CN111303225A - 一种环烯醚萜苷类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种环烯醚萜苷类化合物，其是在山银花中发现的新化学成分。本发明还通过理化性质和现代波谱学手段，对上述方法分离得到的化合物进行了结构鉴定。本发明还运用LPS诱导RAW 264.7细胞炎症模型等活性筛选体系进行活性评价，发现该化合物对小鼠巨噬细胞系RAW 264.7有一定的保护作用，可以显著抑制IL‑6，显示出较强的抗炎作用。

Description

一种环烯醚萜苷类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种新化合物及其制备方法和应用。
背景技术
中药山银花Lonicerae Flos为忍冬科(Caprifoliaceae)忍冬属(Lonicera)植物灰毡毛忍冬Lonicera macranthoides Hand.-Mazz.、红腺忍冬Lonicera hypoglaucaMiq.、华南忍冬Lonicera confusa D C.、黄褐毛忍冬Lonicera fulvotomentosa Hsu etS.C.Cheng的干燥花蕾或带初开的花，是重要的药用资源。具有清热解毒，疏散风热作用，临床用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热。
临床治疗中抗炎药物是仅次于抗感染药物的第二大类药物,其中包括甾体类抗炎药物(SAID)与非甾体类抗炎药物(NSAID)。但是由于许多合成药物有较强的毒副反应，人们愈来愈重视从天然药物中开发抗炎药物。
发明内容
本发明旨在对山银花活性成分进行更深入的研究，发现其发挥某些作用的活性成分。
有鉴于此，本发明提出了一种环烯醚萜苷类化合物，其结构如式I所示：
Figure BDA0001900275660000021
本发明的另一目的在于提供一种上述化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：取山银花，用50-80％乙醇提取后，除去溶剂，得总浸膏；
步骤2：所述总浸膏溶于水，经大孔吸附树脂柱色谱分离，依次以水、25～35％乙醇、45～55％乙醇、90～100％乙醇洗脱，分别收集各洗脱液，减压浓缩至无醇味，得到水洗脱部位、25～35％乙醇洗脱部位、45～55％乙醇洗脱部位、90～100％乙醇洗脱部位；
步骤3：取所述45～55％乙醇洗脱部位，经硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇-水梯度洗脱(95:5:0到60:40:8,v/v/v)，收集得到A-P共16个馏分，馏分F经SiO2柱色谱二氯甲烷-甲醇-水(60-90:10-30:1-3,v/v/v)等度洗脱得到F1-F3共3个馏分，馏分F1经ODS柱色谱分离，用甲醇-水梯度洗脱(30:70到100:0,v/v)，得到F1A-F1G共7个馏分，馏分F1G经半制备液相色谱分离，即得。
进一步地，所述步骤1为：取山银花干燥药材，用50-80％乙醇回流提取1-3次，每次1-3小时，合并提取液，减压除去溶剂，得所述总浸膏。
优选地，所述步骤2的梯度洗脱为依次以水、25～35％、45～55％、90～100％不同浓度的乙醇水溶液进行梯度洗脱。
优选地，所述步骤3的所述氯仿-甲醇-水梯度洗脱为，用(95:5:0；90:10:0；85:15:0；80:20:4；70:30:6；60:40:8,v/v/v)进行梯度洗脱。所述二氯甲烷-甲醇-水等度洗脱优选为，用用(80:20:2,v/v/v)进行等度洗脱。所述甲醇-水梯度洗脱优选为，用(30:70；50:50；70:30；90:10；100:0,v/v)进行梯度洗脱。
具体地，所述大孔吸附树脂选自D101型大孔吸附树脂、HP-20型大孔吸附树脂、HPD-100型大孔吸附树脂、HPD-100A型大孔吸附树脂或HPD-300型大孔吸附树脂。
进一步地，所述半制备液相色谱的条件为：体积比例60-80:10-30:0.05-0.5的乙腈-水-甲酸为流动相，检测波长为240-260nm，流速1-5mL/min。
优选地，所述步骤1为用70％乙醇回流提取2次，每次2小时。所述半制备液相色谱的条件优选为：体积比例75:25:0.1的乙腈-水-甲酸为流动相，检测波长为254nm，流速4mL/min，保留时间为25.0min。
本发明的再一目的在于提供上述化合物在制备抗炎药物中的应用。本发明化合物对LPS诱导RAW 264.7细胞产生IL-6有显著的抑制作用。
本发明还提出了一种用于治疗炎症的药物，其包括式(I)所示化合物。所述的抗炎药是指用于治疗或预防组织受到损伤后等等所发生炎症反应的药物。
进一步地，所述药物含有治疗有效量的上述式(I)化合物以及一种或多种药学上可接受的载体。
具体地，所述药物可以是药剂学上所说的任何一种剂型，包括片剂、胶囊剂、软胶囊、凝胶剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、静脉乳剂、脂质体注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。
进一步地，所述药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，例如：稀释剂、赋形剂和水等，填充剂如淀粉、蔗糖，乳糖、微晶纤维素等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；润湿剂如甘油；崩解剂如羧甲基淀粉钠，羟丙纤维素，交联羧甲基纤维素，琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂如季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇，十二烷基硫酸钠；吸附载体如高龄土和皂粘土；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、微粉硅胶和聚乙二醇等。另外还可以在组合物中加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
本发明所述的环烯醚萜苷类化合物是研究人员在山银花中发现的新化学成分，并且发现此化合物在各批次的山银花中均稳定存在。发明人通过理化性质和现代波谱学手段(CD、MS、1H-NMR、13C-NMR和2D-NMR)，对上述方法分离得到的化合物进行了结构鉴定，证实其为结构如式(I)所示的新化合物。本发明还运用LPS诱导RAW 264.7细胞炎症模型等活性筛选体系进行活性评价，发现该化合物对小鼠巨噬细胞系RAW 264.7有一定的保护作用，可以显著抑制IL-6，显示出较强的抗炎作用。具有良好的研究开发前景。
附图说明
图1为本发明化合物的1H-NMR谱HR-ESI-Q-TOF-MS；
图2为本发明化合物的13C-NMR谱；
图3为本发明化合物的DEPT-135谱；
图4为本发明化合物的H1-H1COSY谱；
图5为本发明化合物的HSQC谱
图6为本发明化合物的HMBC谱；
图7为本发明化合物的ROSEY谱；
图8为本发明化合物的HR-ESI-Q-TOF-MS；
图9为本发明化合物的UV图谱；
图10为本发明化合物的IR图谱；
图11为本发明化合物的CD谱；
图12为本发明化合物的主要HMBC相关和H1-H1COSY相关。
具体实施方式
以下将结合实验例的内容进行具体描述。
特别需要指出的是，针对本发明所做出的类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
本发明如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1本发明化合物的制备
(1)取山银花干燥药材，用70％乙醇回流提取2次，每次2小时，合并提取液，减压除去溶剂，得总浸膏。总浸膏溶于水，经HP-20大孔吸附树脂柱色谱分离，依次以水、25％乙醇、45％乙醇、90％乙醇洗脱，分别收集各洗脱液，减压浓缩至无醇味，得到水洗脱部位、25％乙醇洗脱部位、45％乙醇洗脱部位、90％乙醇洗脱部位；
(2)取步骤(1)的45％乙醇洗脱部位，经硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇-水梯度洗脱(100:0:0；95:5:0；90:10:0；85:15:4；75:25:6to 60:40:8,v/v/v)，收集得到16个馏分(A-P)，馏分F经SiO2柱色谱二氯甲烷-甲醇-水(85:15:2,v/v/v)等度洗脱得到3个馏分(F1-3)，F1经ODS柱色谱分离，用甲醇-水梯度洗脱(20:80；45:55；65:35；80:20to 95:5,v/v)，得到7个馏分(F1A-G)，馏分F1G经半制备液相色谱分离，得到结构如式(I)所示的目标产物环烯醚萜苷类化合物。
其中，上述步骤(2)所述半制备液相色谱条件为，以体积比例为75:25:0.1的乙腈-水-甲酸为流动相，检测波长为254nm，流速4mL/min，在半制备液相上的保留时间约为25.0min。
实施例2本发明化合物的制备
(1)取山银花干燥药材，用70％乙醇回流提取2次，每次2小时，合并提取液，减压除去溶剂，得总浸膏。总浸膏溶于水，经HP-20大孔吸附树脂柱色谱分离，依次以水、30％乙醇、50％乙醇、95％乙醇洗脱，分别收集各洗脱液，减压浓缩至无醇味，得到水洗脱部位、30％乙醇洗脱部位、50％乙醇洗脱部位、95％乙醇洗脱部位；
(2)取步骤(1)的50％乙醇洗脱部位，经硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇-水梯度洗脱(95:5:0；90:10:0；85:15:0；80:20:4；70:30:6to 60:40:8,v/v/v)，收集得到16个馏分(A-P)，馏分F经SiO2柱色谱二氯甲烷-甲醇-水(80:20:2,v/v/v)等度洗脱得到3个馏分(F1-3)，F1经ODS柱色谱分离，用甲醇-水梯度洗脱(30:70；50:50；70:30；90:10to 100:0,v/v)，得到7个馏分(F1A-G)，馏分F1G经半制备液相色谱分离，得到结构如式(I)所示的目标产物环烯醚萜苷类化合物。
其中，上述步骤(2)所述半制备液相色谱条件为，以体积比例为75:25:0.1的乙腈-水-甲酸为流动相，检测波长为254nm，流速4mL/min，在半制备液相上的保留时间约为25.0min。
实施例3本发明化合物的制备
(1)取山银花干燥药材，用70％乙醇回流提取2次，每次2小时，合并提取液，减压除去溶剂，得总浸膏。总浸膏溶于水，经HP-20大孔吸附树脂柱色谱分离，依次以水、35％乙醇、55％乙醇、100％乙醇洗脱，分别收集各洗脱液，减压浓缩至无醇味，得到水洗脱部位、35％乙醇洗脱部位、55％乙醇洗脱部位、100％乙醇洗脱部位；
(2)取步骤(1)的50％乙醇洗脱部位，经硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇-水梯度洗脱(90:10:0；80:20:0；75:25:0；70:30:4to 60:40:8,v/v/v)，收集得到16个馏分(A-P)，馏分F经SiO2柱色谱二氯甲烷-甲醇-水(75:15:2,v/v/v)等度洗脱得到3个馏分(F1-3)，F1经ODS柱色谱分离，用甲醇-水梯度洗脱(25:75；35:65；70:30；80:120to 95:5,v/v)，得到7个馏分(F1A-G)，馏分F1G经半制备液相色谱分离，得到结构如式(I)所示的目标产物环烯醚萜苷类化合物。
其中，上述步骤(2)所述半制备液相色谱条件为，以体积比例为75:25:0.1的乙腈-水-甲酸为流动相，检测波长为254nm，流速4mL/min，在半制备液相上的保留时间约为25.0min。
实施例4本发明化合物的结构鉴定
本发明实施例1的化合物为浅黄色胶状固体。[α]29D-140.5(c 0.6,CH3OH),UV(CH3OH)λmax(logε):204(4.4),230(4.2),IR(KBr)νmax:3400,2911,2343,1718,1633,1510,1439,1070cm-1。HR-ESI-MS给出m/z 761.2623[M+Na]+(计算值为761.2633)，确定化合物分子式为C35H46O17，计算不饱和度为13。通过对实施例1得到的固体进行了结构鉴定，如图1-图12，图1为本发明化合物的1H-NMR谱HR-ESI-Q-TOF-MS；图2为本发明化合物的13C-NMR谱；图3为本发明化合物的DEPT-135谱；图4为本发明化合物的H1-H1COSY谱；图5为本发明化合物的HSQC谱；图6为本发明化合物的HMBC谱；图7为本发明化合物的ROSEY谱；图8为本发明化合物的HR-ESI-Q-TOF-MS；图9为本发明化合物的UV图谱；图10为本发明化合物的IR图谱；图11为本发明化合物的CD谱；图12为本发明化合物的主要HMBC相关和H1-H1COSY相关。
化合物的1H-NMR(600MHz,in CD3OD)图谱，低场区可见一组1,2,4-三取代苯环氢信号[δH 7.01(1H,d,J＝8.2Hz),6.84(1H,d,J＝2.0Hz),6.73(1H,dd,J＝8.3,2.0Hz),]，两组单取代末端双键氢信号[δH 5.21(1H,dt,J＝17.2,1.7Hz),5.17(1H,dd,J＝10.5,1.7Hz,5.69(1H,ddt,J＝17.2,10.5,8.5Hz)；δH5.07(1H,dq,J＝17.0,1.7Hz),5.03(1H,dq,J＝10.1,1.7Hz),5.96(1H,ddt,J＝17.0,10.1,6.7Hz)]和两个糖端基质子信号[δH4.71(1H,d,J＝7.9Hz,H-1″),4.82(1H,d,J＝7.5Hz,H-1″″)]。此外，1H-NMR低场区可见典型环烯醚萜类化合物的3位质子信号[δH 7.53(1H,s,H-3)]和1位半缩醛的质子信号[δH 5.48(1H,d,J＝8.1Hz,H-1)]。结合紫外吸收特征，判断该化合物可能为环烯醚萜苷类化合物。
1H-1H COSY谱中，H1/H-9/H-5/H-6/H-7/H-1′和H-9/H-8/H-10存在明显相关；进一步结合HMBC谱中相关峰H-1/C-3,5,8，H-3/C-1,4,5,11，OCH3(δH 3.65)/C-11以及H-7，H-1′与C-2′的远程相关，推断出结构片段A。HMBC谱中存在远程相关峰H-1″(δH 4.71)/C-1(δC97.5)和H-1(δH 5.48)/C-1″(δC100.3)，提示C-1处连接有1个葡萄糖基。
1H-1H COSY谱中，H-5″′/H-6″′/H-2″′存在明显相关，提示存在1,2,4-三取代苯环；相关峰H-7″′/H-8″′/H-9″′提示结构中含有一个烯丙基片段。HMBC谱中，存在相关峰H-8″′/C-1″′(δC 136.7)，H-2″′/C-7″′(δC 40.8)和H-6″′/C-7″′(δC40.8)，提示烯丙基连接在1,2,4-三取代苯环的C-1″′上；结合相关峰H-6″′/C-4″′(δC 146.1)，OCH3(δH3.85)和C-3″′(δC151.0)的远程相关，可推断出具有C6-C3结构的片段B。此外，远程相关峰H-1″″(δH4.82)/C-4″′(δC 146.1)提示结构片段B的C-4″′连接在另一个葡萄糖基的1位。
HMBC的相关峰H-6″″[δH 4.39(1H,dd,J＝11.9,2.2Hz),4.25(1H,dd,J＝11.8,6.7Hz)]/C-2′(δC 173.2)提示一个葡萄糖基的6位羟基被结构片段A酰化，所以推测结构片段B(C-4″′)和A(C-2′)分别连接在同一个葡萄糖基的1位和6位。
综合NMR图谱信息，对化合物的碳氢信号进行了归属。经SciFinder Scholar网络检索，未见相关报道，表明化合物为一个新化合物，命名为loniceranan D。经同样方法鉴定，本发明实施例2和实施例3所得化合物和实施例1相同。
表1化合物的核磁数据(氘代甲醇,1H-NMR 600MHz,13C-NMR 150MHz)
Figure BDA0001900275660000081
Figure BDA0001900275660000091
实施例3式Ⅰ所示结构的化合物体外抗IL-6实验
1.材料
1.1药物结构式I所示化合物；
1.2细胞模型小鼠巨噬细胞系RAW 264.7，来源于中医科学院，由委托方江苏康缘药业股份有限公司提供；培养条件：DMEM+10％胎牛血清(FBS)，37℃，5％CO2。
2.原理和方法
2.1实验原理
革兰阴性菌外膜的脂多糖(LPS)(美国Sigma公司，批号：114M4009)是介导感染性炎症损伤的最主要的病原分子之一，许多疾病与LPS诱导的持续亚临床炎症密切相关。在动物和细胞实验中，LPS被广泛用来诱导炎症的发生。
巨噬细胞在炎症反应中起着至关重要的作用，被刺激后，巨噬细胞产生大量的炎症因子和炎症介质，如：TNF-α,IL-1β,IL-6,NO和PGE2等。这些炎症因子和介质激活是炎症的关键过程，对它们的抑制作用常常作为评价药物抗炎活性的重要指标。
2.2药物对分泌IL-6的抑制试验
方法步骤：
(1)药液的配制：将药物以10％FBS的DMEM培养基溶解，制得2mg/ml的储备液。
(2)实验方法：将细胞以0.25％胰酶(含0.02％EDTA)消化，含10％FBS的DMEM培养基调整细胞密度为1×105个/ml，均匀接种至24孔板，每孔400μl，种板后放入培养箱培养24小时。
空白对照组(N组)：每孔加入495μl无血清的DMEM培养基；
溶媒组/溶剂对照组(RM组)：每孔加入495μl含千分之一DMSO的无血清DMEM培养基；
模型组(M组)：每孔加入495μl 100μg/ml的LPS；
给药样品组：每孔加495μl含不同浓度含药的培养基；
同时设6个复孔，加药完毕后将24孔板放入CO2细胞培养箱培养1小时。1小时后，除空白对照和溶剂对照组外，其余每孔加入5μl的100μg/ml的LPS(终浓度为1μg/ml)，溶剂对照组每孔加入5μl的无血清的DMEM培养基，加药完毕后将24孔板放入CO2细胞培养箱继续培养18小时。
18小时后收集细胞培养液，按试剂盒说明，用ELISA法检测细胞上清中IL-6的含量。
IL-6抑制率(％)＝(模型组IL-6的平均含量-样品组IL-6的平均含量)/(模型组IL-6的平均含量-溶剂组IL-6的平均含量)×100％。
3.实验结果
3.1药物样品对小鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞上清IL-6的影响
结果表明，药物样品可以显著抑制LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7IL-6的分泌，显示出较强的抗炎作用。数据结果如表2。
表2化合物(I)各浓度对小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞上清IL-6的影响
Figure BDA0001900275660000101
Figure BDA0001900275660000111
本发明的化合物在最低浓度6.25μM浓度下的抑制率大于50％，其计算出的IC50值不准确，建议降低浓度进行IC50检测。数据结果如表3。
表3化合物(I)降低各浓度对小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞上清IL-6的影响
Figure BDA0001900275660000112
Figure BDA0001900275660000113
4.结论
本发明化合物对LPS诱导小鼠巨噬细胞RAW 264.7分泌炎性介质IL-6有显著的抑制作用，显示出较强的抗炎作用，且随着药物浓度的上升，对IL-6分泌的抑制作用也增加，其IC50为6.33μM。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种环烯醚萜苷类化合物，其结构如式I所示：
Figure FDA0001900275650000011
。
2.一种如权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：取山银花，用50-80％乙醇提取后，除去溶剂，得总浸膏；
步骤2：所述总浸膏溶于水，经大孔吸附树脂柱色谱分离，依次以水、25～35％乙醇、45～55％乙醇、90～100％乙醇洗脱，分别收集各洗脱液，减压浓缩至无醇味，得到水洗脱部位、25～35％乙醇洗脱部位、45～55％乙醇洗脱部位、90～100％乙醇洗脱部位；
步骤3：取所述45～55％乙醇洗脱部位，经硅胶柱色谱分离，用氯仿-甲醇-水梯度洗脱(95:5:0到60:40:8,v/v/v)，收集得到A-P共16个馏分，馏分F经SiO2柱色谱二氯甲烷-甲醇-水(60-90:10-30:1-3,v/v/v)等度洗脱得到F1-F3共3个馏分，馏分F1经ODS柱色谱分离，用甲醇-水梯度洗脱(30:70到100:0,v/v)，得到F1A-F1G共7个馏分，馏分F1G经半制备液相色谱分离，即得。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1为取山银花干燥药材，用50-80％乙醇回流提取1-3次，每次1-3小时，合并提取液，减压除去溶剂，得所述总浸膏。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤2的梯度洗脱为依次以水、25～35％、45～55％、90～100％不同浓度的乙醇水溶液进行梯度洗脱。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤3的所述氯仿-甲醇-水梯度洗脱为，用(95:5:0；90:10:0；85:15:0；80:20:4；70:30:6；60:40:8,v/v/v)进行梯度洗脱；所述二氯甲烷-甲醇-水等度洗脱为，用(80:20:2,v/v/v)进行等度洗脱；所述甲醇-水梯度洗脱为，用(30:70；50:50；70:30；90:10；100:0,v/v)进行梯度洗脱。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂选自D101型大孔吸附树脂、HP-20型大孔吸附树脂、HPD-100型大孔吸附树脂、HPD-100A型大孔吸附树脂或HPD-300型大孔吸附树脂。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述半制备液相色谱的条件为：体积比例60-80:10-30:0.05-0.5的乙腈-水-甲酸为流动相，检测波长为240-260nm，流速1-5mL/min。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1为用70％乙醇回流提取2次，每次2小时；所述半制备液相色谱的条件为：体积比例75:25:0.1的乙腈-水-甲酸为流动相，检测波长为254nm，流速4mL/min，保留时间为25.0min。
9.如权利要求1所述化合物在制备抗炎药物中的应用。
10.包括权利要求1所述化合物的药物。
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