CN103113432A - 一种环烯醚萜类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种环烯醚萜类化合物及其制备方法和应用。所述环烯醚萜类化合物的结构式如图1所示。所述制备方法包括:将三花龙胆(Gentiana triflora Pall.)置于有机溶剂中浸提,获得浸提液;对浸提液进行萃取,将萃取液浓缩,获得提取物;从提取物中分离纯化得到所述环烯醚萜类化合物。所述应用为环烯醚萜类化合物在制备抗炎症药物中的应用。与现有技术相比,本发明的环烯醚萜类化合物为新化合物,具有较强的抗炎活性,可用于制备抗炎症药物。
Description
技术领域
本发明属于植物化学领域,尤其涉及一种环烯醚萜类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
全世界龙胆属植物约有400余种,广泛分布于北半球的许多国家,在中国大陆、俄罗斯、朝鲜、日本等均有分布,生长于海拔400至1700米的地区。中国有龙胆属植物240多种,多产于西南高山地区,与杜鹃、报春合称为世界三大高山花卉。
根据2010版药典记载,龙胆为龙胆科龙胆属植物:龙胆(Gentianascabra Bunge)、三花龙胆(G.triflora Pall.)、条叶龙胆(G.manshurica Kitag.)或滇龙胆(G.rigescens Franch)的干燥根和根茎。《本草纲目》记载:“性味苦,瑟,大寒,无毒。主治骨间寒热、惊病邪气,继绝伤,定五脏,杀虫毒。”现代药理研究表明,龙胆具有保肝利胆、兴奋中枢、促进胃液分泌、抗炎、抗菌等作用。
龙胆属植物中,主要的药用植物包括:秦艽、小秦艽、麻花艽、粗茎秦艽等。研究表明,龙胆属植物中主要含有环烯醚萜及裂环环烯醚萜及其苷类化合物。其中裂环环烯醚萜类成分主要有龙胆苦苷(gentiopicroside)、当药苦苷(swertiamarin)、当药苷(sweroside)、苦龙胆酯甙(amarogentin)等。
龙胆苦苷具有促进胃液及游离盐酸分泌的健胃和抗炎作用,当药苦苷有促进毛发生长和解痉、镇痛抗炎作用,当药苷有退热抗惊厥作用和抗肝细胞损伤、促进肝细胞修复的保肝作用。以这类成分为主研制开发的镇痛药、抗肝炎药物已有工业化生产。
公开号为CN101774922B的中国专利文献公开了一种2,3-二羟基苯甲酸酯类化合物即制备和应用。通过将中药龙胆粉碎后,用甲醇浸提,抽滤浓缩,得甲醇浸提物粗样,再用80%甲醇水溶液和正己烷萃取分离,得到正己烷层粗样;将粗样经硅胶开口柱分离,再通过ODS开口柱分离,用反相HPLC纯化,得到目的化合物。
作为小分子化合物,天然分离的2,3-二羟基苯甲酸酯类化合物在老年性痴呆的体外筛选模型PC12细胞中表现出显著的NGF mimics活性,可在制备老年性痴呆症等神经退行性疾病的药物中加以应用。
文献调研显示,对龙胆成分的研究主要致力于龙胆(G. scabra Bge.),较少有关于对三花龙胆(G. triflora Pall.)化学成分及抗炎活性的报道。
发明内容
本发明提供了一种环烯醚萜类化合物,该化合物为新化合物,且具有较强的抗炎活性。
一种环烯醚萜类化合物,为化合物Ⅰ或化合物II,其中,化合物Ⅰ的结构式为:
化合物II的结构式为:
本发明还提供了一种所述环烯醚萜类化合物的制备方法,包括:
(1)将三花龙胆(Gentiana triiflora Pall.)置于有机溶剂中浸提,获得浸提液;
(2)对浸提液进行萃取,将萃取液浓缩,获得提取物;
(3)从提取物中分离纯化得到所述环烯醚萜类化合物。
所述三花龙胆(Gentianatrflora Pall.)可以是三花龙胆植株整株或其组织,优选为干燥的三花龙胆根茎,可以直接或经粉碎后置于有机溶剂中浸提,但粉碎之后的三花龙胆根茎与有机溶剂的接触面积更大,更有利于活性成分的浸出。
步骤(1)中,三花龙胆与有机溶剂的重量体积比优选为1g:5~8mL。所述有机溶剂可选用甲醇、乙醇或丙酮,由于甲醇和丙酮对人体伤害较大,因此优选为乙醇,更优选为80%乙醇溶液。采用80%乙醇溶液不仅节约资源,且对目标化合物的提取率最大。若无特殊说明,本发明所述80%乙醇溶液均用水配制。
浸提可选用冷浸法或热回流提取法。冷浸法步骤简单,简单易行。具体操作步骤为:先将三花龙胆按配方浸入有机溶剂中,浸泡48~72小时,进行渗漉,得初漉液;药渣再用有机溶剂连续渗漉提取30~40小时,得续漉液;将所述初漉液和续漉液合并,浓缩得到浸提液。
步骤(2)中,先用极性较大的溶剂将所述浸提液溶解、稀释,再加入极性相对较小的溶剂进行萃取。由于所述浸提液来自植物,因此优选先用水稀释,再用乙酸乙酯等能与水不互溶、极性相对较小的溶剂进行萃取。
步骤(3)中,可以采用正相硅胶柱层析或中压硅胶柱层析对提取物进行分离纯化,获得所述苯骈七元杂环类化合物。首先利用几种具有极性梯度的有机溶剂作洗脱液进行正相硅胶柱层析,获得含有目标化合物的粗馏分,再利用中压硅胶柱层析对该粗馏分进行分离纯化,获得所述环烯醚萜类化合物。
为获得纯度更高的目标化合物,可利用高效液相色谱等方法对经中压硅胶柱层析获得的目标馏分作进一步纯化。
其中,化合物Ⅰ为白色无定形粉末;比旋光度为-200(c=1.13,CH3OH);高分辨-傅里叶变换-离子回旋共振-质谱(HR-FT-ICR-MS)分析显示其分子量为643.1601[M+Na]+(计算值C29H32O15Na:643.1633);紫外光谱(UV)图显示λmax(CH3OH)为221nm、250nm和331nm;红外光谱(IR)结果显示该化合物含有羟基(3468cm-1)、酯基(1754cm-1)、内酯基团(1676cm-1)、双键(1624cm-1)以及三取代苯环(905cm-1,842cm-1,754cm-1)。
结合以上分析获得的数据,采用核磁共振分析确定了该化合物的结构,分子式为C29H32O15,并将其命名为(1S,5R,9R)-去葡萄糖基三叶苷。该化合物尚未有相关的专利或者文献报道,是全新的化合物。
化合物Ⅱ为白色无定形粉末;比旋光度为-154(c=1.30,CH3OH);HR-FT-ICR-MS分析显示其分子量为867.2296[M+Na]+(计算值C40H44O20Na:867.2318);紫外光谱图显示λmax(CH3OH)为201nm、209nm、235nm和313nm;红外光谱结果显示出该化合物含有羟基(3447cm-1)、共轭酯基(1728cm-1,1624cm-1)、三取代苯环(900cm-1,842cm-1,754cm-1)。
结合以上分析获得的数据,采用核磁共振谱分析确定了该化合物的结构,分子式为C40H44O20,并将其命名为(1S,5R,9R)-龙胆苷。该化合物尚未有相关的专利或者文献报道,是全新的化合物。
本发明还提供了所述环烯醚萜类化合物在制备抗炎症药物中的应用。所述环烯醚萜类化合物能够抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞分泌炎性因子,可以用于预防炎症和治疗炎症相关疾病。所述药物以本发明的环烯醚萜类化合物为主要活性成分,还含有药剂学上可接受的药物赋形剂或载体。也可按照药剂学上记载的制剂制备方法制成制剂。所述药物的制剂形式包括液体制剂、固体制剂、胶囊剂、胶丸剂。
与现有技术相比,本发明的有益效果为:
本发明的环烯醚萜类化合物为新化合物,具有较强的抗炎活性,可用于制备抗炎症药物。
附图说明
图1为本发明环烯醚萜类化合物的结构式;
图2为本发明环烯醚萜类化合物的分离流程图;
图3为本发明化合物I的高分辨-傅里叶变换-离子回旋共振-质谱分析结果图;
图4为本发明化合物I的紫外光谱图;
图5为本发明化合物I的红外光谱图;
图6为本发明化合物I的核磁共振氢谱图;
图7为本发明化合物I的核磁共振碳谱图;
图8为本发明化合物Ⅱ的高分辨-傅里叶变换-离子回旋共振-质谱分析结果图;
图9为本发明化合物Ⅱ的紫外光谱图;
图10为本发明化合物Ⅱ的红外光谱图;
图11为本发明化合物Ⅱ的核磁共振氢谱图;
图12为本发明化合物Ⅱ的核磁共振碳谱图。
具体实施方式
实施例1化合物I和化合物Ⅱ的提取分离
(1)提取分离
提取流程见图2,具体步骤如下:
1)取干燥三花龙胆根茎粗粉6.5kg,加入6倍体积的80%乙醇溶液,浸泡48h,进行渗漉,得初漉液;
2)滤渣用80%乙醇溶液连续渗漉提取35h,流速为17~34mL/min,获得续漉液;
3)合并初漉液与续漉液,40℃条件下减压浓缩至浓浸膏;
4)浓浸膏以1.5倍量水稀释后得到浸膏,按照浸膏:乙酸乙酯约1:1(V/V)萃取六次,萃取后的乙酸乙酯相于38℃条件下减压浓缩至干,得提取物336g;
5)所得提取物以乙酸乙酯、二氯甲烷混合溶解,加入400g硅藻土搅拌均匀,自然挥干溶剂;
6)另称取230g硅藻土装入硅胶柱内,上样后分别以石油醚(7L),二氯甲烷(7L),乙酸乙酯(10L),甲醇(4.5L)洗脱,分别收集、浓缩,得石油醚层、二氯甲烷层、乙酸乙酯层和甲醇层浸膏分别为154g、145g、39g和3g;
7)二氯甲烷层(145.5g)经硅胶柱层析(200–300目,18×60cm,2kg),以石油醚-二氯甲烷-甲醇(5:1:0,2:1:0,1:1:0,0:1:0,0:500:1,0:200:1,0:100:1,0:50:1,0:20:1,0:10:1,0:5:1,0:2:1,0:1:1,0:0:1,各洗脱27L)洗脱得到22个组分(Fr1~Fr22);
8)组分Fr8(12.1g)经ODS中压柱层析,以30%-90%甲醇-水梯度洗脱得到19个组分(Fr8-1~Fr8-19);组分Fr8-12以高效制备液相纯化,以53%甲醇-水等度洗脱,得到化合物I(233mg,58%甲醇-水洗脱,保留时间为58min);
9)组分Fr18(12.3g)经ODS中压柱层析,以30%-100%甲醇-水梯度洗脱得到15个组分(Fr18-1~Fr18-15),其中Fr18-8以高效制备液相纯化,以40~80%乙腈-水梯度洗脱,得到化合物Ⅱ(248mg,73%乙腈-水洗脱,保留时间为33min)。
(2)结构分析
步骤(1)获得的化合物I白色无定形粉末;比旋光度为-200(c=1.13,CH3OH);HR-FT-ICR-MS显示其分子量为643.1601[M+Na]+(计算值C29H32O15Na:643.1633)(图3);紫外光谱图显示λmax(CH3OH)为221nm、250nm和331nm(图4);红外光谱结果显示该化合物含有羟基(3468cm-1)、酯基(1754cm-1)、内酯基团(1676cm-1)、双键(1624cm-1)以及三取代苯环(905cm-1,842cm-1,754cm-1)(图5)。
对化合物I进行核磁共振分析,氢谱见图6(分辨率为500MHz),碳谱见图7(分辨率为125MHz)。
化合物Ⅱ为白色无定形粉末;比旋光度为-154(c=1.30,CH3OH);HR-FT-ICR-MS显示其分子量为867.2296[M+Na]+(计算值C40H44O20Na:867.2318)(图8);紫外光谱图显示λmax(CH3OH)为201nm、209nm、235nm和313nm(图9);红外光谱结果显示出该化合物含有羟基(3447cm-1)、共轭酯基(1728cm-1,1624cm-1)、三取代苯环(900cm-1,842cm-1,754cm-1)(图10)。
对化合物Ⅱ进行核磁共振分析,氢谱见图11(分辨率为500MHz),碳谱见图12(分辨率为125MHz)。
结合以上分析获得的数据,采用核磁共振分析确定了化合物I和化合物Ⅱ的结构,两个化合物的1H-NMR和13C-NMR数据见表1。
表1化合物I和化合物Ⅱ的NMR数据
通过1H-NMR、13C-NMR推断化合物I的结构式为:
分子式为C29H32O15,并将其命名为(1S,5R,9R)-去葡萄糖基三叶苷;
通过1H-NMR、13C-NMR推断化合物Ⅱ的结构式为:
分子式为C40H44O20,并将其命名为(1S,5R,9R)-龙胆苷。这两个化合物均尚未有相关的专利或者文献报道,是全新的化合物。
实施例2化合物I和化合物Ⅱ的抗炎活性
(1)药品、试剂及仪器
1)上述分离所得的化合物:(1S,5R,9R)-去葡萄糖基三叶苷,(1S,5R,9R)-龙胆苷;
2)小鼠巨噬细胞RAW264.7;
3)脂多糖(LPS),DMEM高糖培养基,DMEM无酚红培养基,灭活胎牛血清,双抗,DMSO,采用碧云天生物技术研究所一氧化氮检测试剂盒(编号S0021);
4)CO2培养箱,倒置显微镜,超净工作台,平板振荡仪,Bio-Tek酶标仪(ELX800)。
(2)实验方法
1)用200ng/mL的脂多糖刺激小鼠巨噬细胞RAW264.7,构建炎症细胞模型;
2)将细胞接种于96孔板中,接种密度为2×104/孔,接种完成后在CO2培养箱中培养24h;
3)将其中的培养液替换为含有200ng/mL脂多糖和不同浓度(分别为3.1、6.3、12.5、25.0、50.0μmol/L)化合物I(或化合物Ⅱ)的DMEM无酚红培养基,于培养箱中孵育24h;
4)采用一氧化氮检测试剂盒测定细胞培养液上清液中亚硝酸根的含量来指示反应体系中NO的分泌量,从而评价化合物I的抗炎活性。检测方法为:
将上清液100μL/孔吸入一新板中,依次加入Griess ReagentⅠ和GriessReagentⅡ各50μL/孔,避光振荡混匀,波长550nm测定吸光度值并计算两个化合物的相对抗炎活性,计算公式如下所示:
相对抗炎活性(%)=(模型组-加药组)/(模型组-正常组)×100%。
计算结果表明,化合物I在50.0μmol/L浓度下的相对抗炎活性为(59.9±4.4)%,化合物Ⅱ在25.0μmol/L浓度下的相对抗炎活性为(59.4±4.2)%。表明化合物I和化合物Ⅱ能够抑制脂多糖诱导的RAW264.7细胞分泌炎性因子,可以用于预防炎症和治疗炎症相关疾病。
Claims (8)
2.如权利要求1所述环烯醚萜类化合物的制备方法,其特征在于,包括:
(1)将三花龙胆(Gentiana triflora Pall.)置于有机溶剂中浸提,获得浸提液;
(2)对浸提液进行萃取,将萃取液浓缩,获得提取物;
(3)从提取物中分离纯化得到所述环烯醚萜类化合物。
3.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述三花龙胆为三花龙胆粉末。
4.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,三花龙胆与有机溶剂的重量体积比为1g:5~8mL。
5.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,所述有机溶剂为乙醇。
6.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中,先将三花龙胆按配方浸入有机溶剂中,浸泡48~72小时,进行渗漉,得初漉液;药渣再用有机溶剂连续渗漉提取30~40小时,得续漉液;将所述初漉液和续漉液合并,浓缩得到浸提液。
7.如权利要求2所述的制备方法,其特征在于,步骤(3)中,采用正相硅胶柱层析或中压硅胶柱层析对提取物进行分离纯化,获得所述环烯醚萜类化合物。
8.如权利要求1所述的环烯醚萜类化合物在制备抗炎症药物中的应用。
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SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant |