CN111909228B - 一种生物碱类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种生物碱类化合物，其是在升麻中发现的新化学成分。本发明还通过理化性质和现代波谱学手段，对上述方法分离得到的化合物进行了结构鉴定。本发明还运用LPS诱导RAW 264.7细胞炎症模型等活性筛选体系进行活性评价，发现该化合物对小鼠巨噬细胞系RAW 264.7有一定的保护作用，可以显著抑制PGE₂的释放，显示出较强的抗炎作用。

Description

一种生物碱类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种新化合物及其制备方法和应用。

背景技术

毛茛科的升麻族(Tribe Cimicifugeae)包含5属：铁破锣属、黄三七属、疏花升麻属、升麻属和类叶升麻属。升麻属(Cimicifuga)是升麻族中最大的属，全世界约有28种，中国约有9种，广泛分布于北部温带地区。升麻是我国著名的传统中药，最早见于《神农本草经》。在《神农本草经》、《本草纲目》、《中医药大辞典》中，均言“升麻主升”之性，而根据升麻的性味及主治，其亦有“主清主降”的作用。

2015版《中国药典》一部收录升麻(Cimicifuga foetida)、兴安升麻(Cimicifugadahurica)、大三叶升麻(Cmicifuga heracleifolia)的干燥根茎为药材升麻。升麻味辛、微甘，微寒，具有发表透疹、清热解毒、升举阳气之功效；主治风热头痛、齿痛、口疮、咽喉肿痛、麻疹不透、阳毒发斑、脱肛、子宫脱垂。升麻属植物的主要化学成分包括三萜皂苷类，苯丙素类，色原酮类以及其他类化合物。

迄今为止，从升麻属植物中分离鉴定出约450个化合物。现代药理学研究表明，升麻属植物的药理活性包括抗肿瘤、抗氧化、抗骨质疏松及抗血管生成等药理活性，临床上主要用于治疗妇女围绝经期综合征。目前我国上市的升麻现代制剂有希明婷片，其成分为升麻总皂苷，用于治疗围绝经期综合征，改善烘热汗出、烦躁易怒、失眠、胁痛、头晕耳鸣、腰膝酸痛、忧郁寡欢等症状。

升麻属植物的化学成分和药理活性一直是国内外研究热点。迄今，国内外学者对升麻属植物中化学成分的研究主要集中在三萜及其苷类成分上，对其药理活性研究则以抗肿瘤、抗骨质疏松为主。

发明内容

本发明旨在对升麻活性成分进行更深入的研究，发现其活性成分。

有鉴于此，本发明提出了一种生物碱类化合物或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体、立体异构体、前药分子、代谢物，该化合物具有如下结构，该化合物结构如式I所示：

本发明的另一目的在于提供一种上述化合物的制备方法，其特征在于，包括：

A)取升麻，50～70％乙醇回流提取，除去溶剂，得总浸膏；

B)所述总浸膏溶于水，经大孔吸附树脂柱色谱分离，依次以水、25～35％乙醇、90～100％乙醇洗脱，分别收集各洗脱液，减压浓缩，得到水洗脱部位、25～35％乙醇洗脱部位、90～100％乙醇洗脱部位；

C)取所述25～35％乙醇洗脱部位，经硅胶柱色谱分离，用乙酸乙酯-甲醇-水梯度洗脱收集得到2A-2M共13个馏分，馏分2I经ODS柱色谱甲醇-水梯度洗脱得到2I1-2I12共12个馏分，馏分2I5经半制备液相色谱分离得到该化合物。

具体地，所述升麻可以是兴安升麻干燥根茎药材。

进一步地，所述步骤A)为：取升麻，经3-5倍量的50～70％乙醇回流提取1-3次，每次1-3小时，合并提取液，减压除去溶剂，得所述总浸膏。

优选地，所述步骤B)包括依次水、30％乙醇、95％乙醇洗脱，分别收集各洗脱液，减压浓缩至无醇味，得到水洗脱部位、30％乙醇洗脱部位、95％乙醇洗脱部位。

优选地，所述步骤C)的所述乙酸乙酯-甲醇-水梯度洗脱为，用(100:0:0到0:100:0,v/v/v)进行梯度洗脱；所述甲醇-水梯度洗脱为，用(10:90～100:0,v/v)进行梯度洗脱。

具体地，所述大孔吸附树脂包括D101型大孔吸附树脂、HP-20型大孔吸附树脂、HPD-100型大孔吸附树脂、HPD-100A型大孔吸附树脂或HPD-300型大孔吸附树脂的一种或几种。

进一步地，所述半制备液相色谱的条件包括：规格为C18,5μm,10×250mmPhenomenex Gemini柱；体积比例30-40:60-70:0.05-0.5的甲醇-水-甲酸为流动相，检测波长为240-260nm，流速2-4mL/min。

优选地，所述步骤A)为用60％乙醇回流提取2次，每次2小时。所述半制备液相色谱的条件包括：流动相为体积比例35:65:0.1的甲醇-水-甲酸，检测波长为254nm，流速3mL/min。

本发明的再一目的在于提供上述化合物或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体、立体异构体、前药分子、代谢物在制备抗炎药物中的应用。

本发明还提出了一种用于治疗炎症的药物，其包括式(I)所示化合物或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体、立体异构体、前药分子、代谢物。

进一步地，所述药物含有治疗有效量的上述式(I)化合物或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、互变异构体、立体异构体、前药分子、代谢物以及一种或多种药学上可接受的载体。

具体地，所述药物可以是药剂学上所说的任何一种剂型，包括片剂、胶囊剂、软胶囊、凝胶剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、静脉乳剂、脂质体注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。

进一步地，所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂和水等，填充剂如淀粉、蔗糖，乳糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠，羟丙纤维素，交联羧甲基纤维素，琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇，十二烷基硫酸钠；吸附载体如高龄土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、微粉硅胶和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。

本发明所述的生物碱类化合物是研究人员在升麻中发现的新化学成分，并且发现此化合物在各批次的升麻中均稳定存在。发明人通过理化性质和现代波谱学手段(MS、¹H-NMR、¹³C-NMR等等)，对上述方法分离得到的化合物进行了结构鉴定，证实其为结构如式(I)所示的新化合物。本发明还运用LPS诱导RAW 264.7细胞炎症模型等活性筛选体系进行活性评价，发现该化合物对小鼠巨噬细胞系RAW 264.7有一定的保护作用，可以显著抑制PGE₂的释放，显示出较强的抗炎作用。具有良好的研究开发前景。

附图说明

图1为本发明化合物的¹H-NMR谱图；

图2为本发明化合物的¹³C-NMR谱图；

图3为本发明化合物的H¹-H¹ COSY谱图；

图4为本发明化合物的HSQC谱图；

图5为本发明化合物的HMBC谱图；

图6为本发明化合物的ROSEY谱图；

图7为本发明化合物的HR-ESI-Q-TOF-MS谱图；

图8为本发明化合物的主要HMBC相关和H¹-H¹ COSY相关。

具体实施方式

以下将结合实验例的内容进行具体描述。

特别需要指出的是，针对本发明所做出的类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

本发明如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1本发明化合物的制备

(1)取兴安升麻干燥根茎，用50％乙醇回流提取2次，每次2小时，合并提取液，减压除去溶剂，得总浸膏。总浸膏溶于水，经HP-20大孔吸附树脂柱色谱分离，依次以水、25％乙醇、90％乙醇洗脱，每个梯度洗脱4个柱体积(下同)，分别收集各洗脱液，减压浓缩至无醇味，得到水洗脱部位、25％乙醇洗脱部位、90％乙醇洗脱部位；

(2)取步骤(1)的25％乙醇洗脱部位，经硅胶柱色谱分离，用乙酸乙酯-甲醇-水梯度洗脱(95:5:0；90:10:0.5；85:15:0；80:20:4；70:30:6to 60:40:8,0:100:0，v/v/v)，收集得到13个馏分(2A-2M)，馏分2I经ODS柱色谱甲醇-水(15:85；40:60；45:44to 100:0,v/v)梯度洗脱得到2I1-2I12共12个馏分，馏分2I5经半制备液相色谱分离结构如式(I)所示的目标产物。

其中，上述步骤(2)所述半制备液相色谱条件为，半制备型色谱柱：PhenomenexGemini(C₁₈,5μm,10×250mm)，半制备型高效液相色谱仪[日本岛津，泵：LC-6AD(SHIMADZU,LIQUID CHROMATOGRAPH)；检测器：SPD-20A(prominence UV/VIS DETECTOR)；工作站：LCsolution)]以体积比例为35:65:0.1的甲醇-水-甲酸为流动相，检测波长为254nm，流速3mL/min，在半制备液相上的保留时间约为14.98min。

实施例2本发明化合物的制备

(1)取兴安升麻干燥根茎，用60％乙醇回流提取2次，每次2小时，合并提取液，减压除去溶剂，得总浸膏。总浸膏溶于水，经HP-20大孔吸附树脂柱色谱分离，依次以水、30％乙醇、95％乙醇洗脱，分别收集各洗脱液，减压浓缩至无醇味，得到水洗脱部位、30％乙醇洗脱部位、95％乙醇洗脱部位；

(2)取步骤(1)的30％乙醇洗脱部位，经硅胶柱色谱分离，用乙酸乙酯-甲醇-水梯度洗脱(100:0:0；95:5:0.5；90:10:0.5；85:15:0；80:20:4；70:30:6to 60:40:8,0:100:0，v/v/v)，收集得到13个馏分(2A-2M)，馏分2I经ODS柱色谱甲醇-水(10:90；40:60；45:44to100:0,v/v)梯度洗脱得到2I1-2I12共12个馏分，馏分2I5经半制备液相色谱分离结构如式(I)所示的目标产物。

其中，上述步骤(2)所述半制备液相色谱条件为，半制备型色谱柱：PhenomenexGemini(C₁₈,5μm,10×250mm)，半制备型高效液相色谱仪[日本岛津，泵：LC-6AD(SHIMADZU,LIQUID CHROMATOGRAPH)；检测器：SPD-20A(prominence UV/VIS DETECTOR)；工作站：LCsolution)]，以体积比35:65:0.1的甲醇-水-甲酸为流动相，检测波长为254nm，流速3mL/min，在半制备液相上的保留时间约为14.98min。

实施例3本发明化合物的制备

(1)取兴安升麻干燥根茎，用70％乙醇回流提取2次，每次2小时，合并提取液，减压除去溶剂，得总浸膏。总浸膏溶于水，经HP-20大孔吸附树脂柱色谱分离，依次以水、35％乙醇、100％乙醇洗脱，分别收集各洗脱液，减压浓缩至无醇味，得到水洗脱部位、35％乙醇洗脱部位、100％乙醇洗脱部位；

(2)取步骤(1)的35％乙醇洗脱部位，经硅胶柱色谱分离，用乙酸乙酯-甲醇-水梯度洗脱(90:10:0；80:20:0；75:25:0；70:30:4to 60:40:8,v/v/v)，收集得到13个馏分(2A-2M)，馏分2I经ODS柱色谱甲醇-水(20:80；50:50；55:45to 100:0,v/v)梯度洗脱得到2I1-2I12共12个馏分，馏分2I5经半制备液相色谱分离结构如式(I)所示的目标产物。

其中，上述步骤(2)所述半制备液相色谱条件为，半制备型色谱柱：PhenomenexGemini(C₁₈,5μm,10×250mm)，半制备型高效液相色谱仪[日本岛津，泵：LC-6AD(SHIMADZU,LIQUID CHROMATOGRAPH)；检测器：SPD-20A(prominence UV/VIS DETECTOR)；工作站：LCsolution)]，以体积比35:65:0.1的甲醇-水-甲酸为流动相，检测波长为254nm，流速3mL/min，在半制备液相上的保留时间约为14.98min。

实施例4本发明化合物的结构鉴定

本发明化合物为白色粉末。HR-ESI-MS(positive)给出m/z 414.1156[M+Na]⁺(计算值为414.1165)，确定分子式为C₁₉H₂₁NO₈Na，计算不饱和度为10。通过对实施例1得到的产物进行了结构鉴定，如图1-图8，图1为本发明化合物的¹H-NMR谱图；图2为本发明化合物的¹³C-NMR谱图；图3为本发明化合物的H¹-H¹ COSY谱图；图4为本发明化合物的HSQC谱图；图5为本发明化合物的HMBC谱图；图6为本发明化合物的ROSEY谱图；图7HR-ESI-Q-TOF-MS谱图；图8为为本发明化合物的主要HMBC相关和H¹-H¹ COSY相关。

化合物的¹H-NMR(400MHz,in CD₃OD)谱，显示一组1,2,-二取代的苯环氢信号[δ_H7.76(1H,d,J＝7.6Hz,H-4)；7.13(1H,t,J＝7.4Hz,H-5)；7.33(1H,t,J＝7.8Hz,H-6)；7.29(1H,d,J＝8.0Hz,H-7)]，一个糖端基氢信号[δ_H 5.43(1H,d,J＝9.4Hz)]，以及两个烯烃质子信号[δ_H 7.59(1H,d,J＝12.8Hz,H-10),8.05(1H,d,J＝12.8Hz,H-11)]。¹³C-NMR(100MHz,in CD₃OD)谱结合DEPT135图谱，共显示19个碳信号。另，化合物两个双键的相对构型是通过H-11/H-4和H₃-14/H-10的ROSEY相关确定的。

通过观察化合物的¹H和¹³C-NMR数据和文献报告，综合NMR图谱信息，对化合物的碳氢信号进行了归属。本发明化合物为一个新化合物，命名为3E,11E-(3-methyl-2-butenylidene acid)-2-indolinone-1-O-β-D-glucopyranoside。其它实施例经鉴定亦为同种化合物。

表1本发明化合物的核磁数据(氘代甲醇,¹H-NMR 600MHz,¹³C-NMR 150MHz)

实施例5本发明化合物体外抗PGE₂实验

1.材料

1.1药物结构式I所示化合物；

1.2细胞模型小鼠巨噬细胞系RAW 264.7，来源于中医科学院；培养条件：DMEM+10％胎牛血清(FBS)，37℃，5％CO₂。

2.原理和方法

2.1实验原理

革兰阴性菌外膜的脂多糖(LPS)(美国Sigma公司，批号：114M4009)是介导感染性炎症损伤的最主要的病原分子之一，许多疾病与LPS诱导的持续亚临床炎症密切相关。在动物和细胞实验中，LPS被广泛用来诱导炎症的发生。

巨噬细胞在炎症反应中起着至关重要的作用，被刺激后，巨噬细胞产生大量的炎症因子和炎症介质，如：TNF-α,IL-1β,IL-6,NO和PGE₂等。这些炎症因子和介质激活是炎症的关键过程，对它们的抑制作用常常作为评价药物抗炎活性的重要指标。

2.2药物对分泌PGE₂的抑制试验

方法步骤：

(1)药液的配制：将本发明的化合物以10％FBS的DMEM培养基溶解，制得2mg/ml的储备液。

(2)实验方法：将细胞以0.25％胰酶(含0.02％EDTA)消化，含10％FBS的DMEM培养基调整细胞密度为1×10⁵个/ml，均匀接种至24孔板，每孔400μl，种板后放入培养箱培养24小时。

空白对照组(N组)：每孔加入495μl无血清的DMEM培养基；

溶媒组/溶剂对照组(RM组)：每孔加入495μl含千分之一DMSO的无血清DMEM培养基；

模型组(M组)：每孔加入495μl 100μg/ml的LPS；

给药样品组：每孔加495μl含不同浓度含药的培养基；

同时设6个复孔，加药完毕后将24孔板放入CO₂细胞培养箱培养1小时。1小时后，除空白对照和溶剂对照组外，其余每孔加入5μl的100μg/ml的LPS(终浓度为1μg/ml)，溶剂对照组和空白对照组每孔加入5μl的无血清的DMEM培养基，加药完毕后将24孔板放入CO₂细胞培养箱继续培养18小时。

18小时后收集细胞培养液，按试剂盒说明，用ELISA法检测细胞上清中PGE₂的含量。

PGE₂抑制率(％)＝(模型组PGE₂的平均含量-样品组PGE₂的平均含量)/(模型组PGE₂的平均含量-溶剂组PGE₂的平均含量)×100％。

3.实验结果

3.1药物样品对小鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞上清PGE₂的影响

结果表明，药物样品可以显著抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7PGE₂的分泌，显示出较强的抗炎作用。数据结果如表2。

表2化合物(I)各浓度对小鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞上清PGE₂的影响

本发明采用Graphad prism 7.00分析软件，通过线性回归分析方法测的发明中的化合物体外抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7分泌炎性介质PGE₂的平均IC₅₀为22.23μM。

4.结论

本发明化合物对LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7分泌炎性介质PGE₂有显著的抑制作用，显示出较强的抗炎作用，且随着药物浓度的上升，对PGE₂分泌的抑制作用也增加，其IC₅₀为22.23μM。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种生物碱类化合物或者其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体，该化合物结构如式I所示：

2.一种如权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，包括：

A)取升麻，50～70％乙醇回流提取，除去溶剂，得总浸膏；

B)所述总浸膏溶于水，经大孔吸附树脂柱色谱分离，依次以水、25～35％乙醇、90～100％乙醇洗脱，分别收集各洗脱液，减压浓缩，得到水洗脱部位、25～35％乙醇洗脱部位、90～100％乙醇洗脱部位；

C)取所述25～35％乙醇洗脱部位，经硅胶柱色谱分离，用乙酸乙酯-甲醇-水梯度洗脱收集得到2A-2M共13个馏分，馏分2I经ODS柱色谱甲醇-水梯度洗脱得到2I1-2I12共12个馏分，馏分2I5经半制备液相色谱分离得到该化合物。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A)为：

取升麻，经3-5倍量的50～70％乙醇回流提取1-3次，每次1-3小时，合并提取液，减压除去溶剂，得所述总浸膏。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤B)包括依次水、30％乙醇、95％乙醇洗脱，分别收集各洗脱液，减压浓缩至无醇味，得到水洗脱部位、30％乙醇洗脱部位、95％乙醇洗脱部位。

5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤C)的所述乙酸乙酯-甲醇-水梯度洗脱为，以100:0:0到0:100:0体积比进行梯度洗脱；所述甲醇-水梯度洗脱为，以10:90到100:0体积比进行梯度洗脱。

6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂包括D101型大孔吸附树脂、HP-20型大孔吸附树脂、HPD-100型大孔吸附树脂、HPD-100A型大孔吸附树脂或HPD-300型大孔吸附树脂的一种或几种。

7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述半制备液相色谱的条件包括：规格为C18,5μm,10×250mm Phenomenex Gemini柱；流动相为体积比例30-40:60-70:0.05-0.5的甲醇-水-甲酸，检测波长为240-260nm，流速2-4mL/min。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤A)为用60％乙醇回流提取2次，每次2小时；

所述半制备液相色谱的条件包括：流动相为体积比例35:65:0.1的甲醇-水-甲酸，检测波长为254nm，流速3mL/min。

9.如权利要求1所述的化合物或者其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体在制备抗炎药物中的应用。

10.包括权利要求1所述的化合物或者其药学上可接受的盐、互变异构体、立体异构体的药物。

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