CN112898358B - 一个从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物nby-4及其制备方法与应用 - Google Patents

一个从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物nby-4及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物NBY‑4及其制备方法与应用，解决从具有悠久食疗历史牛蒡叶中提取抗炎活性的新化合物，并实现新化合物在制备抗炎药物中的应用问题，方法是，牛蒡叶粉碎，用30%乙醇回流提取，提取液浓缩，进行NKA‑9柱层析，依次用水、乙醇梯度洗脱，收集70%乙醇洗脱液，减压回收溶剂，稠浸膏加水分散，乙酸乙酯萃取，减压回收溶剂，硅胶柱层析，二氯甲烷‑甲醇梯度洗脱，再进行ODS柱层析，以甲醇水溶液梯度洗脱，洗脱液减压回收溶剂，再经Sephadex LH‑20柱层析，甲醇洗脱，减压回收溶剂，在甲醇中重结晶，得从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY‑4，本发明制备方法易操作，导向性强，分离速度快，效率高，产品纯度高。

Description

一个从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物NBY-4及其 制备方法与应用
技术领域
本发明涉及医药，特别是一个从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物NBY-4及其制备方法与应用。
背景技术
牛蒡叶为菊科植物牛蒡Arctiumlappa的干燥基生叶，在我国分布广泛，生于山坡、山谷、林缘、林中、灌木丛中、河边潮湿地、村庄路旁或荒地，海拔750-3500米。食用及药用历史悠久，营养成分丰富。牛蒡叶在治疗疮痈肿毒方面疗效确切，如《本草图经》记载“根、叶亦可生捣，入少盐花，以拓肿毒。”现代药理研究表明，牛蒡叶具有抗菌，抗氧化，抗炎等功效。
脓毒症的患病率为288/10万人/年，近年来其患病率呈上升趋势，据报道全球每年大约有530万例患者死于脓毒症或重度脓毒症，近年发布的脓毒症3.0版本中最新诊断标准指出，脓毒症主要由于感染导致器官功能障碍，死亡的主要原因是器官功能损伤。脓毒症是临床医学疾病概念，中医学与之相对应的属“温病”“瘟疫”“热毒”范畴，其病机在于邪毒热盛，内传营血，耗伤营阴，正气亏损耗伤气阴。正邪相争，热毒内蕴，炼液成痰，营卫气血运行不畅，血热化瘀，阻滞脉络，脏腑精血津液耗伤亏损，无以为继，导致衰竭，正气不足。
临床应对脓毒症患者采用连续性静脉血液滤过的方法清除患者体内的炎症介质、电解质，帮助机体重建内环境，缓解患者的病情，中药是个大宝库，对治疗脓毒症有独特作用，但针对牛蒡叶提取物具有抗氧化活性，用于制备抗炎药物，有望成为新的用于抑制炎症的新药物，从中获得用于抑制炎症的安全、有效的化合物，并用于制备抗炎的药物至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本发明之目的就是提供一个从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物NBY-4及其制备方法与应用，解决从具有悠久食疗历史牛蒡叶中提取抗炎活性的新化合物，并实现新化合物在制备抗炎药物中的应用问题。
本发明一个从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物NBY-4，分子结构式为：
Figure BDA0002925566950000011
其制备方法是，包括以下步骤：
(1)将干燥的牛蒡叶15～30kg，粉碎，质量浓度30％乙醇回流提取1～4次，每次用量为牛蒡叶重量的4～6倍，每次提取1～4h，合并提取液，浓缩至相当于生药0.1～3g/mL的浓缩液；
(2)将浓缩液进行NKA-9柱层析，内径15～30cm，高60～200cm，依次用水、质量浓度30％乙醇、70％乙醇梯度洗脱，用量分别为200～1000L、200～1600L、200～2000L，流速1～5BV/h，收集70％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得稠浸膏(750～2000g)；
(3)将稠浸膏加水1～5L分散，分别用乙酸乙酯1～4L、1～4L、0.5～2L、0.5～1L萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物Fr.A(50～140g)，再进行内径4～7cm、高8～20cm的硅胶柱层析，分别以二氯甲烷-甲醇100:3、3～10L，100:5、6～20L洗脱，收集100:5梯度洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2(10～20g)；
(4)将组分Fr.A-2进行ODS柱层析，内径1.5～4cm，高20～100cm，并以甲醇水溶液梯度洗脱，质量浓度20％甲醇1～4L，质量浓度40％甲醇2～6L，质量浓度60％甲醇2～12L，收集60％甲醇洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2-3(4～12g)；
(5)组分Fr.A-2-3经Sephadex LH-20柱层析，内径1～3cm，高70～120cm，用甲醇1.1～10L洗脱，流速1mL/min，收集洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2-3-3(450～1200mg)；
(6)组分Fr.ETOAC-2-3-3在甲醇中重结晶，得从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-4(70～300mg)。
本发明方法从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物NBY-4，制备方法易操作，导向性强，分离速度快，效率高，产品纯度高，该化合物可有效用于制备抗炎的药物，开拓了牛蒡叶的新用途和药用价值，经济和社会效益巨大。
附图说明
图1为本发明化合物NBY-4的分子结构式；
图2为本发明化合物NBY-4的主要HMBC及H-H COSY相关图；
图3为本发明化合物NBY-4的NOESY相关图；
图4为本发明化合物NBY-4的1H-NMR谱图；
图5为本发明化合物NBY-4的13C-NMR谱图；
图6为本发明化合物NBY-4的HSQC谱图；
图7为本发明化合物NBY-4的HMBC谱图；
图8为本发明化合物NBY-4的红外光谱图；
图9为本发明化合物NBY-4的紫外光谱图；
图10为本发明化合物NBY-4的质谱图；
图11为本发明化合物NBY-4的工艺流程图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明在具体实施中可由以下实施例给出。
实施例1
本发明一个从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物NBY-4的制备方法，包括以下步骤：
(1)将干燥的牛蒡叶30kg，粉碎，质量浓度30％乙醇回流提取2次，每次用量为牛蒡叶重量的5倍，每次提取1.5h，合并提取液，浓缩至相当于生药0.5g/mL的浓缩液；
(2)将浓缩液进行NKA-9柱层析，内径18cm，高150cm，依次用水、质量浓度30％乙醇、70％乙醇梯度洗脱，用量分别为600L、600L、1800L，流速2BV/h，收集70％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得稠浸膏(1200g)；
(3)将稠浸膏加水2.5L分散，分别用乙酸乙酯2.5L、2.5L、1L、1L萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物Fr.A(80g)，再进行内径4cm、高20cm的硅胶柱层析，分别以二氯甲烷-甲醇100:3、6L，100:5、10L洗脱，收集100:5梯度洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2(20g)；
(4)将组分Fr.A-2进行ODS柱层析，内径1.8cm，高55cm，并以甲醇水溶液梯度洗脱，质量浓度20％甲醇1.5L，质量浓度40％甲醇3L，质量浓度60％甲醇5L，收集60％甲醇洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2-3(8g)；
(5)组分Fr.A-2-3经Sephadex LH-20柱层析，内径1cm，高110cm，用甲醇1.5L进行洗脱，流速1mL/min，收集洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2-3-3(1000mg)；
(6)组分Fr.ETOAC-2-3-3在甲醇中重结晶，得从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-4(280mg)。
实施例2
本发明一个从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物NBY-4的制备方法，包括以下步骤：
(1)将干燥的牛蒡叶30kg，粉碎，质量浓度30％乙醇回流提取3次，每次用量为牛蒡叶重量的4倍，每次提取3h，合并提取液，浓缩至相当于生药1g/mL的浓缩液；
(2)将浓缩液进行NKA-9柱层析，内径27cm，高90cm，依次用水、质量浓度30％乙醇、70％乙醇梯度洗脱，用量分别为450L、800L、1000L，流速4BV/h，收集70％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得稠浸膏(1000g)；
(3)将稠浸膏加水3.5L分散，分别用乙酸乙酯3.5L、3.5L、2L、1L萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物Fr.A(65g)，再进行内径6cm、高13cm的硅胶柱层析，分别以二氯甲烷-甲醇100:3、9L，100:5、18L洗脱，收集100:5梯度洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2(10～20g)；
(4)将组分Fr.A-2进行ODS柱层析，内径3cm，高25cm，并以甲醇水溶液梯度洗脱，质量浓度20％甲醇3.5L，质量浓度40％甲醇5.5L，质量浓度60％甲醇11L，收集60％甲醇洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2-3(7g)；
(5)组分Fr.A-2-3经Sephadex LH-20柱层析，内径3cm，高80cm，用甲醇9L洗脱，流速1mL/min，收集洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2-3-3(550mg)；
(6)组分Fr.ETOAC-2-3-3在甲醇中重结晶，得从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-4(110mg)。
实施例3
本发明一个从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物NBY-4的制备方法，包括以下步骤：
(1)将干燥的牛蒡叶15kg，粉碎，质量浓度30％乙醇回流提取2次，每次用量为牛蒡叶重量的6倍，每次提取2h，合并提取液，浓缩至相当于生药0.3g/mL的浓缩液；
(2)将浓缩液进行NKA-9柱层析，内径22cm，高130cm，依次用水、质量浓度30％乙醇、70％乙醇梯度洗脱，用量分别为350L、500L、750L，流速3BV/h，收集70％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得稠浸膏(750g)；
(3)将稠浸膏加水2L分散，分别用乙酸乙酯2L、1L、0.5L、0.5L萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物Fr.A(50g)，再进行内径6cm、高15cm的硅胶柱层析，分别以二氯甲烷-甲醇100:3、6L，100:5、13L洗脱，收集100:5梯度洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2(15g)；
(4)将组分Fr.A-2进行ODS柱层析，内径1.8cm，高55cm，并以甲醇水溶液梯度洗脱，质量浓度20％甲醇1.5L，质量浓度40％甲醇3L，质量浓度60％甲醇5L，收集60％甲醇洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2-3(4g)；
(5)组分Fr.A-2-3经Sephadex LH-20柱层析，内径2cm，高100cm，用甲醇5L洗脱，洗脱流速1mL/min，收集洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2-3-3(450mg)；
(6)组分Fr.ETOAC-2-3-3在甲醇中重结晶，得从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-4(70mg)。
实施例4
本发明一个从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物NBY-4的制备方法，包括以下步骤：
(1)将干燥的牛蒡叶15kg，粉碎，质量浓度30％乙醇回流提取2次，每次用量为牛蒡叶重量的6倍，每次提取3h，合并提取液，浓缩至相当于生药2g/mL的浓缩液；
(2)将浓缩液进行NKA-9柱层析，内径25cm，高110cm，依次用水、质量浓度30％乙醇、70％乙醇梯度洗脱，用量分别为400L、600L、850L，流速3.5BV/h，收集70％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得稠浸膏(900g)；
(3)将稠浸膏加水3L分散，分别用乙酸乙酯3L、3L、1.5L、1L萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物Fr.A(60g)，再进行内径5cm、高12cm的硅胶柱层析，分别以二氯甲烷-甲醇100:3、7L，100:5、14L洗脱，收集100:5梯度洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2(17g)；
(4)将组分Fr.A-2进行ODS柱层析，内径2.5cm，高40cm，并以甲醇水溶液梯度洗脱，质量浓度20％甲醇2.5L，质量浓度40％甲醇4.5L，质量浓度60％甲醇9L，收集60％甲醇洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2-3(5g)；
(5)组分Fr.A-2-3经Sephadex LH-20柱层析，内径2.5cm，高100cm，用甲醇7L洗脱，流速1mL/min，收集洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2-3-3(500mg)；
(6)组分Fr.ETOAC-2-3-3在甲醇中重结晶，得从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-4(85mg)。
要指出的是，上述实施例仅是用于说明本发明的具体实施方式，以对该从牛蒡叶中提取具有抗炎活性的化合物及其提取方法进行的详细描述，是说明性的，而不是用于限定本发明的保护范围，凡是在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，均应属本发明的保护范围之内。
本发明化合物具有抗炎活性，可有效实现化合物NBY-4在制备治疗抗炎药物中的应用。
上述所得化合物经测定，鉴定为从牛蒡叶中提取的一个新化合物NBY-4，分子结构式见图1所示，经实验具有抗炎作用，有关具体测定和实验资料如下：
一、结构鉴定
采用的仪器与材料：
Shimadzu double-beam 210A紫外光谱仪(Shimadzu,Kyoto,日本)；
LTQ orbitrap高分辨质谱仪(Thermo Fisher Scientific,Bremen,德国)；
核磁共振仪：Bruker AVANCEⅢ500-NMR spectrometer(Bruker,Billerica,German)，TMS为内标；
Thermo Fisher Scientific U3000型高效液相色谱仪；
BT25S精密天平(德国赛多利斯公司有限公司)。
柱色谱硅胶(100-200，200-300目)(青岛海洋化工有限公司)；Sephadex LH-20(天津市光复精细化工研究所)；ODS(北京绿百草科技发展有限公司)NKA-9大孔吸附树脂(天津波鸿树脂科技有限公司)。
氘代试剂：DMSO-d6、CD3OD和CDCl3(Cambridge Isotope Laboratories,USA)色谱级甲醇(MeOH)和乙腈(MeCN)均购于美国TEDIA天地试剂公司，石油醚、甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯等试剂均为分析纯(天津富宇精细化工有限公司)。
DMEM高糖培养基(以色列BI公司，批号：0024419)；
胎牛血清(以色列BI公司，批号：02-411-9)；
脂多糖(lipopolysaccharide，LPS，美国Sigma-Aldrich公司，批号：L2994，加生理盐水配置储存液)；
OX-LDL(上海源叶生物科技有限公司，批号：S24897)；
BCA蛋白定量试剂盒(武汉博士德生物公司，批号：AR1110)；
RIPA裂解液(武汉博士德生物公司，批号：AR0102)；
生物安全柜(美国赛默飞公司，型号1384-A2)；
二氧化碳培养箱(美国赛默飞公司，型号3111)；
酶标仪(美国赛默飞公司，型号MULTISKANFC)；
该化合物经测定，化合物NBY-4白色粉末，
Figure BDA0002925566950000061
(c＝0.08g/100ml,CH3OH)；通过HR-ESI-MS[M+Na]+计算m/z＝423.23523，分子式为C21H36O7，不饱和度为4。紫外光谱显示(CH3OH)λmax(logε):201(0.580)nm；红外光谱显示了羟基和烯烃(3457,3253,1647,913cm-1)等特征吸收信号。1H-NMR(CD3OD,500MHz)和13C-NMR(CD3OD,125MHz)数据显示了三个甲基信号[δH 1.28(3H,s,H-10)，1.20(3H,s,H-11)，0.75(3H,s,H-13)；δC 25.1(C-10)，29.9(C-11)，17.4(C-13)]，5个亚甲基信号[δH 1.32(1H,m,H-5a)，1.49(1H,brd,J＝12.8Hz,H-5b)，1.59(2H,m,H-6)，2.00(1H,m,H-7a)，2.28(1H,m,H-7b)，1.15(1H,br d,J＝12.6Hz,H-1a)，1.68(1H,m,H-1b)，1.36(1H,m,H-4a)，2.28(1H,m,H-4b)；δC 42.5(C-5)，24.0(C-6)，37.7(C-7)，27.6(C-1)，50.3(C-4)]，3个次甲基信号[δH 1.84(1H,d,J＝11.9Hz,H-8a)，1.68(1H,m,H-2)，3.96(1H,td,J＝10.4,4.7Hz,H-3)]，两个sp3季碳[(δC 37.9(C-4a),74.7(C-9)]，一个1,1-二取代双键[δH 4.43(1H,br s,H-12a)，4.71(1H,br s,H-12b)；δC151.3(C-8)，105.9(C-12)]，一个β-葡萄糖基团信号[δH4.43(1H,d,J＝8.1Hz,H-1′)，3.14(1H,d,J＝8.1Hz,H-2′)，3.35(1H,m,H-3′)，3.29(1H,m,H-4′)，3.29(1H,m,H-5′)，3.67(1H,m,H-6′a)，3.83(1H,d,J＝11.0Hz,H-6′b)；δC105.7(C-1′)，75.2(C-2′)，78.4(C-3′)，71.5(C-4′)，78.0(C-5′)，62.7(C-6′)]。这些光谱数据表明，化合物NBY-4属于桉树烷型倍半萜。通过HMBC和H-H COSY确定了化合物NBY-4的平面结构。H2-6和H-5a/H2-7，H-1和H-8a/H-2，H-3和H-2,H-4之间的H-H COSY关联支持了化合物NBY-4的苷元的推测。H-5与C-6/C-7/C-8a/C-4a；H2-12与C-7/C-8a；H2-1与C-8a/C-2；H-2与C-9；H-3与C-1′；H2-4与C-2/C-3/C-4a；H3-10/H3-11与C-9；H3-13与C-5/C-4/C-4a有HMBC的相关性；通过NOESY实验确定了化合物NBY-4的相对构型。从H-3到H3-13，H3-10的NOE相关性表明了它们的界面取向。然而，这些数据并不表明从H-3到H-2，从H3-13到H-8a的相关性，这表明H-2和H-8a在同一面。化合物NBY-4经酸水解得到葡萄糖，β-葡萄糖的初始旋光度为
Figure BDA0002925566950000072
确认其为β-D-葡萄糖。通过计算ECD确定化合物NBY-4的绝对构型，化合物NBY-4的实测ECD光谱在200nm处呈现负的cotton效应。计算ECD曲线与实验ECD曲线吻合较好，确定化合物NBY-4的绝对构型为2R,3R,4aS,8aR。
Figure BDA0002925566950000071
Figure BDA0002925566950000081
二、活性实验
1.1细胞培养
将RAW264.7细胞培养于DMEM完全培养基(含10％新生牛血清和90％DMEM不完全培养液)中，置37℃、含5％CO2培养箱内培养。选择对数生长期细胞用于实验。
小鼠单核巨噬细胞(RAW264.7)由河南中医药大学细胞成像实验室培养。
1.2 MTT法检测RAW264.7细胞活力
取对数生长期的RAW264.7细胞，用完全培养基配成1×105个/mL的细胞悬浮液，接种于96孔板中，每孔加入100μl的细胞悬液，置37℃、含5％CO2培养箱内培养。24h后，弃去孔内上清液，分别加入100μl浓度为160、80、40、20、10、0mM，化合物NBY-4的完全培养基，即给药组和空白组，每组设置3个复孔，置37℃、含5％CO2培养箱内培养。24h后，每孔加入MTT 10μl，继续培养3h，弃去上清液，每孔加入100μl DMSO，在要床上振摇10min后，紫色结晶充分溶解，用酶标仪在490nm处测定各孔OD值。并计算细胞存活率，细胞存活率＝(A测/A空)×100％。
表1 化合物NBY-4对RAW264.7细胞活性的影响(
Figure BDA0002925566950000082
n＝3)
Figure BDA0002925566950000083
注：与空白比较*p＜0.01，**p＜0.001。
化合物NBY-4不同浓度对RAW264.7细胞活力的影响，如表1在化合物NBY-4浓度为160μM的时候，细胞存活率低于100％，其他浓度下细胞存活率大于100％。我们选择在化合物NBY-4对细胞的给药浓度为20、40、80μM的时候，用于对细胞下一步实验研究。
1.3Griess法检测LPS诱导RAW264.7细胞产生NO水平
将处于对数生长期的细胞接种于24孔板(2×105个细胞/孔)，37℃、5％CO2环境的培养箱中培养12h后加入不同质量浓度的待测样品，温孵培养1h后加人1μg/mL LPS。同时设空白对照组(培养基)、模型(LPS+培养基)组、阳性药组(地塞米松+培养基)和药物作用组。继续温孵培养24h。每组重复3次独立实验。将上清液(100mL)与等体积格氏试剂混合，用酶联免疫检检测仪测定混合物在540nm处的OD值，计算NO抑制率，结果见表2。
表2 化合物NBY-4对LPS诱导的RAW264.7细胞NO水平影响(
Figure BDA0002925566950000091
n＝3)
Figure BDA0002925566950000092
阳性药：地塞米松
由表2可知，模型组NO的释放量显著高于空白对照组(P<0.01)，表明造模成功。与模型组相比，各浓度处理均能显著降低NO的释放量(P<0.01)，且呈浓度依赖性。由表2可以看出，化合物NBY-4能够较好地抑制炎症因子NO的生成，为该植物后续抗炎活性研究提供参考。
2体内动物实验
以上述化合物为主制备一种治疗急性肺炎的药物，进行了实验。
2.1动物与材料：LPS从Sigma Aldrich，美国，密苏里州圣路易斯市购买。DMEM高糖培养基购自BI，以色列。胎牛血清(FBS)购自Gibco，美国，加利福尼亚州卡尔斯巴德。二甲基亚砜(DMSO)和3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基-2-H-四唑溴化铵(MTT)染料购自Sigma-Aldrich美国密苏里州圣路易斯市。BCA蛋白检测试剂盒和一氧化氮检测试剂盒购自北京生物技术研究所海门。吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(PDTC)购自Sigma-Aldrich美国密苏里州圣路易斯市。白桦酸(BetA)购自MedChemExpress中国，上海。TNF-α和IL-8酶联免疫吸附试剂盒购自联科生物技术股份有限公司，中国，杭州。RT-PCR、qPCR和PrimeScriptTM试剂盒购自TaKaRa Bio公司，中国，大连
昆明小鼠，体质量18～20g，由海南医学院新药安全评估中心提供，合格证号HNACSDC20160866，在进行正式实验前在本实验室饲养一周。
2.2动物造模、分组与给药：将小鼠分为4组，每组10只，分别为对照组、模型组、制备药物低、高剂量(40、80mg/kg)组。对照组未作任何处理；模型组ip 10mg/kg LPS；治疗组诱导LPS后ig制备的药物40、80mg/kg。LPS处理6h后，治疗组在LPS处理6h之后给予制备的药物50、100mg/kg治疗，连续给药7d，后采集血清。
2.3指标检测：末次给药1h后，处死实验动物，收集全部血液置于无抗凝剂的离心管中，静止半小时，3000r/min离心取上层血清，待进行各项检测。所有血清样品的检测均根据ELISA试剂盒说明书进行。每个样品平行测量3次，结果表示为3次结果的平均值。该项实验下共测定了血清中NO、IL-8和TNF-α水平。
表3 制备的药物对脂多糖诱导的小鼠急性肺炎模型的影响
Figure BDA0002925566950000101
Figure BDA0002925566950000102
与对照组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05
实验表明，本发明化合物NBY-4作为具有显著的抗炎活性(作用)，有效用于制备治疗急性肺炎的药物中的应用。
综上所述，本发明是从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物NBY-4，原料丰富，制备方法易操作，导向性强，产品纯度97％以上，该化合物可有效用于制备抗炎的药物，开拓了牛蒡叶的新用途和药用价值，经济和社会效益巨大。

Claims (8)

1.一个从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物，为从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-4，分子结构式为：
Figure FDA0002925566940000011
2.权利要求1所述的从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物NBY-4的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将干燥的牛蒡叶15～30kg，粉碎，质量浓度30％乙醇回流提取1～4次，每次用量为牛蒡叶重量的4～6倍，每次提取1～4h，合并提取液，浓缩至相当于生药0.1～3g/mL的浓缩液；
(2)将浓缩液进行NKA-9柱层析，内径15～30cm，高60～200cm，依次用水、质量浓度30％乙醇、70％乙醇梯度洗脱，用量分别为200～1000L、200～1600L、200～2000L，流速1～5BV/h，收集70％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得稠浸膏；
(3)将稠浸膏加水1～5L分散，分别用乙酸乙酯1～4L、1～4L、0.5～2L、0.5～1L萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物Fr.A，再进行内径4～7cm、高8～20cm的硅胶柱层析，分别以二氯甲烷-甲醇100:3、3～10L，100:5、6～20L洗脱，收集100:5梯度洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2；
(4)将组分Fr.A-2进行ODS柱层析，内径1.5～4cm，高20～100cm，并以甲醇水溶液梯度洗脱，质量浓度20％甲醇1～4L，质量浓度40％甲醇2～6L，质量浓度60％甲醇2～12L，收集60％甲醇洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2-3；
(5)组分Fr.A-2-3经Sephadex LH-20柱层析，内径1～3cm，高70～120cm，用甲醇1.1～10L洗脱，流速1mL/min，收集洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2-3-3；
(6)组分Fr.ETOAC-2-3-3在甲醇中重结晶，得从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-4。
3.根据权利要求2所述的从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物NBY-4的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将干燥的牛蒡叶30kg，粉碎，质量浓度30％乙醇回流提取2次，每次用量为牛蒡叶重量的5倍，每次提取1.5h，合并提取液，浓缩至相当于生药0.5g/mL的浓缩液；
(2)将浓缩液进行NKA-9柱层析，内径18cm，高150cm，依次用水、质量浓度30％乙醇、70％乙醇梯度洗脱，用量分别为600L、600L、1800L，流速2BV/h，收集70％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得稠浸膏；
(3)将稠浸膏加水2.5L分散，分别用乙酸乙酯2.5L、2.5L、1L、1L萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物Fr.A，再进行内径4cm、高20cm的硅胶柱层析，分别以二氯甲烷-甲醇100:3、6L，100:5、10L洗脱，收集100:5梯度洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2；
(4)将组分Fr.A-2进行ODS柱层析，内径1.8cm，高55cm，并以甲醇水溶液梯度洗脱，质量浓度20％甲醇1.5L，质量浓度40％甲醇3L，质量浓度60％甲醇5L，收集60％甲醇洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2-3；
(5)组分Fr.A-2-3经Sephadex LH-20柱层析，内径1cm，高110cm，用甲醇1.5L进行洗脱，流速1mL/min，收集洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2-3-3；
(6)组分Fr.ETOAC-2-3-3在甲醇中重结晶，得从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-4。
4.根据权利要求2所述的从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物NBY-4的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将干燥的牛蒡叶30kg，粉碎，质量浓度30％乙醇回流提取3次，每次用量为牛蒡叶重量的4倍，每次提取3h，合并提取液，浓缩至相当于生药1g/mL的浓缩液；
(2)将浓缩液进行NKA-9柱层析，内径27cm，高90cm，依次用水、质量浓度30％乙醇、70％乙醇梯度洗脱，用量分别为450L、800L、1000L，流速4BV/h，收集70％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得稠浸膏；
(3)将稠浸膏加水3.5L分散，分别用乙酸乙酯3.5L、3.5L、2L、1L萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物Fr.A，再进行内径6cm、高13cm的硅胶柱层析，分别以二氯甲烷-甲醇100:3、9L，100:5、18L洗脱，收集100:5梯度洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2；
(4)将组分Fr.A-2进行ODS柱层析，内径3cm，高25cm，并以甲醇水溶液梯度洗脱，质量浓度20％甲醇3.5L，质量浓度40％甲醇5.5L，质量浓度60％甲醇11L，收集60％甲醇洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2-3；
(5)组分Fr.A-2-3经Sephadex LH-20柱层析，内径3cm，高80cm，用甲醇9L洗脱，流速1mL/min，收集洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2-3-3；
(6)组分Fr.ETOAC-2-3-3在甲醇中重结晶，得从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-4。
5.根据权利要求2所述的从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物NBY-4的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将干燥的牛蒡叶15kg，粉碎，质量浓度30％乙醇回流提取2次，每次用量为牛蒡叶重量的6倍，每次提取2h，合并提取液，浓缩至相当于生药0.3g/mL的浓缩液；
(2)将浓缩液进行NKA-9柱层析，内径22cm，高130cm，依次用水、质量浓度30％乙醇、70％乙醇梯度洗脱，用量分别为350L、500L、750L，流速3BV/h，收集70％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得稠浸膏；
(3)将稠浸膏加水2L分散，分别用乙酸乙酯2L、1L、0.5L、0.5L萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物Fr.A，再进行内径6cm、高15cm的硅胶柱层析，分别以二氯甲烷-甲醇100:3、6L，100:5、13L洗脱，收集100:5梯度洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2；
(4)将组分Fr.A-2进行ODS柱层析，内径1.8cm，高55cm，并以甲醇水溶液梯度洗脱，质量浓度20％甲醇1.5L，质量浓度40％甲醇3L，质量浓度60％甲醇5L，收集60％甲醇洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2-3；
(5)组分Fr.A-2-3经Sephadex LH-20柱层析，内径2cm，高100cm，用甲醇5L洗脱，洗脱流速1mL/min，收集洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2-3-3；
(6)组分Fr.ETOAC-2-3-3在甲醇中重结晶，得从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-4。
6.根据权利要求2所述的从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物NBY-4的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将干燥的牛蒡叶15kg，粉碎，质量浓度30％乙醇回流提取2次，每次用量为牛蒡叶重量的6倍，每次提取3h，合并提取液，浓缩至相当于生药2g/mL的浓缩液；
(2)将浓缩液进行NKA-9柱层析，内径25cm，高110cm，依次用水、质量浓度30％乙醇、70％乙醇梯度洗脱，用量分别为400L、600L、850L，流速3.5BV/h，收集70％乙醇洗脱液，减压回收溶剂，得稠浸膏；
(3)将稠浸膏加水3L分散，分别用乙酸乙酯3L、3L、1.5L、1L萃取4次，合并乙酸乙酯萃取液，减压回收溶剂，得乙酸乙酯萃取物Fr.A，再进行内径5cm、高12cm的硅胶柱层析，分别以二氯甲烷-甲醇100:3、7L，100:5、14L洗脱，收集100:5梯度洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2；
(4)将组分Fr.A-2进行ODS柱层析，内径2.5cm，高40cm，并以甲醇水溶液梯度洗脱，质量浓度20％甲醇2.5L，质量浓度40％甲醇4.5L，质量浓度60％甲醇9L，收集60％甲醇洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2-3；
(5)组分Fr.A-2-3经Sephadex LH-20柱层析，内径2.5cm，高100cm，用甲醇7L洗脱，流速1mL/min，收集洗脱液，减压回收溶剂，得组分Fr.A-2-3-3；
(6)组分Fr.ETOAC-2-3-3在甲醇中重结晶，得从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的化合物NBY-4。
7.权利要求1所述的从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物NBY-4在制备抗炎药物中的应用。
8.权利要求1所述的从牛蒡叶中提取的具有抗炎活性的新化合物NBY-4在制备治疗急性肺炎的药物中的应用。
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