CN101781277B - 一种二氢槲皮素单体的分离纯化方法 - Google Patents
一种二氢槲皮素单体的分离纯化方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种二氢槲皮素单体的分离纯化方法，包括提取、水解、富集、结晶等步骤。该方法不需先将二氢槲皮素的糖苷从富含多种糖苷的乙醇提取液中分离出来，直接进行水解，再分离纯化；可大大简化工艺、缩短生产周期、降低生产成本；而通过后续的水解、富集、结晶过程，通过最适宜的工艺及参数条件，使产品中二氢槲皮素的含量达到99％以上；整个工艺过程操作简便、工艺稳定、成本低廉，适合工业化生产，且分离效率高、产品纯度高，即可实现大量二氢槲皮素单体的高纯度分离制备。
Description
技术领域
本发明涉及从植物中分离化合物单体技术领域，尤其是一种二氢槲皮素单体的分离纯化方法。
背景技术
二氢槲皮素又叫花旗松素、紫杉叶素，其化学名为3，5，7，3’，4’-五羟基二氢黄酮，英文名Dihydroquercetin，Taxifolin，3，5，7，3’，4’-Pentahydroxyflavanone，分子式为C15H12O7，分子量为304.26，结构式如下：
二氢槲皮素是天然黄酮类活性成分之一，属于维生素PP家族，具有很强的抗氧化能力。它能从人体中有效地消除过量的自由基，促进毛细血管的渗透性，改善免疫功能，减少癌症的形成；是防止心血管疾病、有效恢复毛细血管弹性、阻止发炎和肿块形成的优良天然药物。同时，二氢槲皮素还是高效的天然食品抗氧化剂，它的抗氧化作用超过其它诸如槲皮素、芸香苷和合成抗氧化剂等。把二氢槲皮素加入到植物油、动物脂肪、干奶粉、含脂肪的糖果点心食品中，可以延长其有效期2～3倍，并且在此情况下，可以使食品明显的表现出改善的性能。
根据现有的研究成果，二氢槲皮素多存在于落叶松、红蓼、黄杞等植物中。
因红蓼中二氢槲皮素的含量仅为0.55％(据刘东《分光光度法测水红花子中花旗松素含量》)，现有技术多从落叶松、黄杞叶中提取制备二氢槲皮素。如：中国专利申请200610035280.5公开了“一种从落叶松中提取二氢槲皮素的方法”，200610035752.7公开了“一种采用吸附法从落叶松中提取二氢槲皮素的方法”，200710144650.3公开了“一种从落叶松及其加工剩余料中提取二氢槲皮素和阿拉伯半乳聚糖的方法”，均是以落叶松作为生产原料提取二氢槲皮素。但是，落叶松资源本身较为稀缺，且落叶松中二氢槲皮素的含量也较低(据王宇《RP-HPLC法测定落叶松中二氢槲皮素的含量》，其含量为1.86％)，用来生产二氢槲皮素，势必对已经短缺的落叶松资源造成浪费和破坏。又如专利申请200710105982.7公开了“一种从黄杞叶中提取分离二氢槲皮素的方法”，采用了资源丰富的黄杞叶作为生产二氢槲皮素的原料，其工艺过程为先分离出二氢槲皮素的一种糖苷枛落新妇苷，再水解落新妇苷精制二氢槲皮素。因在黄杞叶中，二氢槲皮素具有落新妇苷、异落新妇苷、新落新妇苷、黄杞苷、异黄杞苷、新黄杞苷、新异黄杞苷等多种糖苷，因此直接分离落新妇苷的难度较大，工艺过程相对繁琐，成本较高，且产品纯度只能达到95％左右，难以获得纯度可达到99％以上的高纯度二氢槲皮素单体产品；且生产周期较长，生产一批产品通常需要10天以上。
发明内容
本发明的目的就是针对上述现有技术中无高纯度二氢槲皮素的分离制备方法、因而缺少高纯度二氢槲皮素单体化合物等问题，提供一种二氢槲皮素单体的分离纯化方法。该方法操作简便，分离效率高，工艺稳定，成本低廉，可实现大量二氢槲皮素单体的高纯度分离制备，得到的二氢槲皮素单体纯度高，可达到99％以上。
为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：
一种二氢槲皮素单体的分离纯化方法，以黄杞叶(胡桃科植物黄杞Engelhardtiaroxburghiana Wall.的叶)为原料进行提取、水解、富集和结晶而得，包括下述主要步骤：
A、提取：
将干燥的黄杞叶粉碎成粗粉，加入质量百分比浓度为60％～80％的乙醇溶液，其加入量按照药材重量∶乙醇溶液体积＝1Kg∶(8～10)L计算，60～80℃提取3～4次，每次2～3小时，提取液过滤，合并过滤液，浓缩回收乙醇，得浓浸膏待进行下一步水解处理。
本步骤通过乙醇提取，主要将黄杞叶中的黄酮及其苷类提取出来，得到含有二氢槲皮素的糖苷等化合物的浸膏；
B、水解：
将步骤A所得的浸膏加水稀释至相对密度为1.02～1.08g/mL(约95℃测定)，加入盐酸或硫酸，使盐酸或硫酸的质量百分比达到2％～5％，加热回流1～3小时，使二氢槲皮素的糖苷水解转化为二氢槲皮素；将水解液自然冷却，抽取上清液待富集处理。
本步骤通过酸水解，使二氢槲皮素的糖苷水解转化为二氢槲皮素，有得后续的分离纯化处理。
C、富集：
将步骤B所得水解后的上清液以2～4倍柱体积的流速通过大孔吸附树脂柱(大孔吸附树脂可优选自D101、D103、AB-8等中的任意一种)(大孔吸附树脂柱在使用前可通过下述方法活化：将大孔吸附树脂装于树脂柱中，用95％乙醇以1.5倍柱体积流速洗脱至流出液加水不浑浊，换用纯化水淋洗柱床至流出液无醇味)，直到吸附饱和(用毛细管吸取流出液，点样于硅胶GF254板，UV254灯光下观察，有二氢槲皮素的特征性红棕色斑点，即可判断为饱和)；用纯水冲洗杂质，直到水洗流出液近无色；再用质量百分比为15％～30％的乙醇溶液洗脱至二氢槲皮素洗脱完全(用毛细管吸取流出液，点样于硅胶GF254板，UV254灯光下观察，不显红棕色斑点，即可判断洗脱完全)，收集乙醇溶液洗脱液，回收乙醇，继续浓缩至有晶体开始析出；将浓缩液自然冷却结晶8～12小时；过滤，固体沉淀物备用，将滤液通过再次浓缩、结晶富集；合并固体沉淀物，进行下一步结晶处理。
本步骤通过大孔吸附树脂柱处理，分梯度洗脱，除去水溶性杂质等，得到主要含有二氢槲皮素的乙醇洗脱液。
D、结晶：
由于步骤C通过大孔吸附树脂柱处理后的乙醇洗脱液中并非只有二氢槲皮素一种成分，它还含有一些与之结构性质等相近的杂质，可通过重结晶等方法进一步纯化。
按照固体沉淀物∶乙醇溶液＝1g∶(6～8)ml计算，向步骤C得到的固体沉淀物中加入质量百分比浓度为40％～60％的乙醇溶液，加热使溶解完全，过滤除去不溶性杂质，将滤液冷却结晶；根据晶体纯度情况，可重结晶数次(通常2-3次即可)，直到纯度≥99％。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明方法不需先将二氢槲皮素的糖苷从富含多种糖苷的乙醇提取液中分离出来，直接进行水解，再分离纯化；由于省略了水解之前的分离步骤，可大大简化工艺、缩短生产周期、降低生产成本；而通过持续的水解、富集、结晶过程，通过最适宜的工艺及参数条件，使产品中二氢槲皮素的含量达到99％以上；整个工艺过程操作简便、工艺稳定、成本低廉，适合工业化生产，且分离效率高、产品纯度高，即可实现大量二氢槲皮素单体的高纯度分离制备。
附图说明
图1是本发明实施例1所得二氢槲皮素单体产品的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。
但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
下述各实施例中，终产品二氢槲皮素单体的纯度复检均采用反相分析型液相色谱(RP-HPLC)法，色谱条件如下：
以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇∶水∶磷酸(35∶65∶0.1)为流动相；柱温30℃；流速1.0ml/min；检测波长为294nm。
实施例1
本实施例二氢槲皮素单体的分离纯化方法，以黄杞叶(胡桃科植物黄杞Engelhardtiaroxburghiana Wall.的叶)为原料进行提取、水解、富集和结晶而得，包括下述主要步骤：
A、提取：
将干燥的黄杞叶150kg粉碎成粗粉，装入体积2m3的提取罐中，加入质量百分比浓度为80％的乙醇溶液1.20m3，60℃提取3次，每次3小时，提取液过滤，合并过滤液，浓缩回收乙醇，得浓浸膏待进行下一步水解处理。
B、水解：
将步骤A所得的浸膏加水稀释至相对密度为1.08g/mL(约95℃测定)，共得溶液1.20m3，缓慢加入浓硫酸26.4kg，边加边搅拌均匀，逐渐加热至沸腾，回流3小时，使二氢槲皮素的糖苷水解转化为二氢槲皮素；将水解液自然冷却，抽取上清液待富集处理。
C、富集：
将步骤B所得水解后的上清液以2倍柱体积的流速通过活化好的D101大孔吸附树脂柱(活化方法：将大孔吸附树脂装于树脂柱中，用95％乙醇以1.5倍柱体积流速洗脱至流出液加水不浑浊，换用纯化水淋洗柱床至流出液无醇味)，直到吸附饱和(用毛细管吸取流出液，点样于硅胶GF254板，UV254灯光下观察，显红棕色斑点)；用纯水冲洗杂质，直到水洗流出液近无色；再用质量百分比为15％的乙醇溶液洗脱至二氢槲皮素洗脱完全(用毛细管吸取流出液，点样于硅胶GF254板，UV254灯光下观察，不显红棕色斑点)，收集乙醇溶液洗脱液，回收乙醇，继续浓缩至有晶体开始析出；将浓缩液自然冷却结晶12小时；过滤，得固体沉淀物9.3kg，进行下一步结晶处理。
D、结晶：
向步骤C得到的9.3kg固体沉淀物中加入质量百分比浓度为40％的乙醇溶液75L，加热使充分溶解，过滤除去不溶性杂质，将滤液冷却结晶12小时；过滤，得晶体7.2kg；将7.2kg晶体用58L质量百分比浓度为40％的乙醇溶液加热复溶，自然冷却结晶12小时。过滤，得白色结晶6.5kg。经HPLC检测，产品纯度为99.13％，计算收得率为4.33％。
整个生产流程历时仅4天，能大大缩短生产周期，节约生产成本。
实施例2
本实施例二氢槲皮素单体的分离纯化方法，以黄杞叶(胡桃科植物黄杞Engelhardtiaroxburghiana Wall.的叶)为原料进行提取、水解、富集和结晶而得，包括下述主要步骤：
A、提取：
将干燥的黄杞叶500kg粉碎成粗粉，装入体积6m3的提取罐中，加入质量百分比浓度为60％的乙醇溶液5m3，80℃提取4次，每次2小时，提取液过滤，合并过滤液，浓缩回收乙醇，得浓浸膏0.5m3待进行下一步水解处理。
B、水解：
将步骤A所得的浸膏加水稀释至相对密度为1.02g/mL(约95℃测定)，共得溶液2.5m3，缓慢加入浓盐酸360kg，边加边搅拌均匀，逐渐加热至沸腾，回流3小时，使二氢槲皮素的糖苷水解转化为二氢槲皮素；将水解液自然冷却，抽取上清液待富集处理。
C、富集：
将步骤B所得水解后的上清液以4倍柱体积的流速通过活化好的D103大孔吸附树脂柱(活化方法：将大孔吸附树脂装于树脂柱中，用95％乙醇以1.5倍柱体积流速洗脱至流出液加水不浑浊，换用纯化水淋洗柱床至流出液无醇味)，直到吸附饱和(用毛细管吸取流出液，点样于硅胶GF254板，UV254灯光下观察，显红棕色斑点)；用纯水冲洗杂质，直到水洗流出液近无色；再用质量百分比为30％的乙醇溶液洗脱至二氢槲皮素洗脱完全(用毛细管吸取流出液，点样于硅胶GF254板，UV254灯光下观察，不显红棕色斑点)，收集乙醇溶液洗脱液，回收乙醇，继续浓缩至有晶体开始析出；将浓缩液自然冷却结晶8小时；过滤，滤液与下一批次待富集溶液合并，得固体沉淀物33kg，进行下一步结晶处理。
D、结晶：
向步骤C得到的33kg固体沉淀物中加入质量百分比浓度为60％的乙醇溶液200L，加热使充分溶解，过滤除去不溶性杂质，将滤液冷却结晶8小时；过滤，得晶体25kg；将25kg晶体用150L质量百分比浓度为60％的乙醇溶液加热复溶，自然冷却结晶8小时。过滤，得白色结晶22kg。经HPLC检测，产品纯度为98.74％，同法重结晶1次，得白色结晶20.3kg，经HPLC检测，产品纯度为99.20％；计算收得率为4.06％。
整个生产流程历时仅4天，能大大缩短生产周期，节约生产成本。
实施例3
本实施例二氢槲皮素单体的分离纯化方法，以黄杞叶(胡桃科植物黄杞Engelhardtiaroxburghiana Wall.的叶)为原料进行提取、水解、富集和结晶而得，包括下述主要步骤：
A、提取：
将干燥的黄杞叶200kg粉碎成粗粉，装入体积3m3的提取罐中，加入质量百分比浓度为70％的乙醇溶液1.8m3，70℃提取3次，每次3小时，提取液过滤，合并过滤液，浓缩回收乙醇，得浓浸膏待进行下一步水解处理。
B、水解：
将步骤A所得的浸膏加水稀释至相对密度为1.05g/mL(约95℃测定)，共得溶液1.5m3，缓慢加入浓硫酸46kg，边加边搅拌均匀，逐渐加热至沸腾，回流2.5小时，使二氢槲皮素的糖苷水解转化为二氢槲皮素；将水解液自然冷却，抽取上清液待富集处理。
C、富集：
将步骤B所得水解后的上清液以3倍柱体积的流速通过活化好的AB-8大孔吸附树脂柱(活化方法：将大孔吸附树脂装于树脂柱中，用95％乙醇以1.5倍柱体积流速洗脱至流出液加水不浑浊，换用纯化水淋洗柱床至流出液无醇味)，直到吸附饱和(用毛细管吸取流出液，点样于硅胶GF254板，UV254灯光下观察，显红棕色斑点)；用纯水冲洗杂质，直到水洗流出液近无色；再用质量百分比为25％的乙醇溶液洗脱至二氢槲皮素洗脱完全(用毛细管吸取流出液，点样于硅胶GF254板，UV254灯光下观察，不显红棕色斑点)，收集乙醇溶液洗脱液，回收乙醇，继续浓缩至有晶体开始析出；将浓缩液自然冷却结晶10小时；过滤，滤液与下一批次待富集溶液合并，得固体沉淀物13kg，进行下一步结晶处理。
D、结晶：
向步骤C得到的13Kg固体沉淀物中加入质量百分比浓度为50％的乙醇溶液90L，加热使充分溶解，过滤除去不溶性杂质，将滤液冷却结晶10小时；过滤，得晶体10kg；将10kg晶体用70L质量百分比浓度为50％的乙醇溶液加热复溶，自然冷却结晶10小时。过滤，得白色结晶8.2kg。经HPLC检测，产品纯度为99.08％，计算收得率为4.10％。
整个生产流程历时仅4天，能大大缩短生产周期，节约生产成本。
Claims (4)
1.一种二氢槲皮素单体的分离纯化方法，以黄杞叶为原料进行提取、水解、富集和结晶而得，包括下述主要步骤：
A、提取：
将干燥的黄杞叶粉碎成粗粉，加入质量百分比浓度为60%～80%的乙醇溶液，其加入量按照药材重量:乙醇溶液体积=1Kg:(8～10)L计算，60～80℃提取3～4次，每次2～3小时，提取液过滤，合并过滤液，浓缩回收乙醇，得浓浸膏待进行下一步水解处理；
B、水解：
将步骤A所得的浓浸膏加水稀释至相对密度为1.02～1.08g/mL，加入盐酸或硫酸，使盐酸或硫酸的质量百分比达到2%～5%，加热回流1～3小时， 使二氢槲皮素的糖苷水解转化为二氢槲皮素；将水解液自然冷却，抽取上清液待富集处理；
C、富集：
将步骤B所得水解后的上清液以2～4倍柱体积的流速通过选自D101、D103、AB-8中的任意一种大孔吸附树脂柱，直到吸附饱和；用纯水冲洗杂质，直到水洗流出液近无色；再用质量百分比浓度为15%～30%的乙醇溶液洗脱至二氢槲皮素洗脱完全，收集乙醇溶液洗脱液，回收乙醇，继续浓缩至有晶体开始析出；将浓缩液自然冷却结晶8～12小时；过滤，得固体沉淀物，待下一步结晶处理；
D、结晶：
按照固体沉淀物:乙醇溶液=1g:( 6～8)ml计算，向步骤C得到的固体沉淀物中加入质量百分比浓度为40%～60%的乙醇溶液，加热使溶解完全，过滤除去不溶性杂质，将滤液冷却结晶；根据晶体纯度情况，重结晶数次，直到纯度≥99%。
2.根据权利要求1中的方法，其特征在于：
所述的步骤C“富集”过程中，将步骤B所得水解后的上清液通过大孔吸附树脂柱之前，采用下述方法对大孔吸附树脂进行活化：
将大孔吸附树脂装于树脂柱中，用95%乙醇以1.5倍柱体积流速洗脱至流出液加水不浑浊，换用纯化水淋洗柱床至流出液无醇味。
3.根据权利要求1中的方法，其特征在于：
所述的步骤C“富集”过程中，将结晶、过滤后的滤液再次浓缩、结晶富集；得到的固体沉淀物共同进行下一步结晶处理。
4.根据权利要求1中的方法，其特征在于：
所述的步骤D“结晶”过程中，重结晶次数为2-3次。
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