醇，在15MPa下均质20min，再在120MPa和50℃下动态超高压微射流处理80min，继续浸提3次，每次1天，合并提取液，过滤，在温度为40℃，压力为-0.1MPa下减压浓缩，获得乙醇提取物；其余步骤和参数同实施例1，得到16mg白色粉末状的目标产物。将得到的白色粉末进行质谱和碳谱分析，确定结构如上述实施例1得到的化合物。

实施例4

与实施例2不同的是：将10kg新鲜香蕉花晒干，按料液比为1:50(g/ml)加入乙醇，在20MPa下均质15min，再在125MPa和60℃下动态超高压微射流处理50min，继续浸提3次，每次7天，合并提取液，过滤，在温度为40℃，压力为-0.1MPa下减压浓缩，获得乙醇提取物；其余步骤和参数同实施例1，得到29mg白色粉末状的目标产物。将得到的白色粉末进行质谱和碳谱分析，确定结构如上述实施例1得到的化合物。

对比例1

与实施例3不同的是：动态超高压微射流处理压力为115MPa，其余步骤和参数同实施例3，得到8mg白色粉末状的目标产物。将得到的白色粉末进行质谱和碳谱分析，确定结构如上述实施例1得到的化合物。

对比例2

与实施例3不同的是：动态超高压微射流处理压力为130MPa，其余步骤和参数同实施例3，得到9mg白色粉末状的目标产物。将得到的白色粉末进行质谱和碳谱分析，确定结构如上述实施例1得到的化合物。

从实施例2-3和对比例1-5可知，本发明通过动态超高压微射流处理处理浸提原料后，能够显著提高生物碱化合物的收率，而动态超高压微射流处理压力过大或者过小，都会影响收率的大小。

试验例：本发明的生物碱化合物的抑制血小板聚集活性试验

1、实验材料

SD大鼠：雄性，SPF级，重量300±20g，购买自广西医科大学动物中心。

试剂与仪器：化合物实施例1分离得到；二磷酸腺苷(ADP)、花生四烯酸(AA)(北京索莱宝科技有限公司)；阿司匹林(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；氯吡格雷(乐普药业股份有限公司)；AggRAM^TM型血小板聚集仪(美国Helena公司)。

2、实验方法

(1)化合物对二磷酸腺苷(ADP)诱导血小板聚集的作用

SD大鼠经腹主动脉取血，129mmol/L枸橼酸钠抗凝，800r/min离心10min制备富血小板血浆(PRP)；吸取上清PRP后，3500r/min离心10min制备贫血小板血浆(PPP)，用PPP调整PRP至血小板计数为200×10⁹个/L备用。将PRP随机分组，分别为：溶剂对照组(0.9％氯化钠溶液)，阳性对照组(氯吡格雷，1.6mM)，实施例1低剂量组(0.05mM)、实施例1中剂量组(0.1mM)、实施例1高剂量组(0.2mM)。于血小板聚集仪(37℃)检测石英杯中，分别将相应药物加入调整好浓度的各组PRP中温育5min，再加入终浓度为10μM的ADP诱导血小板聚集，记录3min血小板聚集曲线，测定各组血小板的最大聚集率，并按下式计算受试品对血小板聚集的抑制率：

抑制率＝[(溶剂对照组血小板最大聚集率-受试品血小板最大聚集率)/溶剂对照组血小板最大聚集率]×100％。

(2)化合物对花生四烯酸(AA)诱导血小板聚集的作用

按上述方法制备PRP和PPP，调整PRP至血小板计数为500×10⁹个/L，将PRP随机分组，分别为：溶剂对照组(0.9％氯化钠溶液)，阳性对照组(阿司匹林，0.4mM)，实施例1低剂量组(0.05mM)、实施例1中剂量组(0.1mM)、实施例1高剂量组(0.2mM)。药物孵育PRP后加入终浓度为0.5mM的AA诱导血小板聚集3min，记录血小板的最大聚集率，并计算药物对血小板聚集的抑制率。

(3)化合物对正常血小板的作用

制备PRP和PPP，调整PRP至血小板数目为200×10⁹个/L，将PRP随机分为4组:溶剂对照(生理盐水)组，实施例1低浓度组(0.25g/L)、实施例1中浓度组(0.5g/L)、实施例1高浓度组(1g/L)。用药物孵育PRP后，直接记录血小板聚集曲线和血小板最大聚集率，观察化合物对正常血小板的作用。

3、实验结果

表2化合物对ADP诱导血小板聚集的影响

从表2可知，本发明的化合物对ADP诱导的血小板聚集具有显著的抑制作用且呈剂量效应，剂量高，聚集抑制率就高，化合物的浓度达到0.2mM时，对ADP诱导血小板聚集的抑制作用高于阳性对照氯吡格雷组。

表3化合物对AA诱导血小板聚集的影响

从表3可知，本发明的化合物对AA诱导的血小板聚集具有显著的抑制作用且呈剂量效应，剂量高，聚集抑制率就高，当化合物的浓度达到0.5g/L时，对AA诱导血小板聚集的抑制作用就大于阳性对照阿司匹林组，当化合物的浓度达到1g/L时，对AA诱导血小板聚集的抑制作用就远大于阳性对照阿司匹林组。

从表2和表3结果表明本发明的生物碱类化合物具有抑制血小板聚集的活性，有望用于抑制血小板聚集药物的制备。

上述说明是针对本发明较佳可行实施例的详细说明，但实施例并非用以限定本发明的专利申请范围，凡本发明所提示的技术精神下所完成的同等变化或修饰变更，均应属于本发明所涵盖专利范围。

Claims (8)

1.从香蕉花中提取的生物碱类化合物，其特征在于，其化学结构式如下：

2.如权利要求1所述生物碱类化合物的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)将新鲜香蕉花晒干，用乙醇浸提3次，每次1天，合并提取液，过滤，减压浓缩，获得乙醇提取物；

(2)将乙醇提取物分散至水中，依次采用石油醚和乙酸乙酯萃取，得到乙酸乙酯浸膏；

(3)将乙醇乙酯浸膏溶解于甲醇中，通过洗脱液为甲醇的硅胶色谱柱进行洗脱，再通过所述梯度洗脱液为氯仿-甲醇的硅胶色谱柱进行梯度洗脱，梯度洗脱依次以氯仿-甲醇体积比为100:1→60:1→30:1→10:1→5:1进行；

(4)将步骤(3)中60:1梯度洗脱部位的接收液浓缩并通过高效液相色谱依次用体积百分数为20％和体积百分数为26％甲醇进行梯度洗脱，再通过硅胶色谱柱进行梯度洗脱，所述梯度洗脱液为氯仿-甲醇，梯度洗脱依次以氯仿-甲醇体积比为100:1→60:1→30:1→10:1进行；

(5)将步骤(4)中30:1梯度洗脱部位的接收液浓缩并通过高效液相色谱用体积百分数为43％甲醇恒冲，再通过硅胶色谱柱以氯仿-甲醇体积比为15:1进行恒冲，继续通过高效液相色谱用体积百分数为40％甲醇恒冲，用氯仿-甲醇体积比为4:1作为洗脱剂，收集并浓缩Rf值为0.5的洗脱液，得到所需产物。

3.如权利要求2所述生物碱类化合物的提取方法，其特征在于：所述步骤(1)中，所述减压浓缩的温度为25～40℃，压力为(-0.06)～(-0.1)MPa。

4.如权利要求2所述生物碱类化合物的提取方法，其特征在于：所述步骤(2)中，石油醚和乙酸乙酯分别萃取2-4次。

5.如权利要求2所述生物碱类化合物的提取方法，其特征在于：所述步骤(1)中，在浸提之前对香蕉花作如下处理：将晒干的香蕉花加入乙醇后，打浆，均质，动态超高压微射流处理。

6.如权利要求5所述生物碱类化合物的提取方法，其特征在于：香蕉花和乙醇的料液比为1g:40-50ml。

7.如权利要求5所述生物碱类化合物的提取方法，其特征在于：所述均质条件为：压力为15-20MPa，时间为15-20min。

8.如权利要求5所述生物碱类化合物的提取方法，其特征在于：所述动态超高压微射流处理条件为：压力为120-125MPa，温度为50-60℃，时间为50-80min。

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