CN105646620B

CN105646620B - 灯盏花甲素的制备方法

Info

Publication number: CN105646620B
Application number: CN201511007502.8A
Authority: CN
Inventors: 林艳和; 伏继萍; 苏海霞
Original assignee: YUNNAN BIOVALLEY PHARMACEUTICAL Co Ltd
Current assignee: YUNNAN BIOVALLEY PHARMACEUTICAL Co Ltd
Priority date: 2015-12-29
Filing date: 2015-12-29
Publication date: 2018-06-26
Anticipated expiration: 2035-12-29
Also published as: CN105646620A

Abstract

本发明提供了一种灯盏细辛制备灯盏花甲素的方法，采用醇或者水回流提取，大孔吸附柱层析富集，制备高效液相色谱纯化的工艺流程。具有成本低，易操作，高含量的特点；本发明的方法适用于工业级生物医药用液相制备色谱装置，以实现高纯度灯盏花甲素的工业化生产。

Description

灯盏花甲素的制备方法

技术领域

本发明涉及植物的提取分离领域，尤其涉及一种从灯盏细辛中得到灯盏花甲素单体的提取方法。

背景技术

5,4’-二羟基黄酮-7-O-D-葡萄糖醛酸又名灯盏花甲素(apigenin-7-O-β-D-glucuronide)，是从菊科植物短葶飞蓬(又名灯盏细辛)[Erigeron breviscapus(Vant.)Hand-Mazz]中提取而得的一种黄酮苷类化合物，灯盏花甲素具有如式I所示结构：

分布于多种天然药用植物体中(如:灯盏细辛(Erigeron breviscapus)、苦碟子(Ixeris sonchifolia)、拳卷地钱(Marchantia convolute)，哥兰叶(Celastrusgemmatus)，多裂委陵菜(Potentilla multifida)牛至(Origanum vulgare)，水飞蓟(silybum marianum)、苦苣菜(Sonchus oleraceus L.)，福寿草(Adonis amurensis)等中。

灯盏细辛(灯盏花)(Erigeron breviscapus(Vant.)Hand.–Mazz)为菊科飞蓬属草本植物，主要分布于云南省，民间广泛用于治疗中风后遗症、风湿病、胸痹等症，取得了较好效果。植物药提取物灯盏花素(包括灯盏花甲素和乙素，其中主要成分为灯盏花乙素)作为药典中的原料药单独成药，归在2015版药典一部植物油脂和提取物章节。

灯盏花甲素多作为灯盏花乙素(野黄芩苷)的相关物质。而灯盏花甲素的活性也有报道：灯盏花甲素具有明显的抗溃疡的作用和抗急性食管炎及胃炎的作用。对血管性老年痴呆有一定疗效。

灯盏花甲素虽然存在于多种植物中，并且具有一些活性。然而由于其在植物中含量较低，例如灯盏花乙素在灯盏细辛中含量高的可以达到3-4％，而灯盏花甲素的含量就只有0.3-0.5％，所以大量制备比较困难。导致其生物活性等报道也较少。

现有的文献及专利也大多只涉及灯盏花乙素的纯化，而灯盏花甲素作为其中的有关物质成分需要去除。灯盏花甲素的纯化文献报道是用自合成酰胺基化大孔树脂分离，此树脂市面上稀少，仅作为研究使用。且不同丙烯酸甲酯在树脂中的比例也是需要控制的。

发明内容

为了克服现有技术中灯盏花甲素的提取方法存在的缺陷，本发明提出了一种工艺简单、易操作、快速、高效、产品纯度高的芍药苷单体的提取方法。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下。

本发明提供了一种灯盏细辛制备灯盏花甲素的方法，包括如下步骤：

(1)灯盏细辛加入乙醇或水回流提取2-3次，合并提取液，减压浓缩成浸膏；

(2)将灯盏细辛浸膏用浓度为0.1-20％的稀碱溶液溶解至pH 7-10之间，使浸膏溶解后，过滤；滤液加酸调pH值至1-3，静置后过滤；得到沉淀；

(3)将沉淀用碱溶解，调节pH值6-9之间，上苯乙烯型大孔树脂层析柱，用水冲洗，分别接收洗脱液，以液相检测，收集灯盏花甲素相对含量大于60％及以上的馏分。将含有灯盏花甲素的洗脱液部分减压浓缩成清膏；

(4)将含有灯盏花甲素的清膏上制备液相柱，以有机溶剂和含有酸的水作为流动相，进行纯化分离，收集灯盏花甲素纯品，检测波长为：270-335nm，收集保留时间在10分钟以后的馏分，该馏分为灯盏花甲素纯品。

优选的，所述步骤(1)中的乙醇含量为0-95％；优选50％-80％的乙醇溶液；更优选65％的乙醇溶液。该百分比为体积百分比。

除非特殊说明，本发明所涉及的百分含量表示法均为业内常规的百分含量的表示方法。

优选的，所述步骤(2)中的碱溶液为碳酸钠，碳酸氢钠，氢氧化钠，碳酸钾，碳酸氢钾，氢氧化钾中的一种或几种。所述步骤(2)中加入的酸为盐酸，硫酸或者磷酸。

优选的，所述步骤(3)中的碱溶液为为碳酸钠，碳酸氢钠，氢氧化钠，碳酸钾，碳酸氢钾，氢氧化钾中的一种或几种。

优选的，所述步骤(3)中苯乙烯型大孔树脂为D101，DA201，D301，D401，D141,D160,AB-8HPD100,HPD450或HPD600；

更为优选的，所述步骤(3)中洗脱液洗脱顺序为色素，灯盏花乙素，灯盏花甲素。

以液相检测结果为监测指标，收集灯盏花甲素相对含量大于60％的馏分。

更为优选的，所述步骤(4)中制备液相柱为C18反相硅胶填充柱。

更为优选的，所述步骤(4)中洗脱液中有机溶剂为甲醇，乙醇或者乙腈中的一种，含酸的水相为0.01-1％的甲酸或者乙酸水溶液；有机溶剂与酸水的比例为10-70％。

更为优选的，所述步骤(4)中保留时间为10分钟至90分钟，10分钟之前很难得到甲素纯品，原则上90分钟以后也可以，但是在工业上应用意义，因此，优选10-90min；当检测波长为270-335nm，流速为40ml/min时，收集馏分进行纯化分离，收集保留时间在20-28min的馏分，该馏分为灯盏花甲素纯品。

更为优选的，所述的步骤(4)中梯度洗脱条件为：以62:38的含0.5％甲酸的水-甲醇为流动相，检测波长270-280nm，流速40ml/min，收集20-40分钟馏分；或者以82:18的含0.1％甲酸的水-乙腈为流动相，检测波长320-335nm，流速30ml/min，收集25-45分钟馏分；或者以50:50的含1％乙酸的水-甲醇为流动相，检测波长335nm，流速50ml/min，出峰时间18min；收集15-45分钟馏分。

更为优选的，所述步骤(4)中梯度洗脱条件为：以62:38的含0.5％甲酸的水-甲醇为流动相，检测波长270-280nm，流速40ml/min，收集20-30分钟馏分；或者，以82:18的含0.1％甲酸的水-乙腈为流动相，检测波长320-335nm，流速30ml/min，收集26-38分钟馏分；或者以50:50的含1％乙酸的水-甲醇为流动相，检测波长335nm，流速50ml/min，出峰时间18min；收集18-28分钟馏分。

在本发明的优选实施例中，所述步骤(4)中梯度洗脱条件为：以水(含0.5％甲酸)-甲醇62:38为流动相，检测波长：270-280nm，流速：40ml/min，收集20-30分钟馏分。

在本发明的另一优选实施例中，所述步骤(4)中梯度洗脱条件为：以水(0.1％甲酸)-乙腈82:18为流动相，检测波长：320-335nm流速：30ml/min，出峰时间：26min。收集26-38分钟馏分。

或者，所述步骤(4)中梯度洗脱条件为：以水(1％乙酸)-甲醇50:50为流动相，检测波长：335nm流速：50ml/min，出峰时间：18min。收集18-28分钟馏分。

有益效果：本发明提供的一种灯盏细辛制备灯盏花甲素的方法，碱溶酸沉得到黄酮成分，主要为灯盏花乙素和灯盏花甲素，再通过苯乙烯型大孔树脂富集灯盏花甲素，最后通过制备型高效液相色谱制备得到纯度大于98％的灯盏花甲素纯品。

与文献报道方法相比有如下优点：

(a)本方法先用碱溶酸沉法富集黄酮类成分，将灯盏细辛中大量咖啡酸酯类等其他成分去除，

(b)用苯乙烯类大孔树脂富集灯盏花甲素，溶剂仅用水冲洗，具有经济，安全性。杂质，灯盏花乙素，灯盏花甲素依次从柱子上下来，在分离灯盏花甲素的同时，可以得到纯度较高的灯盏花乙素。

(c)用制备型高效液相分离，可以按比例具有损失低，产品纯度高的特点；该半制备的色谱条件可同比放大，适用于工业级生物医药用液相制备色谱装置，以实现高纯度灯盏花甲素的工业化生产。

步骤1：灯盏细辛提取后浸膏得到黄酮及咖啡酸酯类等成分，其中灯盏花乙素相对含量为37％，灯盏花甲素相对含量为9％，高效液相检测图如图1所示。

步骤2：灯盏细辛浸膏经过碱溶酸沉后富集了黄酮类物质，灯盏花乙素的相对含量为81％，灯盏花甲素的相对含量为11％。高效液相检测图如图2所示。

步骤3：灯盏细辛酸化沉淀上聚乙烯大孔树脂后，所得到灯盏花甲素馏分中灯盏花乙素相对含量为8％，灯盏花甲素相对含量为81％。高效液相检测图如图3。

步骤4：将上了大孔树脂后的灯盏花甲素部分用制备型高效液相色谱纯化，得到98.3％含量的灯盏花甲素，用高效液相分析检测图谱如图4。

步骤1-4的每一步骤用高效液相色谱柱检测：色谱柱Zobax SB-C18(4.6mm×250mm,5μ),流动相：0分钟时，10％流动性A,90％流动相B；20分钟时，90％流动性A,10％流动相B；20.1分钟时，10％流动性A,90％流动相B；26分钟时，10％流动性A,90％流动相B。

其中，流动相A为甲醇，流动相B为含0.5％的甲酸水溶液.检测条件为：流速1.0mL/min，检测波长335nm，柱温30℃。

附图说明

图1：灯盏细辛浸膏的HPLC图；

图2：灯盏细辛浸膏碱溶酸化后沉淀HPLC图谱；

图3：灯盏细辛酸化沉淀上大孔树脂后HPLC图谱；

图4：高效制备液相纯化后的灯盏花甲素HPLC图谱。

其中，1为灯盏乙素，2为灯盏甲素。

具体实施方案

下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明：

实施例1：

1)试验步骤：

(1)取灯盏细辛药材1000g用65％的乙醇回流提取，每次提取1小时，提取三次，减压浓缩，得到灯盏细辛浸膏。

(2)将灯盏细辛浸膏加3倍量水稀释，用5％氢氧化钠溶液将其pH调至9,使其溶解。过滤，滤液加10％稀硫酸溶液将其pH调至2静置过夜，使其沉淀，过滤，得到含有灯盏花乙素和甲素的酸化沉淀物。

(3)取灯盏细辛沉淀物，加入10％碳酸氢钠溶液溶解使pH调至7.0，上处理好的D101柱(上样量-树脂重量1:20)，用纯化水冲洗。弃去前面2.5升水流出馏分，收集2.6-12升馏分。减压浓缩至稀膏(密度为1.10)。

(4)将含有灯盏花甲素的稀膏上制备液相柱，采用C18反相硅胶色谱柱，色谱柱尺寸为Φ30×300mm，C18反相硅胶填料，粒径为10μm，以水(含0.5％甲酸)-甲醇62:38为流动相，检测波长：335nm流速：40ml/min，出峰时间：20min。收集20-30分钟馏分。得到灯盏花甲素单体。

2)试验结果：经HPLC分析，纯度≥98.0％。

实施例2：

1)试验步骤：

(1)取灯盏细辛药材1000g用水回流提取，每次提取1小时，提取三次，减压浓缩，得到灯盏细辛浸膏。

(2)将灯盏细辛浸膏加2倍量水稀释，用5％碳酸钠溶液将其pH调至10，使其溶解。过滤，滤液加10％稀盐酸溶液将其pH调至1静置过夜，使其沉淀，过滤，得到含有灯盏花乙素和甲素的酸化沉淀物。

(3)取灯盏细辛沉淀物，加入10％碳酸钠溶液溶解使pH调至7.5，上处理好的D102柱(上样量-树脂重量1:15)，用纯化水冲洗。弃去前面3升水流出馏分，收集3-15升馏分。减压浓缩至稀膏(密度为1.08)。

(4)将含有灯盏花甲素的稀膏上制备液相柱，采用C18反相硅胶色谱柱，色谱柱尺寸为Φ30×300mm，C18反相硅胶填料，粒径为10μm，以水(0.1％甲酸)-乙腈82:18为流动相，检测波长：280nm流速：30ml/min，出峰时间：26min。收集26-38分钟馏分。得到灯盏花甲素单体。

2)试验结果：经HPLC分析，纯度≥98.3％。

实施例3：

1)试验步骤：

(1)取灯盏细辛药材1000g用90％乙醇回流提取，每次提取1小时，提取三次，减压浓缩，得到灯盏细辛浸膏。

(2)将灯盏细辛浸膏加4倍量水稀释，用5％氢氧化钠溶液将其pH调至10，使其溶解。过滤，滤液加10％稀硫酸溶液将其pH调至1静置4小时，使其沉淀，过滤，得到含有灯盏花乙素和甲素的酸化沉淀物。

(3)取灯盏细辛沉淀物，加入5％氢氧化钾溶液溶解使pH调至8，上处理好的AB-8柱(上样量-树脂重量1:25)，用纯化水冲洗。弃去前面2.4升水流出馏分，收集2.5-15升馏分。减压浓缩至稀膏(密度为1.06)。

(4)将含有灯盏花甲素的稀膏上制备液相柱，采用C18反相硅胶色谱柱，色谱柱尺寸为Φ30×300mm，C18反相硅胶填料，粒径为10μm，以水(1％甲酸)-甲醇50:50为流动相，检测波长：335nm流速：50ml/min，出峰时间：18min。收集18-28分钟馏分。得到灯盏花甲素单体。

2)试验结果：经HPLC分析，纯度≥98.5％。

Claims

1.一种灯盏花甲素的制备方法，包括如下步骤：

(1)灯盏细辛加入50-80％乙醇或水回流提取2-3次，该百分比为体积百分比，合并提取液，减压浓缩成浸膏；

(3)将沉淀用碱溶解，调节pH值6-9之间，上苯乙烯型大孔树脂层析柱，用水冲洗，分别接收洗脱液，以液相检测，收集灯盏花甲素相对含量大于60％及以上的馏分,将含有灯盏花甲素的洗脱液部分减压浓缩成清膏；

(4)将含有灯盏花甲素的清膏上制备液相柱，所述制备液相柱为C18反相硅胶填充柱，以有机溶剂和含有酸的水作为流动相，进行纯化分离，收集灯盏花甲素纯品，有机溶剂为甲醇，乙醇或者乙腈中的一种，含酸的水相为0.5％甲酸的水、0.1％甲酸的水或1％乙酸的水的一种，梯度洗脱条件为：以62:38的含0.5％甲酸的水-甲醇为流动相，检测波长335nm，流速40ml/min，收集20-30分钟馏分；或者以82:18的含0.1％甲酸的水-乙腈为流动相，检测波长280nm，流速30ml/min，收集26-38分钟馏分；或者以50:50的含1％乙酸的水-甲醇为流动相，检测波长335nm，流速50ml/min，出峰时间18min；收集18-28分钟馏分；该馏分为灯盏花甲素纯品。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(1)中的乙醇含量为65％；该百分比为体积百分比。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(2)中的碱溶液为碳酸钠，碳酸氢钠，氢氧化钠，碳酸钾，碳酸氢钾，氢氧化钾中的一种或几种。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(2)中加入的酸为盐酸，硫酸或者磷酸。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(3)中的碱溶液为碳酸钠，碳酸氢钠，氢氧化钠，碳酸钾，碳酸氢钾，氢氧化钾中的一种或几种。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(3)中苯乙烯型大孔树脂为D101，DA201，D301，D401，D141,D160,AB-8,HPD100,HPD450或HPD600；洗脱液洗脱顺序为色素、灯盏花乙素、灯盏花甲素。