CN114773304B - 一种从银线草提取物中分离得到的乌药烷型倍半萜化合物及其在制备治疗肝癌药物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从银线草提取物中分离的乌药烷型倍半萜化合物，其结构式为：本发明通过Transwell、划痕实验、三维培养等细胞实验进行研究，结果表明本发明的化合物可以逆转肝癌细胞上皮细胞‑间充质转化(EMT)，从而抑制肝癌细胞的侵袭和转移，可在肝癌治疗上发挥显著成效。

Description

一种从银线草提取物中分离得到的乌药烷型倍半萜化合物及 其在制备治疗肝癌药物中的应用
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及一种从银线草提取物中分离得到的乌药烷型倍半萜化合物及其在制备治疗肝癌药物中的应用。
背景技术
肝癌(liver cancer)是死亡率仅次于胃癌、食道癌的第三大常见恶性肿瘤，初期症状并不明显，晚期主要表现为肝痛、乏力、消瘦、黄疸、腹水等症状。临床上一般采取西医的手术、放化疗与中药结合疗法，但晚期患者因癌细胞扩散而治愈率较低，因此要做到肝癌的早期发现、早期诊断、早期治疗。
由于依靠血清甲胎蛋白(AFP)检测结合超声显像对高危人群的监测，使肝癌在亚临床阶段即可和出诊断早期切除的远期效果尤为显著。加之积极综合治疗，已使肝癌的五年生存率有了显著提高。
银线草(Chloranthus japonicus)属于金粟兰科金粟兰属植物。根据相关文献报道，金粟兰属植物中的化学成分包括倍半萜类化合物及其聚合物、香豆素类、黄酮类和酰胺类等。本属植物有较好的药用价值，具有抗菌消炎、活血散瘀、解毒消肿、祛湿散寒等作用，可以用以治疗多种疾病，在国内该属一些植物已被用于治疗痈、肿瘤和癣菌等。
在民间，银线草可作为中药，常常用来治疗多种疾病如外伤骨折、神经衰弱、肺结核及风湿性关节炎等。根据对本植物的化学研究表明其中富含倍半萜和倍半萜二聚体类化合物，具有多种生物学活性。因此对银线草全草进行化学成分为进一步保护和开发利用银线草提供理论依据。近年来，临床上使用中药制剂及中西医结合治疗癌症的报道越来越多，也逐渐成为研究热点。
发明内容
针对目前肝癌发病率高，转移率高，缺乏有效治疗药物的现状，本发明提出了一种从银线草提取物中分离的乌药烷型倍半萜化合物及其在制备治疗肺癌药物中的应用。
本发明的第一方面提供了一种从银线草提取物中分离得到的乌药烷型倍半萜化合物，该化合物的结构式如式Ⅰ所示：
本发明的第二方面给出了式Ⅰ所示化合物的提取分离方法，该方法包括如下步骤：
(1)银线草(Chloranthus japonicus)的全草用甲醇提取，回收溶剂制得粗提物。
(2)将步骤(1)所得粗提物以水混悬，用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取部位。
(3)将步骤(2)所得的萃取部位以硅胶柱色谱使用不同比例的石油醚-丙酮系统进行梯度洗脱。
(4)将步骤(3)所得的馏分经TLC检测合并后，以反相中压液相分离，使用流动相甲醇-水进行洗脱。
(5)将步骤(4)所得的馏分经反相HPLC进行分离，使用流动相甲醇-水进行洗脱，后制得式Ⅰ所示化合物。
优选的，步骤(1)所述的粗提物为金粟兰科金粟兰属植物银线草全草的甲醇提取物，提取方式为回流提取。
优选的，步骤(2)所述的萃取物为乙酸乙酯萃取物，其体积与水混悬物的体积比为1:1。
优选的，步骤(3)所述的洗脱剂石油醚-丙酮系统的体积比为100: (0-30)。
优选的，步骤(3)所述的流动相甲醇-水的体积比为(0.76-0.82)： 1。
优选的，步骤(4)所述的流动相甲醇-水的体积比为0.68：1。
本发明的第三方面给出了上述式Ⅰ所示化合物在制备治疗肝癌药物中的应用。
具体地，上述药物是通过逆转肝癌细胞上皮细胞-间充质转化，从而抑制肝癌细胞的迁移、侵袭或转移和血管生成。
优选的，上述药物包含式Ⅰ所示化合物或其药学上可接受的盐，水合物或其组合及辅料。
优选的，所述药物的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液体制剂、喷雾剂、注射剂中的任意一种。
相对于现有技术，本发明所述的银线草提取物中乌药烷型倍半萜化合物具有以下优势：
本发明所述的式Ⅰ所示化合物对肝癌细胞系的迁移、侵袭和管道形成能力均具有显著的抑制作用，并可通过逆转其EMT，显著的抑制肝部肿瘤细胞的转移，同时可引发其在胞内凝集而使细胞丧失迁移运动能力，抑制肿瘤细胞的转移，引发了肿瘤细胞转移的能力的削弱，抑制肿瘤转移的与发展，可在肝癌治疗上发挥显著成效。
附图说明
构成本发明创造的一部分的附图用来提供对本发明创造的进一步理解，本发明创造的示意性实施例及其说明用于解释本发明创造，并不构成对本发明创造的不当限定。在附图中：
图1示出了化合物Ⅰ的1H NMR谱；
图2示出了化合物Ⅰ的13C NMR谱；
图3示出了化合物Ⅰ的DEPT135谱；
图4示出了化合物Ⅰ的HMQC谱；
图5示出了化合物Ⅰ的HMBC谱；
图6示出了化合物Ⅰ的1H-1H COSY谱；
图7、8示出了银线草提取物对肝癌细胞(HepG2)迁移能力的抑制作用；
图9、10示出了不同浓度的银线草提取物化合物Ⅰ对肝癌细胞 (HepG2)迁移能力的抑制作用；
图11、12示出了不同浓度的银线草提取物化合物Ⅰ对肝癌细胞 (HepG2)侵袭能力的抑制作用；
图13、14示出了不同浓度的银线草提取物化合物Ⅰ对肝癌细胞 (HepG2)管道形成能力的抑制作用；
图15示出了银线草提取物化合物Ⅰ对肝癌细胞(HepG2)中EMT 标志分子Snail1、Vimentin、N-Cadherin和E-Cadherin表达水平的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，需要说明的是，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1化合物的提取与分离方法
具体操作步骤如下：
(1)6公斤银线草全草以甲醇回流提取3次，合并提取液，减压浓缩得甲醇提取物。
(2)将步骤(1)制得的提取物加水混悬，以乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液，减压浓缩得乙酸乙酯萃取部位。
(3)将步骤(2)制得的萃取部位进行硅胶柱色谱分离，使用石油醚：丙酮(100:0、100:1、100:2、100:4、100:6、100:9、100:14、 100:20和100:30)进行梯度洗脱。
(4)将步骤(3)石油醚：丙酮100:1和100:2洗脱的馏分经 MPLC进行色谱分离，以76％-82％的甲醇水系统洗脱。
(5)将步骤(3)中76％-82％甲醇水系统洗脱的馏分进行HPLC 分离，以68％甲醇水系统洗脱得到单体化合物共6个，其中包括一种新乌药烷型倍半萜化合物，对这种化合物采用1H NMR谱、13C NMR 谱、DEPT135谱、HMQC谱、HMBC谱、1H-1H COSY谱的综合解析(如图1-6所示)，结合物理常数测定等，确定了该化合物的结构，经过查新，证明该化合物为新的化合物，其化合物类型上属于乌药烷型倍半萜类化合物。
化合物Ⅰ的结构鉴定数据如下：
白色粉末；(c 0.14,CH2Cl2)；IR(KBr)νmax 3079,2936, 2360,1771,1664,1456,1375,1323,1239,1223,1196,1146,1108,1087,1056,1035,1014,986,941,921,887,794,762cm-1；HR-ESIMS m/z 335.1490[M+H]+(calcd for C18H23O6 335.1495)。1H NMR(400MHz, CDCl3)和13C NMR(100MHz,CDCl3)data,见表1。
表1化合物Ⅰ的1H NMR数据和13C NMR数据
实施例2体外细胞水平检测银线草提取物对肝癌细胞系HepG2 迁移能力影响
2.1实验方法：细胞划痕法
2.2具体实验步骤为：将细胞接种于24孔板中培养单层细胞至 100％，使用无菌枪头尖端制100μm划痕空白区，弃液，1×PBS洗2 次，分别加入浓度为50μM的实施例1得到的银线草提取物制得的细胞培养液，并设置不加药物的对照孔，置于37℃、CO2(5％)培养箱中培养48h，于0h、12h和24h时，放在光学显微镜上于固定位置取样，拍照，记录划痕两端细胞间距的变化。
相对起始位置比值(Ratio to 0h)＝Sxh/S0h；用Graphpad Prism 5软件绘制细胞迁移距离-时间曲线，各指标均用均值±标准差来表示。
2.3实验结果
实验结果表明了银线草提取物对肝癌细胞系HepG2细胞迁移能力的抑制作用：如图7、8所示(从时间与细胞的迁移距离之间的关系或者时间-迁移率曲线可以看出)，银线草提取物对肝癌细胞系均有迁移抑制作用，而银线草提取物化合物Ⅰ的作用最强。
实施例3体外细胞水平检测银线草提取物化合物Ⅰ对肝癌细胞系 HepG2迁移能力影响
3.1实验方法：细胞划痕法
3.2具体实验步骤为：将细胞接种于24孔板中培养单层细胞至 100％，使用无菌枪头尖端制100μm划痕空白区，弃液，1×PBS洗 2次，分别加入浓度为0μM、30μM、60μM、120μM银线草提取物化合物Ⅰ细胞培养液，并设置不加药物的对照孔，置于37℃、CO2(5％) 培养箱中培养48h，于0h、24h和48h时，放在光学显微镜上于固定位置取样，拍照，记录划痕两端细胞间距的变化。
相对起始位置比值(Ratio to 0h)＝Sxh/S0h；用Graphpad Prism 5 软件绘制细胞迁移距离-时间曲线，各指标均用均值±标准差来表示。
3.3实验结果
表明了银线草提取物化合物Ⅰ对肝癌细胞系HepG2细胞迁移能力的抑制作用：如附图9、10所示(从时间与细胞的迁移距离之间的关系或者时间-迁移率曲线可以看出)，银线草提取物化合物Ⅰ对肝癌细胞系有迁移抑制作用，且呈剂量依赖性。
实施例4体外细胞水平检测银线草提取物化合物Ⅰ对肝癌细胞系 HepG2侵袭能力影响
4.1实验方法：Transwell
具体实验步骤为：将HepG2细胞植入涂有基质材料的细胞室(BD，美国)，插入24孔板孔中。24孔板中充满完全培养基。将不同浓度的银线草提取物化合物Ⅰ加入室中，24h后将HepG2细胞移至下表面固定染色。
4.2实验结果
实验结果表明了银线草提取物化合物Ⅰ对肝癌细胞系HepG2细胞侵袭能力的抑制作用：如图11、12所示，银线草提取物化合物Ⅰ对肝癌细胞系有侵袭抑制作用，且呈剂量依赖性。
实施例5体外细胞水平检测银线草提取物化合物Ⅰ对肝癌细胞系 HepG2管道形成能力影响
5.1实验方法：Three-dimensional culture assay
5.2具体实验步骤为：HepG2细胞接种于用Matrigel(BD Biosciences)制备的96孔培养板中。将细胞与不同浓度的银线草提取物化合物Ⅰ共孵育。孵育后，使用光学显微镜(尼康，日本)捕捉细胞图像。
5.3实验结果
表明了银线草提取物化合物Ⅰ对肝癌细胞系HepG2细胞管道形成能力的抑制作用：如图13、14所示，银线草提取物化合物Ⅰ对肝癌细胞系有管道形成能力抑制作用，且呈剂量依赖性。
实施例6蛋白免疫印迹检测银线草提取物化合物Ⅰ对肝癌细胞系HepG2 EMT标志物E-cadherin,Vimentin,N-cadherin和Snail1表达的影响
6.1实验方法：蛋白免疫印迹
6.2具体实验步骤为：从不同浓度的银线草提取物化合物Ⅰ处理的HepG2细胞中提取蛋白，并通过western blot分析蛋白。用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析全细胞裂解液，转移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜(意大利米兰)上，然后用5％无脂牛奶封膜。与抗GAPDH、E-cadherin、Vimentin、N-cadherin和Snail单克隆抗体在4℃下孵育过夜。将膜与二抗进一步孵育(亲和力，1:10000)。最后，将膜置于电泳凝胶成像系统(ChemiScope 6000,CLIX，上海，中国)。
6.3实验结果
实验结果表明了银线草提取物化合物Ⅰ对肝癌细胞系的EMT进程有抑制作用。如图15所示，随着银线草提取物化合物Ⅰ的浓度增高， EMT标志物E-cadherin的表达量增加，标志物Vimentin、N-cadherin 和Snail1的表达量降低，证明其可显著的抑制肝部肿瘤细胞的转移。

Claims (8)

1.一种化合物，其特征在于，所述化合物的结构式如式Ⅰ所示：
（Ⅰ）。
2.权利要求1所述的化合物的制备方法，其特征在于，其制备方法包括如下步骤：
（1）银线草的全草用甲醇提取，回收溶剂制得粗提物；
（2）将步骤（1）所得粗提物以水混悬，用乙酸乙酯萃取，得乙酸乙酯萃取部位；
（3）将步骤（2）所得的萃取部位以硅胶柱色谱使用不同比例的石油醚-丙酮系统进行梯度洗脱；
（4）将步骤（3）所得的馏分经TLC检测合并后，以反相中压液相分离，使用流动相甲醇-水进行洗脱；
（5）将步骤（4）所得的馏分经反相HPLC进行分离，使用流动相甲醇-水进行洗脱后制得化合物Ⅰ；
其中，步骤（3）所述的洗脱剂石油醚-丙酮系统的体积比为100:（0-30）；步骤（4）所述的流动相甲醇-水的体积比为（0.76-0.82）：1；步骤（5）所述的流动相甲醇-水的体积比为0.68：1。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）所述的粗提物为金粟兰科金粟兰属植物银线草全草的甲醇提取物，提取方式为回流提取。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述的乙酸乙酯的体积与水的体积比为1:1。
5.权利要求1所述的化合物在制备治疗肝癌药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述药物通过逆转肝癌细胞上皮细胞-间充质转化，从而抑制肝癌细胞的侵袭、转移和血管生成。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述药物包含有效量的权利要求1所示的化合物或其药学上可接受的盐及辅料。
8.权利要求5所述的应用，其特征在于：所述药物的剂型为片剂、颗粒剂、胶囊剂、口服液体制剂、喷雾剂、注射剂中的任意一种。
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