CN113735923A - 二聚体环烯醚萜苷及其制备方法与用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种下式I的二聚体环烯醚萜苷类化合物或其药学上可接受的盐、酯、外消旋体、R‑异构体、S‑异构体、同位素标记物、溶剂化物、代谢产物或前药，其制备工艺简单、重现性好、纯度高，具有较好的抗炎活性。

Description

二聚体环烯醚萜苷及其制备方法与用途

技术领域

本发明涉及中药化学领域，涉及二聚体环烯醚萜苷类化合物及其制备方法，本发明还涉及二聚体环烯醚萜苷类化合物在治疗炎性疾病、病症和/或损伤方面的用途。

背景技术

炎症反应是在身体受到感染因子侵袭、抗原攻击或者物理、化学或外伤损害后恢复和维持稳态的努力。局部性炎症限于特定部位，可表现出不同的症状，包括发红、肿胀、发热和疼痛。炎症通常是生物体清除有害刺激和引发组织愈合过程的保护性尝试。但是，未充分控制的炎症可以导致多种疾病，不论受试者的年龄如何。

目前临床上常用的抗炎药主要是非甾体类抗炎药(NSAIDs)，其通过阻断环氧化酶-2(COX-2)的作用来减少炎症，但是于此同时这种药物还同时阻断了COX-1的作用。COX-1的主要作用就是保护胃粘膜，因此COX-1的作用阻断就会产生胃部刺激性。因此，NSAIDs具有解热、镇痛、消炎、抗风湿等作用，但其副作用主要在胃肠道，其次是肝肾，且易产生耐药性，易成瘾，以及具有免疫抑制副作用等。近年对抗炎药物的探索研究中，中药已越来越凸显其药效好、无成瘾性、不良反应少等优势，引起人们的重视。

金银花的传统功效为清热解毒，主治热毒血痢，痈肿疔疮，喉痹，多种感染性疾病等。现代药理学研究显示，金银花抗炎活性突出，但研究常以金银花中的酚酸和黄酮类成分为主展开研究，对于金银花中二聚体环烯醚萜苷类成分的抗炎活性研究报道较少。

本发明通过研究发现金银花中一类具有全新化学结构的二聚体环烯醚萜苷类化合物具有较好的抗炎作用，可能在制备预防或/和治疗炎性疾病和病症中具有广阔前景。金银花中的二聚体环烯醚萜苷类化合物本身药理活性广泛，来自于天然植物，安全可靠，目前未见本发明所涉及的二聚体环烯醚萜苷类化合物用于治疗或/和预防炎性疾病和病症的相关报道。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种疗效确切、不良反应少、天然安全的治疗炎性疾病和病症的药物，以解决现有技术中的常见的药物胃肠道反应明显、易产生耐药性、易成瘾，以及具有免疫抑制副作用的问题。

为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种下式I的二聚体环烯醚萜苷类化合物或其药学上可接受的盐、酯、外消旋体、R-异构体、S-异构体、同位素标记物、溶剂化物、代谢产物或前药，

其中6″,7双键构型为Z式或E式，R₁和R₂是相同的或不同的且各自独立地选自-COOH、-COOCH₃、-COOC₂H₅、-COOC₃H₇、-COOC₄H₉、-CH₂COOCH₃、-CH₂COOC₂H₅、-CH(CH₃)COOCH₃、-CH(CH₃)COOC₂H₅、-CH₂COOCH₂COCH₃、-OCH₃或-CHO。

进一步地，6″,7双键构型为Z式或E式，R₁和R₂是相同的或不同的且各自独立地选自-COOH、-COOCH₃、-COOC₂H₅、-COOC₃H₇、-COOC₄H₉、-OCH₃或-CHO。

进一步地，6″,7双键构型为Z式或E式，R₁和R₂是相同的或不同的且各自独立地选自-COOH或-COOCH₃。

进一步地，6″,7双键构型为Z式或E式，R₁和R₂是不同的且选自-COOH或-COOCH₃。

进一步地，6″,7双键构型为Z式或E式，R₁是-COOCH₃，R₂是-COOH或R₁是-COOH，R₂是-COOCH₃。

根据本发明的另一方面，提供了一种药物制剂，包含上述二聚体环烯醚萜苷类化合物和药学上可接受的辅料。

进一步地，该药物制剂的剂型是液体剂型或固体剂型。

进一步地，该液体剂型是糖浆剂、注射溶液、悬浮液或乳剂。

进一步地，该固体剂型是片剂、锭剂、胶囊、滴丸、丸剂、颗粒剂、粉剂、霜剂或栓剂。

进一步地，该辅料选自以下中的一种或多种：调味剂、崩解剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、粘合剂、增稠剂和增溶剂。

进一步地，该药物制剂进一步包括一种或多种抗炎药。

进一步地，该抗炎药为非甾体类抗炎药。

进一步地，该非甾体类抗炎药选自以下中的一种或多种：阿司匹林、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、萘普酮、双氯芬酸、布洛芬、尼美舒利、罗非昔布和塞来昔布。

根据本发明的另一方面，提供了一种制备上述二聚体环烯醚萜苷类化合物的方法，其中该方法包括如下步骤：

(1)取适量的金银花药材作为原料，使用40％～95％的乙醇水溶液进行冷浸、渗漉、回流或超声提取，得到提取液；

(2)对该渗漉液进行浓缩，得到浓缩液；

(3)利用大孔吸附树脂分离该浓缩液，洗脱剂依次为水、35％至45％乙醇水溶液，65％至75％乙醇水溶液和约95％乙醇水溶液，收集35％至45％乙醇水溶液的洗脱液经聚酰胺柱层析后得到总环烯醚萜提取物；以及

(4)该总环烯醚萜提取物经过硅胶柱层析和半制备HPLC分离步骤，得到式I的二聚体环烯醚萜苷类化合物。

进一步地，该步骤(1)中的该金银花药材为金银花的栽培品九丰一号；进一步地，该步骤(1)中的该提取的方法为渗漉法；进一步地，该步骤(1)中的该乙醇水溶液的浓度为约50％；进一步地，该步骤(2)中的该浓缩的方法为减压旋蒸法；进一步地，该步骤(3)中的该洗脱剂依次为水、约40％乙醇水溶液，约70％乙醇水溶液和约95％乙醇水溶液；进一步地，该步骤(3)中的该大孔吸附树脂为HPD100大孔吸附树脂。

进一步地，该步骤(4)中的该硅胶柱层析是采用粒度为200至300目的正向硅胶；

进一步地，该步骤(4)中的该硅胶柱层析法采用Flash中压制备法；

进一步地，该Flash中压制备法的洗脱流动相为二氯甲烷-甲醇-水体积比为9:2:0.2的混合溶剂；

进一步地，该半制备HPLC分离步骤的流动相为乙腈-0.1％甲酸水(17∶83)和/或乙腈-0.1％甲酸水(15∶85)。

进一步地，该半制备HPLC分离步骤的检测波长为239nm。

进一步地，该半制备HPLC分离步骤的流速为3mL·min^-1。

根据本发明的另一方面，提供了一种上述二聚体环烯醚萜苷类化合物或上述药物制剂在制备用于治疗和/或预防炎症的药物中的用途。

进一步地，该炎症为一氧化氮介入的炎症反应。

进一步地，该一氧化氮是由巨噬细胞释放的。

进一步地，该一氧化氮是由细菌脂多糖诱导的巨噬细胞释放的。

本发明的有益效果：

我们前期研究比较金银花各栽培品种间的质量，发现金银花的栽培品种九丰一号与其他栽培品种比较，化学成分差异较为明显，不同产地的九丰一号样品中均含有丰富的环烯醚萜苷类成分。为了明确九丰一号中的环烯醚萜苷类成分类型，本研究采用硅胶柱层析和半制备HPLC等手段从九丰一号的总环烯醚萜提取物进行单体化合物的分离和纯化，基于波谱技术进行化合物的结构鉴定，从而丰富金银花化学成分。我们研究发现，从金银花栽培品九丰一号中提取分离得到的一类具有新的化学结构的二聚体环烯醚萜苷类化合物具有明显的抗炎效果，且其制备工艺简单、重现性好、纯度高，将其开发为治疗炎症疾病和病症的药物可以扩大金银花的应用范围，提高金银花植物资源的利用价值。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的附图，而并不超出本申请要求保护的范围。

图1是从金银花栽培品九丰一号中提取分离得到总环烯醚萜提取物的流程图。

图2是从总环烯醚萜提取物分离得到化合物的流程简图。

图3是化合物3的结构式。

图4是化合物4的结构式。

具体实施方式

下面将结合本申请实施例中的附图，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。

本发明有预期地涵盖所有的选择余地、变体和同等物，这些可能如权利要求所定义的那样包含在现有发明领域。所属领域的技术人员将识别许多类似或等同于在此所描述的方法和物质，这些可以应用于本发明的实践中去。本发明绝非限于方法和物质的描述。

本文所述的发明可以包括一个或多个数值范围(例如粒度，浓度等)。将数值范围理解为包括所述范围内的全部值，包括限定所述范围的值，和临近所述范围且产生与限定所述范围边界的值紧邻的值相同或基本上相同结果的值。

在一定程度上，具体实施方式和/或权利要求中使用术语“包含”、“包括(including，includes)”和“具有(having，has，with)”或其变体，这些术语意在包括与术语“包含(comprising)”类似的方式。

正如背景技术部分所描述的，现有的用于治疗炎性疾病和病症的常见的药物胃肠道反应明显、易产生耐药性、易成瘾，以及具有免疫抑制副作用的问题。为了解决上述问题，本发明提供了一种下式I的二聚体环烯醚萜苷类化合物或其药学上可接受的盐、酯、外消旋体、R-异构体、S-异构体、同位素标记物、溶剂化物、代谢产物或前药，

其中6″,7双键构型为Z式或E式，R₁和R₂是相同的或不同的且各自独立地选自-COOH、-COOCH₃、-COOC₂H₅、-COOC₃H₇、-COOC₄H₉、-CH₂COOCH₃、-CH₂COOC₂H₅、-CH(CH₃)COOCH₃、-CH(CH₃)COOC₂H₅、-CH₂COOCH₂COCH₃、-OCH₃或-CHO。

在一种优选的实施方式中，该药学上可接受的盐包括无机酸盐或有机酸盐。

在一种优选的实施方式中，该药学上可接受的盐选自下组：盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、磷酸盐、硝酸盐、硫酸盐、硫酸氢盐、甲酸盐、乙酸盐、己二酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、甲苯磺酸盐、甲磺酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、富马酸盐、葡萄糖酸盐、马来酸盐、草酸盐、水杨酸盐、酒石酸盐，或其组合。

在一种优选的实施方式中，本发明所使用的术语“酯”是指本发明的式I的化合物在体内(in vivo)水解的酯并且包括容易在人体内分解留下母体化合物或其盐的酯。合适的酯基包括例如衍生自药学上可接受的脂肪族羧酸(尤其链烷酸、链烯酸、环链烷酸和链烷二酸)的酯基，其中各烷基或烯基部分宜具有6个以下碳原子。

在一种优选的实施方式中，本发明的式I的化合物具有不对称中心、手性轴和手性平面，并且可以以外消旋体、R-异构体或S-异构体的形式存在。本领域技术人员能够采用常规技术手段由外消旋体拆分获得R-异构体和/或S-异构体。

在一种优选的实施方式中，本发明的同位素标记物为含²H、³H、¹⁰B、¹³C、¹⁴C、¹³N、¹⁵N、¹⁸O、²⁶Mg、³²P、³⁴S、³⁵S、³⁷Cl、⁴¹K、⁴⁵Ca、⁵⁴Fe、⁵⁷Fe和⁶⁵Cu中的至少一种的水溶性化合物。

在一种优选的实施方式中，本发明所使用的术语“溶剂化物”是指一个或多个溶剂分子与本发明的式I的化合物所形成的缔合物。形成溶剂化物的溶剂包括，但并不限于，水，异丙醇，乙醇，甲醇，二甲亚砜，乙酸乙酯，乙酸，氨基乙醇。

在一种优选的实施方式中，本发明所使用的术语“代谢产物”是指具体的式I的化合物或其盐在体内通过代谢作用所得到的产物。一个化合物的代谢产物可以通过所属领域公知的技术来进行鉴定，其活性可以通过如本发明所描述的那样采用试验的方法进行表征。这样的产物可以是通过给药化合物经过氧化，还原，水解，酰氨化，脱酰氨作用，酯化，脱脂作用，酶裂解等等方法得到。相应地，本发明包括化合物的代谢产物，包括将本发明的化合物与哺乳动物充分接触一段时间所产生的代谢产物。

在一种优选的实施方式中，本发明所使用的术语“前药”，代表一个化合物在体内转化为式I所示的化合物。这样的转化受前体药物在血液中水解或在血液或组织中经酶转化为母体结构的影响。本发明前体药物类化合物可以是酯，在现有的发明中酯可以作为前体药物的有苯酯类，脂肪族(C_1-24)酯类，酰氧基甲基酯类，碳酸酯，氨基甲酸酯类和氨基酸酯类。

在一种优选的实施方式中，6″,7双键构型为Z式或E式，R₁和R₂是相同的或不同的且各自独立地选自-COOH、-COOCH₃、-COOC₂H₅、-COOC₃H₇、-COOC₄H₉、-OCH₃或-CHO。

在一种优选的实施方式中，6″,7双键构型为Z式或E式，R₁和R₂是相同的或不同的且各自独立地选自-COOH或-COOCH₃。

在一种优选的实施方式中，6″,7双键构型为Z式或E式，R₁和R₂是不同的且选自-COOH或-COOCH₃。

在一种优选的实施方式中，6″,7双键构型为Z式或E式，R₁是-COOCH₃，R₂是-COOH。

根据本发明的另一方面，提供了一种药物制剂，包含上述二聚体环烯醚萜苷类化合物和药学上可接受的辅料。

在一种优选的实施方式中，该药物制剂的剂型是液体剂型或固体剂型。

在一种优选的实施方式中，该液体剂型是糖浆剂、注射溶液、悬浮液或乳剂。

在一种优选的实施方式中，该固体剂型是片剂、锭剂、胶囊、滴丸、丸剂、颗粒剂、粉剂、霜剂或栓剂。

在一种优选的实施方式中，该辅料选自以下中的一种或多种：调味剂、崩解剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、粘合剂、增稠剂和增溶剂。

其中，调味剂的非限制性实例包括但不限于糖醇，例如山梨糖醇、木糖醇；单糖，包括蔗糖、葡萄糖、果糖和乳糖；山梨糖醇、甘露糖醇、甘油、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇糖浆、异麦芽糖醇、乳糖醇；以及糖的混合物，包括葡萄糖浆；转化糖浆、高含糖量的糖浆；以及麦芽或麦芽提取物；崩解剂可以包括但不限于下述的一种或多种：交联羧甲基纤维素钠、羧甲纤维素钙、交聚维酮、海藻酸、海藻酸钠、海藻酸钾、海藻酸钙、离子交换树脂、基于食品酸和碱性碳酸盐组分的泡腾系统、粘土、滑石、淀粉、预明胶化的淀粉、淀粉羟乙酸钠、纤维素絮状物、羧甲基纤维素、羟基丙基纤维素、硅酸钙、金属碳酸盐、碳酸氢钠、柠檬酸钙和磷酸钙；防腐剂可以是山梨酸钾、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸及其盐、对羟基苯甲酸的其他酯诸如对羟基苯甲酸丁酯，醇类诸如乙醇或苯甲醇，酚类化学物质诸如苯酚，或四价化合物诸如苯扎氯铵；润滑剂的非限制性实例包括但不限于硬脂酸钙、低芥子酸菜籽油、甘油基棕榈酸硬脂酸酯、氢化植物油、泊咯沙姆、聚乙二醇、聚乙烯醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠、硬脂酰基富马酸钠、灭菌的玉米淀粉、滑石粉和硬脂酸锌；湿润剂可以包括但不限于下述的一种或多种：玉米淀粉、马铃薯淀粉、玉米淀粉、和改性淀粉、交联羧甲纤维素钠、交联聚维酮、羟基乙酸淀粉钠和它们的混合物；粘合剂可以包括但不限于下述的一种或多种：多种纤维素、交联的聚乙烯吡咯烷酮和微晶纤维素；增稠剂可以是聚丙烯酸酯和聚丙烯酸酯共聚物树脂，例如聚丙烯酸和聚丙烯酸/甲基丙烯酸树脂；或者纤维素和纤维素衍生物，包括烷基纤维素如甲基-、乙基-、和丙基-纤维素；增溶剂可以包括但不限于下述的一种或多种：乙腈、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-烷基吡咯烷酮、N-羟基烷基吡咯烷酮、N-烷基哌啶酮、维生素E和维生素E衍生物。

在一种优选的实施方式中，该药物制剂进一步包括一种或多种抗炎药。

在一种优选的实施方式中，该抗炎药为非甾体类抗炎药。

在一种优选的实施方式中，该非甾体类抗炎药选自以下中的一种或多种：阿司匹林、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、萘普酮、双氯芬酸、布洛芬、尼美舒利、罗非昔布和塞来昔布。

其中，阿司匹林属于环氧化酶抑制剂，可以阻断前列腺素转换为花生四烯酸，从而能减少炎症介质产生而发挥抗炎作用；对乙酰氨基酚抑制中枢神经系统前列腺素合成的作用与阿司匹林相似，但抗炎作用较弱；吲哚美辛通过对环氧化酶的抑制减少前列腺素的合成来起到抗炎作用。

根据本发明的另一方面，提供了一种制备上述二聚体环烯醚萜苷类化合物的方法，其中该方法包括如下步骤：

(1)取适量的金银花药材作为原料，使用40％～95％的乙醇水溶液进行冷浸、渗漉、回流或超声提取，得到提取液；

(2)对该渗漉液进行浓缩，得到浓缩液；

(3)利用大孔吸附树脂分离该浓缩液，洗脱剂依次为水、35％至45％乙醇水溶液，65％至75％乙醇水溶液和约95％乙醇水溶液，收集35％至45％乙醇水溶液的洗脱液经聚酰胺柱层析后得到总环烯醚萜提取物；以及

(4)该总环烯醚萜提取物经过硅胶柱层析和半制备HPLC分离步骤，得到式I的二聚体环烯醚萜苷类化合物。

在一种优选的实施方式中，该步骤(1)中的该金银花药材为金银花的栽培品九丰一号；在一种优选的实施方式中，该步骤(1)中的该提取的方法为渗漉法；在一种优选的实施方式中，该步骤(1)中的该乙醇水溶液的浓度为约50％。

术语“约”或“大约”是指在本领域技术人员所测定的特定值的可接收的误差范围内，该误差范围部分取决于如何测量或测定所述值，即，测量系统的限制。例如，根据本领域的实践操作，“约”可以是1或高于1的标准偏差范围内。可选地，“约”可指给定值的高达10％，优选地高达5％，以及更优选地高达1％的范围。除非另有说明，在本发明中描述特定值的情况下，可假定术语“约”是指特定值的可接受的误差范围内。

在一种优选的实施方式中，该步骤(2)中的该浓缩的方法为减压旋蒸法；

在一种优选的实施方式中，该步骤(3)中的该洗脱剂依次为水、约40％乙醇水溶液，约70％乙醇水溶液和约95％乙醇水溶液。

在一种优选的实施方式中，该步骤(3)中的该大孔吸附树脂为HPD100大孔吸附树脂。

在一种优选的实施方式中，该步骤(4)中的该硅胶柱层析是采用粒度为200至300目的正向硅胶；

在一种优选的实施方式中，该步骤(4)中的该硅胶柱层析法采用Flash中压制备法；

在一种优选的实施方式中，该Flash中压制备法的洗脱流动相为二氯甲烷-甲醇-水体积比为9:2:0.2的混合溶剂；

在一种优选的实施方式中，该半制备HPLC分离步骤的流动相为乙腈-0.1％甲酸水(17∶83)和/或乙腈-0.1％甲酸水(15∶85)。

在一种优选的实施方式中，该半制备HPLC分离步骤的检测波长为239nm。

在一种优选的实施方式中，该半制备HPLC分离步骤的流速为3mL·min^-1。

该硅胶Flash柱层析步骤的洗脱剂和该半制备HPLC分离步骤的流动相根据实际情况进行选择，可以是不同流动相之间的组合。

根据本发明的另一方面，提供了一种上述二聚体环烯醚萜苷类化合物或上述药物制剂在制备用于治疗和/或预防炎症的药物中的用途。

本发明对于从金银花栽培品九丰一号中提取与分离获得的二聚体环烯醚萜苷类化合物1-5及其类似物在12.5μM～25μM浓度下对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞释放NO抑制率范围为约25％至约75％，且浓度≤100μM时对于RAW264.7细胞不具有细胞毒。

如本文所用，术语“炎症”是指由发炎导致的任何疾病或者其症状包括发炎的那些疾病。举例说明，一种由发炎导致的炎症可以是一种脓毒性休克，同时一种其症状包括发炎的炎症可以是类风湿性关节炎。本发明的炎症包括但不限于：心血管疾病、类风湿性关节炎、多发性硬化症、Crohn′s疾病、炎症性肠病、系统性红斑狼疮、多肌炎、脓毒性休克、移植物抗宿主病、哮喘、鼻炎、牛皮癣与癌症相关的恶病质和湿疹。

在一种优选的实施方式中，该炎症为一氧化氮介入的炎症反应。

其中，正常情况下内皮源性NO具有抑制炎症反应的作用，病理情况下诱导型NO合成酶合成大量的NO则有细胞毒作用，加重炎症反应。

在一种优选的实施方式中，该一氧化氮是由巨噬细胞释放的。

在一种优选的实施方式中，该一氧化氮是由细菌脂多糖诱导的巨噬细胞释放的。

其中，LPS是革兰阴性菌细胞壁的主要成分，也是其致病的主要物质基础。LPS是诱导单核/巨噬细胞活化、成熟的主要物质，可通过刺激单核/巨噬细胞产生并释放大量的一氧化氮(NO)、IL-1β以及肿瘤坏死因子-α(Tumornecrosis factor-α，TNF-α)等炎症因子参与机体急性期应答，引起机体炎性损伤。

本发明还涉及治疗和/或预防炎症的方法，其包括向有此需要的个体给药治疗有效量的上述药物组合物或药物制剂的步骤。

如本文所用，术语“治疗”指的是任何有益于人或非人动物的方案。因此，治疗可以是关于已存在的病症或者可以是预防性的(预防性治疗)。治疗可包括治愈、减轻或预防效应；术语“有效量”是指对病人给药的剂量或药量，以及对病人给药的频度，这些可由本领域的普通技术人员根据现有技术的应用和通过观察在有效治疗疾病或状况的类似条件下获得的结果很容易地确定。为了确定有效量或剂量，专职诊断医师要考虑许多因素，其包括但不限于：所采用的化合物的作用效果和持续时间；接受治疗的疾病的特征和严重程度，以及接受治疗的病人的性别、年龄、体重和一般健康状况和个体反应；以及本领域技术人员已知的相关情况。一般而言，其含量为体重的大约0.01mg/kg至大约100mg/kg的范围内，通常在体重的大约1mg/kg至大约20mg/kg的范围内。

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。

以下结合具体实施例对本发明作进一步详细描述，这些实施例不能理解为限制本申请所要求保护的范围。

实施例

1实验材料

BrukerAvance 600MHz核磁共振波谱仪(瑞士Bruker)，WatersAcquity UPLC H-CLASS超高液相色谱系统(美国Waters公司)，Xevo G2-S QTOF四级杆高分辨飞行时间质谱仪(美国Waters公司)，Flash快速纯化制备色谱仪(瑞典Biotage公司)，半制备高效液相色谱仪(美国Alltech公司)，Shimadzu LC-20A高效液相色谱仪(日本岛津)，GCK3308全自动空气源(北京中惠普分析技术研究所)，BSA2245-CW分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)，EYELA旋转蒸发仪(SB-1100上海爱朗仪器有限公司)，SK10GT型超声波清洗器(上海科导超声仪器有限公司)，Sigma 1-14小型台式离心机(德国Sigma公司)，真空干燥箱(DZF-6053上海一恒科学仪器有限公司)，LGL-25C冷冻干燥机(北京四环公司)。色谱柱：Agilent C₁₈柱(5μm，9.4×250mm)(美国安捷伦)，Kromasil C₁₈柱(5μm，4.6×250mm)(瑞典AKZO NOBEL公司)，Waters ACQUITY UPLC C₁₈柱(1.7μm，2.1×100mm)(美国Waters公司)。薄层层析硅胶板、200-300目正向硅胶(青岛海洋化工厂)，所用试剂为化学纯或分析纯。

2实验方法

将金银花栽培品九丰一号药材2Kg，用50％乙醇进行渗漉提取，减压旋蒸对提取液进行浓缩，浓缩液上样至HPD100大孔吸附树脂，分别用水、40％乙醇、70％乙醇和95％乙醇依次进行洗脱，之后经过30-60目聚酰胺柱层析，得到九丰一号的总环烯醚萜提取物(130g)。具体如图1所示。

取总环烯醚萜提取物30.0g，用甲醇溶解，采用200～300目硅胶进行Flash中压制备和分离，用洗脱体系二氯甲烷-甲醇-水(9-2-0.2)进行洗脱，TLC进行检测，收集和合并相似馏分，获得不同的组分，其中组分A(0.15g)用40％甲醇溶解，经半制备HPLC分离，流动相为乙腈-0.1％甲酸水(17∶83)，检测波长239nm，流速3mL·min^-1，得到化合物1(7.63mg)(t_R30min)和化合物2(22.52mg)(t_R 43min)；组分B(1.89g)用40％甲醇溶解，经半制备HPLC分离，流动相为乙腈-0.1％甲酸水(15∶85)，检测波长239nm，流速3mL·min^-1，得到化合物4(31.04mg)(t_R 40min)和化合物5(13.74mg)(t_R 34min)；将组分B半制备的后冲柱馏分冷冻干燥成粉末后，用40％甲醇溶解，经半制备HPLC分离，流动相为乙腈-0.1％甲酸水(17：83)，检测波长239nm，流速3mL·min^-1，得到化合物3(2.44mg)(t_R 37min)。从总环烯醚萜提取物中分离得到化合物的流程简图见图2。

3化合物结构解析

3.1化合物信息

通过¹H-NMR、¹³C-NMR、HSQC、HMBC、TOCSY、¹H-¹H-COSY和LC-MS等波谱技术，共鉴定出5个二聚体环烯醚萜苷类化合物，具体化合物见表1。

表1从金银花栽培品九丰一号中分离得到的二聚体环烯醚萜苷类化合物

注：*新化合物；^△为首次从金银花中分离

其中化合物1：(Z)-aldosecologanin；化合物2：(E)-aldosecologanin；化合物3：(Z)-demethyl-aldosecologanin；化合物4：(E)-demethyl-aldosecologanin；化合物5：StrychosideA。

3.2新化合物的结构解析

化合物3和4均为白色无定形粉末，易溶于水、甲醇，最大吸收波长为239nm，具有相同的分子式C₃₃H₄₄O₁₉。¹³C-NMR及DEPT谱显示化合物3、4分别有34个碳(1×CH₃,5×CH₂,22×CH,5×C)。¹³C-NMR谱可见2个酯羰基(化合物3：δC171.1,169.7、化合物4：δC170.6,169.2)、1个甲氧基(化合物3：δC52.6、化合物4：δC52.1)及2组葡萄糖信号(δC62.8～101.0)，且其余C信号多成对出现。¹H-¹H-COSY谱显示化合物3双键上的烯质子H-7(δ6.42)与H-6(δ3.00,2.70)耦合，化合物4双键上的烯质子H-7(δ6.71)与H-6(δ3.09,2.47)耦合，因此表明该化合物为环烯醚萜二聚体。¹H-NMR谱显示两个化合物分别存在两个典型的裂环环烯醚萜苷中的末端信号(8,8″-2H,10,10″-2H)和烯烃(3,3″-2H)，于此同时，醛基信号(7″,-1H)糖端基碳氢信号(1′,1″′-2H)和两组葡萄糖信号(δ3.19-4.72)，进一步表明化合物3和4分子骨架应为裂马钱子苷(secologanin)的二聚体，只是缺少了一个醛基和一个甲氧基，同时多出了一个双健，从化学位移值推测其为α，β-不饱和醛结构上的双键(C₇＝C₆″)。

化合物3在其¹H和¹³C-NMR谱中观察到醛基信号[δH-7″10.04(s),δC-7″192.8]和取代烯烃[δH-76.42(1H,t,J＝8.0Hz)，δC-7151.2和δC-6″141.3]的信号。在HMBC谱中，可以观察到醛基H-7″(δ10.04)与C-7(δ151.2)相关；同样H-7(δ6.42)与醛基C-7″(δ192.8)以及C-6″(δ141.3)分别相关，就充分证实了C-7与C-6″位之间的双键连接，结构类似于化合物1(Z-aldosecologanin)。但化合物3中只有一个甲氧基，甲氧基信号δ3.73(3H,s)与C-11″(δ169.7)、烯烃信号C-3″(δ7.51)的HMBC相关性将碳甲氧基置于C-4″上。

化合物4在其¹H和¹³C-NMR谱与化合物3相似，除了由7″-CHO引起的化学位移(δC197.1，δH 9.26)和H-7(δC 156.5，δH 6.71)，烯烃之间的HMBC相互关系H-7(δH 6.71)和C-5、C-7″表明与化合物5(StrychosideA)相似。区别在于甲氧基信号δ3.74与C-11(δ169.2)、烯烃信号C-3(δ7.57)的HMBC相关性将碳甲氧基置于C-4上，为化合物3的同分异构体。综合分析¹H-¹H COSY、HSQC、HMBC等谱，将其余的碳和质子信号进行了全归属，归属数据见表2。

根据以上理化性质和波谱数据确定化合物3和4的结构式如图3和图4，经系统的文献和SciFinder查询，确定化合物3和4为新化合物，分别命名为(Z)-demethyl-aldosecologanin和(E)-demethyl-aldosecologanin。

表2化合物3和4¹H-NMR和¹³C-NMR数据(600and 150MHzδin ppm,CD₃OD)

3.3其它已知化合物

化合物1：白色无定形粉末(甲醇)，易溶于水、甲醇。最大紫外吸收波长为239nm。HR-ESI-MS负离子显示：ESI-MS(m/z)：757.2584[M-H]^-，803.2653[M+HCOO]^-，综合质谱数据推测分子式为C₃₄H₄₆NO₁₉。¹H-NMR(600MHz,CD₃OD)δ:5.47(1H,s,H-1)，5.35(1H,s,H-1″)，7.66(1H,s,H-3)，7.53(1H,s,H-3″)，3.00(1H,m,H-5)，4.14(1H,m,H-5″)，2.63(1H,m,H-6a)，3.24(1H,m,H-6b)，6.43(1H,s,H-7)，10.08(1H,s,H-7″)，5.83–5.73(1H,m,H-8)，5.55(1H,m,H-8″)，2.72(1H,s,H-9)，2.66(1H,s,H-9″)，5.31(1H,d,J＝10.4Hz,H-10a)，5.35(1H,m,H-10b)，5.12(1H,d,J＝10.7Hz,H-10″a)，5.16(1H,m,H-10″b)，3.76(3H,s,H-12)，3.71(3H,s,H-12″)，4.74(1H,d,J＝5.5Hz,H-1′)，4.71(1H,d,J＝7.4Hz,H-1″′)，3.22-3.40(8H,m,H-glc)，3.93(2H,t,J＝10.7Hz,H-6′a,6″′a)。¹³C-NMR(150MHz,CD₃OD)δ:98.1(C-1)，97.9(C-1″)，154.9(C-3)，154.3(C-3″)，110.7(C-4)，110.4(C-4″)，34.4(C-5，5″)，26.8(C-6)，141.4(C-6″)，151.1(C-7)，192.4(C-7″)，136.0(C-8)，135.6(C-8″)，46.2(C-9)，45.5(C-9″)，120.8(C-10)，120.0(C-10″)，169.3(C-11)，169.1(C-11″)，52.5(C-12)，52.3(C-12″)，100.7(C-1′)，100.4(C-1″′)，75.0(C-2′)，74.3(C-2″′)，78.4(C-3′，3″′)，72.0(C-4)，71.9(C-4″′)，78.8(C-5′)，78.7(C-5″′)，63.2(C-6′)，63.1(C-6″′)。以上数据与文献(Liu Z X,Liu C T,Liu Q B,et al.Journal ofFunctional Foods,2015,18:512-519.)报道的(Z)-aldosecologanin基本一致。

化合物2：白色无定形粉末(甲醇)，易溶于水、甲醇。最大紫外吸收波长为239nm。HR-ESI-MS负离子显示：ESI-MS(m/z)：757.2552[M-H]^-，803.2617[M+HCOO]^-，综合质谱数据推测分子式为C₃₄H₄₆O₁₉。¹H-NMR(600MHz,CD₃OD)δ:5.60(1H,s,H-1)，5.51(1H,s,H-1″)，7.56(1H,s,H-3)，7.49(1H,s,H-3″)，3.12(1H,m,H-5,6b)，4.08(1H,m,H-5″)，2.46(1H,s,H-6a)，6.73(1H,s,H-7)，9.24(1H,s,H-7″)，5.80(1H,m,H-8)，5.63(1H,m,H-8″)，2.80(1H,s,H-9)，2.61(1H,m,H-9″)，5.38(1H,d,J＝17.2Hz,H-10a)，5.31(1H,d,J＝9.8Hz,H-10b)，5.08(1H,d,J＝17.3Hz,H-10″a)，5.09(1H,d,J＝8.6Hz,H-10″b)，3.74(3H,s,H-12)，3.61(3H,s,H-12″)，4.70(2H,t,J＝8.0Hz,H-1′,1″′)，3.19-3.40(8H,m,H-glc)，3.90(2H,t,J＝10.3Hz,H-6′a,6″′a)，3.69(2H,m,H-6′b,6″b)。¹³C-NMR(150MHz,CD₃OD)δ:98.6(C-1)，98.3(C-1″)，155.1(C-3)，153.0(C-3″)，111.4(C-4)，110.2(C-4″)，34.5(C-5)，31.9(C-5″)，30.6(C-6)，144.2(C-6″)，157.8(C-7)，197.9(C-7″)，136.5(C-8)，136.3(C-8″)，47.3(C-9)，46.3(C-9″)，121.2(C-10)，120.3(C-10″)，170.1(C-11，11″)，53.2(C-12)，52.9(C-12″)，101.7(C-1′)，100.7(C-1″′)，75.5(C-2′)，74.7(C-2″′)，78.9(C-3′)，78.8(C-3″′)，72.5(C-4)，72.4(C-4″′)，79.2(C-5’)，79.1(C-5″′)，63.6(C-6′)，63.5(C-6″′)。以上数据与文献(Liu Z X,Liu C T,Liu Q B,et al.Journal of Functional Foods,2015,18:512-519.)报道的(E)-aldosecologanin基本一致。

化合物5：白色无定形粉末(甲醇)，易溶于水、甲醇。最大紫外吸收波长为239nm。HR-ESI-MS负离子显示：ESI-MS(m/z)：743.2419[M-H]^-，综合质谱数据推测分子式为C₃₃H₄₄O₁₉。¹H-NMR(600MHz,CD₃OD)δ:5.56(1H,s,H-1)，5.51(1H,s,H-1″)，7.62(1H,s,H-3)，7.46(1H,s,H-3″)，3.2(2H,m,H-5,6a)，3.90(1H,m,H-5″)，2.36(1H,m,H-6a)，6.77(1H,d,J＝4.5Hz,H-7)，9.24(1H,s,H-7″)，5.67-2.60(2H,m,H-8,8″)，2.80(1H,s,H-9)，2.53-2.70(1H,m,H-9″)，5.39(1H,d,J＝17.3Hz,H-10a)，5.31(1H,d,J＝9.5Hz,H-10b)，5.06(1H,d,J＝17.1Hz,H-10″a)，5.02(1H,d,J＝9.7Hz,H-10″b)，3.69(3H,s,H-12″)，4.70(1H,d,J＝7.8Hz,H-1′)，4.67(1H,d,J＝7.6Hz,H-1″′)，3.28-3.39(8H,m,H-glc)，3.90(2H,t,J＝11.2Hz,H-6′a,6″′a)，3.70(1H,m,H-6′b)，3.60(1H,m,H-6″b)。¹³C-NMR(150MHz,CD₃OD)δ:98.0(C-1)，97.2(C-1″)，155.1(C-3)，152.1(C-3″)，110.5(C-4)，110.2(C-4″)，31.1(C-5)，31.0(C-5″)，27.6(C-6)，144.1(C-6″)，156.9(C-7)，197.6(C-7″)，136.3(C-8)，136.1(C-8″)，47.2(C-9)，45.9(C-9″)，120.5(C-10)，119.7(C-10″)，172.3(C-11)，169.7(C-11″)，52.0(C-12″)，100.5(C-1′，1″′)，74.8(C-2′)，74.6(C-2″′)，78.4(C-3′，3″′)，72.1(C-4)，72.0(C-4″′)，78.8(C-5′)，78.7(C-5″′)，63.2(C-6′)，63.1(C-6″′)。以上数据与文献(Atsuko,Itoh,Naoko,et al.Journal of Natural Products,2005,68(9):1434–1436.)报道的StrychosideA基本一致，为金银花首次分离得到。

4单体化合物的体外抗炎活性研究

4.1实验材料

SZX16型显微镜及DP2-BSW图像采集系统(日本Olympus公司)，Thermal CO₂培养箱(美国Thermal公司)，酶标仪(美国Molecular Devices公司)，二氧化碳细胞培养箱、生物安全柜(美国Thermo Fisher公司)，BSA2245-CW分析天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。CCK8、NO检测试剂盒(Griess试剂)(上海碧云天生物技术有限公司)，1％青霉素/链霉素、DMEM高糖培养基(美国Hyclone公司)，FBS胎牛血清(美国Gibco公司)，细菌脂多糖(LPS，Escherichia coli 055:B5)、吲哚美辛、二甲基亚枫(DMSO)(美国Sigma-Aldrich公司)，数据采用GraphPad Prism 6.0软件进行统计学分析。小鼠单核巨噬细胞RAW264.7购自中国科学院细胞库。

实验用5种二聚体环烯醚萜苷类单体化合物(化合物1、2、3、4和5)为如2“实验方法”所述从金银花栽培品九丰一号药材总环烯醚萜提取物中提取分离获得，其结构式见表1。

4.2实验方法

4.2.1化合物对Raw 264.7细胞的毒性作用

取5种二聚体环烯醚萜苷类单体化合物适量，加入DMSO配制成浓度为100μM的溶液依次稀释，得到化合物浓度分别为50、25、12.5、6.25μM。

RAW264.7细胞培养于含10％FBS和双抗的DMEM培养基中，于37℃5％CO₂培养箱中培养，每2-3天传代一次。传代时，无菌条件下在操作台上将培养瓶中RAW 264.7细胞除去细胞培养基，加入新鲜的3mL DMEM后，吹打混匀，取100μL的RAW 264.7细胞以1×10⁴细胞·mL^-1浓度接种于96孔板，细胞培养箱中培养24h。24h后加入不同浓度的100μL的化合物溶液处理细胞(5组)，每组6个复孔，继续培养24h，然后每孔加入10μL CCK8试剂，培养4h后，酶标仪检测450nm波长下各孔的OD值，计算细胞存活率。计算公式＝实验组OD均值/对照组OD均值×100％。

4.2.2化合物对LPS诱导的RAW 264.7细胞释放NO的影响

将RAW264.7细胞以每孔1×10⁴细胞的密度接种于96孔板中，分别加入不同组别药物，预孵育1h后，加入300ng·ml^-1LPS，置于5％CO₂空气培养箱中培养24h。其中，不同组别设置为：以培养基作为对照组，300ng·ml^-1LPS为模型组，浓度为12.5μM和25μM的化合物为药物组，浓度为25μM的吲哚美辛为阳性药物组，每组5个复孔。在37℃细胞培养箱中处理24小时后，取50μL细胞上清液于96孔细胞培养板中，先后加入50μL Griess Reagent I和50μLGriess Reagent II试剂，混匀，用酶标仪在540nm处检测其吸光度。通过Griess反应测定NO的含量来测定培养基中NO的浓度，并计算NO抑制率。

以上对本申请实施例进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本申请的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明仅用于帮助理解本申请的方法及其核心思想。同时，本领域技术人员依据本申请的思想，基于本申请的具体实施方式及应用范围上做出的改变或变形之处，都属于本申请保护的范围。综上所述，本说明书内容不应理解为对本申请的限制。

Claims (10)

1.一种下式I的二聚体环烯醚萜苷类化合物或其药学上可接受的盐、酯、外消旋体、R-异构体、S-异构体、同位素标记物、溶剂化物、代谢产物或前药，

其中6″,7双键构型为Z式或E式，R₁和R₂是相同的或不同的且各自独立地选自-COOH、-COOCH₃、-COOC₂H₅、-COOC₃H₇、-COOC₄H₉、-CH₂COOCH₃、-CH₂COOC₂H₅、-CH(CH₃)COOCH₃、-CH(CH₃)COOC₂H₅、-CH₂COOCH₂COCH₃、-OCH₃或-CHO。

2.根据权利要求1所述的二聚体环烯醚萜苷类化合物，其中6″,7双键构型为Z式或E式，R₁和R₂是相同的或不同的且各自独立地选自-COOH、-COOCH₃、-COOC₂H₅、-COOC₃H₇、-COOC₄H₉、-OCH₃或-CHO。

3.根据权利要求2所述的二聚体环烯醚萜苷类化合物，其中6″,7双键构型为Z式或E式，R₁和R₂是相同的或不同的且各自独立地选自-COOH或-COOCH₃。

4.根据权利要求3所述的二聚体环烯醚萜苷类化合物，其中6″,7双键构型为Z式或E式，R₁和R₂是不同的且选自-COOH或-COOCH₃。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的二聚体环烯醚萜苷类化合物，其中6″,7双键构型为Z式或E式，R₁是-COOCH₃，R₂是-COOH或R₁是-COOH，R₂是-COOCH₃。

6.一种药物制剂，包含权利要求1至5中任一项所述的二聚体环烯醚萜苷类化合物和药学上可接受的辅料；

优选地，所述药物制剂的剂型是液体剂型或固体剂型；

更优选地，所述液体剂型是糖浆剂、注射溶液、悬浮液或乳剂；

特别优选地，所述固体剂型是片剂、锭剂、胶囊、滴丸、丸剂、颗粒剂、粉剂、霜剂或栓剂；

尤其优选地，所述辅料选自以下中的一种或多种：调味剂、崩解剂、防腐剂、润滑剂、湿润剂、粘合剂、增稠剂和增溶剂。

7.根据权利要求6所述的药物制剂，其中所述药物制剂进一步包括一种或多种抗炎药；

优选地，所述抗炎药为非甾体类抗炎药；

优选地，所述非甾体类抗炎药选自以下中的一种或多种：阿司匹林、对乙酰氨基酚、吲哚美辛、萘普生、萘普酮、双氯芬酸、布洛芬、尼美舒利、罗非昔布和塞来昔布。

8.一种制备权利要求1至5中任一项所述的二聚体环烯醚萜苷类化合物的方法，其中所述方法包括如下步骤：

(1)取适量的金银花药材作为原料，使用40％～95％的乙醇水溶液进行冷浸、渗漉、回流或超声提取，得到提取液；

(2)对所述渗漉液进行浓缩，得到浓缩液；

(3)利用大孔吸附树脂分离所述浓缩液，洗脱剂依次为水、35％至45％乙醇水溶液，65％至75％乙醇水溶液和约95％乙醇水溶液，收集35％至45％乙醇水溶液的洗脱液经聚酰胺柱层析后得到总环烯醚萜提取物；以及

(4)所述总环烯醚萜提取物经过硅胶柱层析和半制备HPLC分离步骤，得到式I的二聚体环烯醚萜苷类化合物。

9.根据权利要求8所述的方法，所述步骤(1)中的所述金银花药材为金银花栽培品九丰一号；

优选地，所述步骤(1)中的所述提取的方法为渗漉法；

优选地，所述步骤(1)中的所述乙醇水溶液的浓度为约50％；

优选地，所述步骤(2)中的所述浓缩的方法为减压旋蒸法；

优选地，所述步骤(3)中的所述洗脱剂依次为水、约40％乙醇水溶液，约70％乙醇水溶液和约95％乙醇水溶液；

优选地，所述步骤(3)中的所述大孔吸附树脂为HPD100大孔吸附树脂；

优选地，所述步骤(4)中的所述硅胶柱层析是采用粒度为200至300目的正向硅胶；

优选地，所述步骤(4)中的硅胶柱层析法采用Flash中压制备法；

特别优选地，所述Flash中压制备法的洗脱流动相为二氯甲烷-甲醇-水体积比为9:2:0.2的混合溶剂；

又优选地，所述半制备HPLC分离步骤的流动相为乙腈-0.1％甲酸水(17∶83)和/或乙腈-0.1％甲酸水(15∶85)；

又优选地，所述半制备HPLC分离步骤的检测波长为239nm；

又优选地，所述半制备HPLC分离步骤的流速为3mL·min^-1。

10.权利要求1至5中任一项所述的二聚体环烯醚萜苷类化合物或权利要求6或7所述的药物制剂在制备用于治疗和/或预防炎症的药物中的用途；

优选地，所述炎症为一氧化氮介入的炎症反应；

更优选地，所述一氧化氮是由巨噬细胞释放的；

特别优选地，所述一氧化氮是由细菌脂多糖诱导的巨噬细胞释放的。

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