CN102391328B - 同时制备magnoloside A和magnoloside B化学对照品的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种同时制备magnoloside A和magnoloside B化学对照品的制备工艺。厚朴药材经醇提取得粗提物，经萃取、树脂柱分离、反相中压液相色谱制备和反相高效液相色谱制备四步高效纯化，即可获得纯度大于98％的magnoloside A和magnoloside B两种化学对照品。本发明工艺步骤较简单、纯度高、色泽好，并且适于规模化生产。

Description

同时制备magnoloside A和magnoloside B化学对照品的方法

一、技术领域

本发明涉及一种同时制备magnolosideA和magnoloside B化学对照品的制备工艺。主要包括提取、溶剂萃取、树脂柱分离及中压反相液相富集和高压反相液相制备四步高效纯化，收集流份、干燥即可同时获取两种对照品。其结构式如下： 

二、背景技术

厚朴为大宗常用中药材之一，具有燥湿消痰、下气除满的功能，用于湿滞伤中、脱痞吐泻、食积气滞、腹胀便秘、痰饮喘咳。厚朴酚与和厚朴酚被认为是厚朴的活性成分，同时也是《中国药典》中厚朴药材含量测定的成分；余盛贤等报道了苯乙醇苷类化合物为厚朴水溶性部位的主要成分，指出苯乙醇苷-magnoloside A在厚朴的产地加工过程中含量有较大变化(中国中药杂志，2010，35(14)1831-1835)。苯乙醇苷类化合物具有广泛的生物活性，而对中药厚朴中苯乙醇苷类化合物的化学成分研究少有报道，对苯乙醇苷类成分的定性定量研究更是未见报道。因此，制备magnoloside A、magnoloside B对照品对于厚朴药材及相关复方的多指标质量控制具有重要意义。目前，对照品市场上也未见magnoloside A和magnoloside B的供应，其分离制备方法也少有报道。Hasegawa takashi首次报道了从日本厚朴(Magnolia obovata)中分离得到magnoloside A和magnoloside B，并申请了新化合物专利(JP 63310899)。其制备步骤如下：日本厚朴用甲醇提取物，混悬于水中，经正丁醇萃取，正丁醇萃取部位反复经硅胶柱层析纯化，最后经HW-40F纯化得到纯品。该方法制备工艺较为复杂，制备周期较长，且没有进行纯度检验。 

本发明以厚朴为原料，经醇提取得到提取物，通过萃取、树脂柱分离、反相中压液相色谱制备和反相高效液相制备色谱四步高效纯化，收集相应流份，干燥，可批量同时获取两个个对照品。 

三、发明内容

本发明提供了一种工艺较简单、易规模化的制备新方法，从厚朴中同时制备纯度大于98％的magnoloside A和magnoloside B两种化学对照品，制备规模为克级。 

为实现上述目的，本发明采用的技术方案： 

(1)将厚朴药材粉碎，得到粗粉，用70％乙醇水加热回流提取。 

(2)将(1)乙醇水提取的提取液浓缩至2g生药/mL，用等体积的氯仿萃取三次。 

(3)将(2)中萃取后的水溶液过大孔树脂柱，用5倍柱体积的蒸馏水洗脱除杂，再用5倍柱体积20％乙醇水洗脱。 

(4)将(3)中20％乙醇水洗脱液浓缩至干，用0％-25％的甲醇水溶解，配置成浓度为100-1000mg/mL。 

(5)中压反相制备色谱柱的填充填料为C18，制备柱长30-100cm、直径2-5cm；采用的流动相为A：甲醇；B：pH 3-4的醋酸水溶液，两相溶剂以按照体积分数比为11∶89到35∶65进行梯度洗脱；进样量与色谱填料的比为1∶30-1∶100，流速控制在15-100ml/min；收集两个主峰。 

(6)两个主峰收集液分别浓缩，经高压反相制备液相纯化，填充填料为C18，制备柱长25-50cm，直径2-5cm；采用的流动相为30％甲醇水等度洗脱，流速为10-100mL/min。 

(7)收集液40℃低压回收有机溶剂，然后冻干。 

以本发明从厚朴中分离magnoloside A和magnoloside B化学对照品具有如下优点和进步： 

(1)本发明针对性强，工艺较简单。 

氯仿萃取除去厚朴中的脂溶性化合物，再经大孔树脂分离，最大程度地富集目标产物，有利于中压反相制备色谱中填料的保护和分离效果的提高；中压反相液相制备较文献反复硅胶柱层析，具有较好的重现性和快速等优点；高压制备液相中采用甲醇-水溶剂等度洗脱，不需平衡柱子，提高了效率、节约了试剂。 

(2)本发明中采用的技术手段适于放大进行规模化生产。 

大孔树脂具有价格便宜、可再生反复使用等特点，适于规模化生产；采用的中压反相色谱和高压反相色谱也具有规模生产的优点。 

(3)本发明得到的对照品具有纯度高(大于99％)，色泽较好(淡黄色)。 

四、附图说明

图1为magnoloside A的HPLC分析图谱(328nm)； 

图2为magnoloside B的HPLC分析图谱(328nm)； 

图3为magnoloside A的¹H-NMR图谱； 

图4为magnoloside A的¹³C-NMR图谱； 

图5为magnoloside B的¹H-NMR图谱； 

图6为magnoloside B的¹³C-NMR图谱； 

图7为厚朴中制备magnolosideA和magnoloside B对照品的工艺流程图。 

五、具体实施方式

现结合实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本发明的限定。 

厚朴干燥树皮8.0kg，粉碎，用4倍量70％乙醇加热回流提取2h，提取3次，浓缩至4L，用4L氯仿萃取3次。水部位经4L的D101大孔树脂分离，5倍柱体积蒸馏水洗脱除杂后，再用5倍柱体积的20％乙醇洗脱，收集20％乙醇洗脱部分，浓缩干燥得棕色浸膏250g。取浸膏50g，用50mL 20％甲醇溶解，经微孔滤膜滤过，注入反相中压色谱柱，色谱柱直径5cm，长50cm，色谱柱的填充填料为50μm C18(YMC)，流速控制为100mL/min，检测波长为328nm，流动相梯度为0-100min，11％-35％甲醇-醋酸水(pH＝3)。收集两个主峰，40℃减压旋转浓缩，得到magnoloside A 10.5g，magnoloside B 7g。 

反相高压液相制备：取magnoloside A粗品1.5g，溶于10mL 20％甲醇水中，经微孔滤膜滤过，吸取1mL滤液经高压反相制备柱分离，柱长度为25cm，内径2cm，流速10mL/min，合理收集主峰得到100mg的magnoloside A，纯度大于98％。吸取5mL滤液经高压反相制备柱分离，柱长度为50cm，内径5cm，流速150mL/min，合理收集主峰得到480mg的magnoloside A，纯度大于98％。外观为淡黄色粉末。 

取magnoloside B粗品1.5g，溶于10mL 20％甲醇水中，经微孔滤膜滤过，吸取1mL滤液经高压反相制备柱分离，柱长度为25cm，内径2cm，流速10mL/min，合理收集主峰得到90mg的magnoloside B，纯度大于98％。吸取5mL滤液经高压反相制备柱分离，柱长度为50cm，内径5cm，流速150mL/min，合理收集主峰得到400mg的magnoloside B，纯度大于98％。外观为淡黄色粉末。 

Claims (13)

1.同时制备magnolosideA和magnoloside B化学对照品的方法，其特征在于：厚朴药材经乙醇溶液加热回流提取得粗提物，经萃取、树脂柱分离、反相中压液相制备及反相高效液相制备四步高效纯化，同时获取纯度大于98％的magnoloside A和magnoloside B两种化学对照品；具体步骤如下： 

(1)提取和萃取：厚朴药材用乙醇溶液加热回流提取得粗提物，回收乙醇并浓缩至一定体积，用氯仿萃取除掉脂溶性杂质； 

(2)树脂柱粗分：水层经树脂柱分离，先以水洗脱除去杂质，然后以体积分数在20％-30％之间的任一乙醇溶液洗脱，收集相应乙醇洗脱物，浓缩干燥得棕色浸膏； 

(3)反相中压液相色谱富集和反相高效液相制备色谱精制：棕色浸膏用水或低浓度甲醇溶液溶解，微孔滤膜过滤，反相中压液相色谱分离，以甲醇-醋酸水溶液为洗脱体系，紫外检测器328nm下监测，收集图谱中两个主要的色谱峰，蒸干，即可得到纯度大于85％的magnoloside A和magnoloside B粗品；再经反相高效液相制备色谱分离，甲醇-水溶液为洗脱体系，即可得到纯度大于98％的对照品，其外观为淡黄色粉末。 

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中提取溶剂为0-95％的乙醇，其用量是药材的4-10倍。 

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中加热回流提取时间为1-2小时，提取次数为2-4次。 

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中浓缩至1-2g生药/mL。 

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中氯仿的用量为被萃取溶液体积的1-2倍，萃取次数2-3次。 

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中粗分离中采用的树脂为D101、HPD100、DiaionHP-20或AB-8。 

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(2)中各梯度洗脱的体积为3-5倍柱体积。 

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中样品用水或者为体积分数不高于25％的甲醇溶解，样品浓度为100-1000mg/mL。 

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中反相中压液相制备柱的填充填料为C18，制备柱长30-100cm、直径2-5cm。 

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中反相高效液相制备柱的填充填料为C18，制备柱长25-50cm、直径2-5cm。 

11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中反相中压液相采用的流动相为甲醇和醋酸水两相体系，醋酸水的pH值为3-4，两相溶剂以体积分数比为11：89～35：65进行梯度洗脱，流速为30 -100mL/min。 

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中反相高效制备液相进样体积为1-50mL，流速控制在10-200mL/min；采用的流动相为30％甲醇水溶液。 

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中反相中压液相和反相高效制备液相上样量与填料之比为1：30-1：100。 

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