具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述。
但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
实施例1
本实施例为由下述重量份配比的中药提取物制成的中药注射剂(水针):
人参茎叶总皂苷提取物10份,灯盏细辛总黄酮提取物10份,灯盏细辛总咖啡酸酯提取物5份。
其中:
人参茎叶总皂苷提取物为通过下述方法从人参茎叶中提取制得的物质:
①水提:取人参茎叶药材,粉碎,加8倍量水提取3次,每次1小时,合并水提液,浓缩至药材重量的1/2;
②醇沉:在上述①浓缩后的水提液中加入乙醇使乙醇浓度达到70%,4℃以下冷藏,静置24小时以上,滤过,将滤液回收乙醇,再滤过;
③过大孔树脂柱:将上述②处理后的药液以0.3 BV/h的速度通过D101大孔吸附树脂柱,先用水洗至洗脱液呈近无色,弃去水洗脱液;继续用10%乙醇洗脱至洗脱液呈近无色,弃去10%乙醇洗脱液;再用3BV的60%乙醇洗脱,收集60%乙醇洗脱液;
④丙酮沉淀:在上述③收集的60%乙醇洗脱液中加入乙醇使含醇量为80%,静置24小时,滤过,滤液回收乙醇,按0.5g/100ml加入活性炭,煮沸10分钟,滤过,滤液浓缩,加入3倍量丙酮,搅拌,静置30分钟,滤过,将滤渣干燥,即得人参茎叶总皂苷提取物,其总皂苷含量为85%。
灯盏细辛总黄酮提取物和灯盏细辛总咖啡酸酯提取物为通过下述方法从灯盏细辛中提取制得的物质:
①碱溶液渗漉提取:取灯盏细辛药材,铡碎,加入0.4%碳酸氢钠溶液浸泡2小时后,以10-20ml/min.kg速度渗滤提取,收集相当于药材重量12倍量的渗漉液;
②过大孔树脂柱:将上述①收集的渗漉液以2BV/h的速度通过HPD100大孔吸附树脂,先用水洗脱至洗脱液呈近无色,弃去水洗脱液;再用3BV 80%乙醇洗脱,收集80%乙醇洗脱液;
③第一次酸沉:将上述②收集的80%乙醇洗脱液回收乙醇,用20%硫酸溶液调pH值为2-3,4℃冷藏,静置12小时,滤过,酸沉后的滤液和沉淀分别备用;
④提取总黄酮:取上述③酸沉后的沉淀,用少量水洗涤2次,再加入10倍量水,使沉淀混悬,用5%氢氧化钠溶液调pH值为8左右使溶解,放置12小时,滤过,滤液用20%硫酸溶液调pH值为2-3,4℃冷藏,静置12小时,滤过,将沉淀用少量水洗涤2次,再加入10倍量水,使沉淀混悬,用5%氢氧化钠溶液调pH值为8左右使溶解,按0.4g/100ml加入活性炭,煮沸10分钟,滤过,滤液用20%硫酸溶液调pH值为2-3,4℃冷藏,静置12小时,滤过,取沉淀用少量水洗涤2次,再用少量70%乙醇洗涤2次,减压干燥(80℃,-0.09MPa),即得灯盏细辛总黄酮提取物,其总黄酮含量为89%;
⑤提取总咖啡酸酯:取上述③酸沉后的滤液,用10%氢氧化钠溶液调节pH值为7.0左右,并浓缩至约为药材重量的1/5,加入乙醇至含醇量为80%,4℃冷藏,放置12小时,滤过,滤液回收乙醇,以0.5BV/h的速度通过聚酰胺树脂柱,先用水洗脱至洗脱液呈近无色,再用3BV的80%乙醇洗脱,收集80%乙醇洗脱液,回收乙醇,浓缩,减压干燥(80℃,-0.09MPa),即得灯盏细辛总咖啡酸酯提取物,其总咖啡酸酯含量为85%。
本实施例中药注射剂(水针)通过下述方法制得:
(1)、取所述配比的灯盏细辛总黄酮提取物和灯盏细辛总咖啡酸酯提取物,加入50倍量注射用水混悬后,用0.5mol/L氢氧化钠调pH值约为8左右,使提取物溶解澄明,得灯盏细辛总黄酮和总咖啡酸酯提取物溶液;
(2)、取所述配比的人参茎叶总皂苷提取物,加入10倍量注射用水溶解,得人参茎叶总皂苷提取物溶液;
(3)、将上述(1)的灯盏细辛总黄酮和总咖啡酸酯提取物溶液、和(2)的人参茎叶总皂苷提取物溶液混匀,得混合提取物溶液;
(4)、另取相当于灯盏细辛总黄酮提取物、灯盏细辛总咖啡酸酯提取物和人参茎叶总皂苷提取物总重量80%的焦亚硫酸钠,用5倍量注射用水溶解,与上述(3)的混合提取物溶液混匀,用0.5mol/L氢氧化钠调pH至6.3~6.8,按0.2g/100ml加入活性炭,再加10%乙醇至总提取物浓度约为1.25g/100ml,搅拌10分钟,分别用0.45μm、0.22μm的微孔滤膜滤过,滤液按10ml/支分装入西林瓶,加盖丁基胶塞及铝盖,115℃热压灭菌30分钟,贴标签,检验,即得。
实施例2
本实施例为由下述重量份配比的中药提取物制成的中药注射剂(水针):
人参茎叶总皂苷提取物20份,灯盏细辛总黄酮提取物15份,灯盏细辛总咖啡酸酯提取物2份。
其中:
人参茎叶总皂苷提取物为通过下述方法从中药材人参茎叶中提取制得的物质:
①水提:取人参茎叶药材,粉碎,加10倍量水提取2次,第一次2小时,第2次1小时,合并水提液,浓缩至药材重量的1/3;
②醇沉:在上述①浓缩后的水提液中加入乙醇使乙醇浓度达到85%,4℃冷藏,静置24小时以上,滤过,将滤液回收乙醇,再滤过;
③过大孔树脂柱:将上述②处理后的药液以0.7BV/h的速度通过AB-8大孔吸附树脂柱,先用水洗至洗脱液呈近无色,弃去水洗脱液;继续用15%乙醇洗脱至洗脱液呈近无色,弃去15%乙醇洗脱液;再用5BV的50%乙醇洗脱,收集50%乙醇洗脱液;
④丙酮沉淀:在上述③收集的50%乙醇洗脱液中加入乙醇使含醇量为85%,静置24小时,滤过,滤液回收乙醇,按0.7g/100ml加入活性炭,煮沸20分钟,滤过,滤液浓缩,加入1倍量丙酮,搅拌,静置40分钟,滤过,将滤渣干燥,得人参茎叶总皂苷提取物,其总皂苷含量为82%。
灯盏细辛总黄酮提取物和灯盏细辛总咖啡酸酯提取物为通过下述方法从灯盏细辛中提取制得的物质:
①碱溶液渗漉提取:取灯盏细辛药材,铡碎,加入1%碳酸钠溶液浸泡3小时后,以40-50ml/min.kg速度渗滤提取,收集相当于药材重量15倍量的渗漉液;
②过大孔树脂柱:将上述①收集的渗漉液以1BV/h的速度通过D101大孔吸附树脂,先用水洗脱至洗脱液呈近无色,弃去水洗脱液;再用1.5BV 90%乙醇洗脱,收集90%乙醇洗脱液;
③第一次酸沉:将上述②收集的90%乙醇洗脱液回收乙醇,用20%盐酸溶液调pH值为1-2,4℃冷藏,静置12小时以上,滤过,酸沉后的滤液和沉淀分别备用;
④提取总黄酮:取上述③酸沉后的沉淀,用少量水洗涤1次,再用少量95%乙醇洗涤1次,再加入8倍量水,使沉淀混悬,用10%碳酸氢钠溶液调pH值为7-8使溶解,放置12小时以上,滤过,滤液用20%盐酸溶液调pH值为1-2,4℃冷藏,静置12小时以上,滤过,将沉淀用少量水洗涤2次,再用少量60%乙醇洗涤3次,再加入8倍量水,使沉淀混悬,用10%碳酸氢钠溶液调pH值为7-8使溶解,按0.7g/100ml加入活性炭,煮沸10分钟,滤过,滤液用20%盐酸溶液调pH值为1-2,4℃冷藏,静置12小时以上,滤过,取沉淀用少量水洗涤3次,再用少量60%乙醇洗涤2次,减压干燥(80℃,-0.09MPa),即得灯盏细辛总黄酮提取物,其总黄酮含量为85%;
⑤提取总咖啡酸酯:取上述③酸沉后的滤液,用10%碳酸氢钠溶液调节pH值为7.5左右,并浓缩至约为药材重量的1/4,加入乙醇至含醇量为90%,4℃冷藏,放置12小时以上,滤过,滤液回收乙醇,以2 BV/h的速度通过聚酰胺树脂柱,先用水洗脱至洗脱液呈近无色,再用5BV的60%乙醇洗脱,收集60%乙醇洗脱液,回收乙醇,浓缩,减压干燥(80℃,-0.09MPa),即得灯盏细辛总咖啡酸酯提取物,其总咖啡酸酯含量为84%。
本实施例中药注射剂(水针)通过下述方法制得:
(1)、取所述配比的灯盏细辛总黄酮提取物和灯盏细辛总咖啡酸酯提取物,加入约40倍量注射用水混悬后,用0.2mol/L氢氧化钠调pH值约为7-8,使提取物溶解澄明,得灯盏细辛总黄酮和总咖啡酸酯提取物溶液;
(2)、取所述配比的人参茎叶总皂苷提取物,加入约12倍量注射用水溶解,得人参茎叶总皂苷提取物溶液;
(3)、将上述(1)的灯盏细辛总黄酮和总咖啡酸酯提取物溶液、和(2)的人参茎叶总皂苷提取物溶液混匀,得混合提取物溶液;
(4)、另取相当于灯盏细辛总黄酮提取物、灯盏细辛总咖啡酸酯提取物和人参茎叶总皂苷提取物总重量85%的亚硫酸钠,用约6倍量注射用水溶解,与上述提取物溶液混匀,用0.2mol/L氢氧化钠调pH至6.5~7.0,按0.3g/100ml加入活性炭,再加10%乙醇至总提取物浓度约为2.5g/100ml,搅拌10分钟,分别用0.45μm、0.22μm的微孔滤膜滤过,滤液按10ml/支分装入安瓿,熔封,115℃热压灭菌30分钟,贴标签,检验,即得。
实施例3
本实施例为由下述重量份配比的中药提取物制成的中药注射剂(水针):
人参茎叶总皂苷提取物15份,灯盏细辛总黄酮提取物1份,灯盏细辛总咖啡酸酯提取物15份。
其中:
人参茎叶总皂苷提取物为通过下述方法从中药材人参茎叶中提取制得的物质:
①水提:取人参茎叶药材,粉碎,加12倍量水提取3小时,将水提液浓缩至药材重量的1/4;
②醇沉:在上述①浓缩后的水提液中加入乙醇使乙醇浓度达到60%,4℃冷藏,静置36小时,滤过,将滤液回收乙醇,再滤过;
③过大孔树脂柱:将上述②处理后的药液以0.6BV/h的速度通过HPD100大孔吸附树脂柱,先用水洗至洗脱液呈近无色,弃去水洗脱液;继续用5%乙醇洗脱至洗脱液呈近无色,弃去5%乙醇洗脱液;再用4BV的70%乙醇洗脱,收集70%乙醇洗脱液;
④丙酮沉淀:在上述③收集的70%乙醇洗脱液中加入乙醇使含醇量为90%,静置36小时,滤过,滤液回收乙醇,按0.1g/100ml加入活性炭,煮沸30分钟,滤过,滤液浓缩,加入1.5倍量丙酮,搅拌,静置20分钟,滤过,将滤渣干燥,得人参茎叶总皂苷提取物,其总皂苷含量为83%。
灯盏细辛总黄酮提取物和灯盏细辛总咖啡酸酯提取物为通过下述方法从灯盏细辛中提取制得的物质:
①碱溶液渗漉提取:取灯盏细辛药材,铡碎,加入1%碳酸氢钠溶液浸泡5小时后,以15-25ml/min.kg速度渗滤提取,收集相当于药材重量10倍量的渗漉液;
②过大孔树脂柱:将上述①收集的渗漉液以3BV/h的速度通过X-5大孔吸附树脂,先用水洗脱至洗脱液呈近无色,弃去水洗脱液;再用2BV 70%乙醇洗脱,收集70%乙醇洗脱液;
③第一次酸沉:将上述②收集的70%乙醇洗脱液回收乙醇,用30%盐酸溶液调pH值为0.5-1,4℃冷藏,静置12小时以上,滤过,酸沉后的滤液和沉淀分别备用;
④提取总黄酮:取上述③酸沉后的沉淀,用少量水洗涤3次,再加入8倍量水,使沉淀混悬,用5%碳酸氢钠溶液调pH值为8-9使溶解,放置12小时以上,滤过,滤液用30%盐酸溶液调pH值为0.5-1,4℃冷藏,静置12小时以上,滤过,将沉淀用少量水洗涤3次,按0.1g/100ml加入活性炭,煮沸15分钟,滤过,滤液用30%盐酸溶液调pH值为0.5-1,4℃冷藏,静置12小时以上,滤过,取沉淀用少量水洗涤3次,减压干燥(80℃,-0.09MPa),即得灯盏细辛总黄酮提取物,其总黄酮含量为82%;
⑤提取总咖啡酸酯:取上述③酸沉后的滤液,用5%碳酸氢钠溶液调节pH值为6.5左右,并浓缩至约为药材重量的1/5,加入乙醇至含醇量为60%,4℃冷藏,放置12小时以上,滤过,滤液回收乙醇,以1BV/h的速度通过聚酰胺树脂柱,先用水洗脱至洗脱液呈近无色,再用4BV的60%乙醇洗脱,收集60%乙醇洗脱液,回收乙醇,浓缩,减压干燥(80℃,-0.09MPa),即得灯盏细辛总咖啡酸酯提取物,其总咖啡酸酯含量为81%。
本实施例中药注射剂(水针)通过下述方法制得:
(1)、取所述配比的灯盏细辛总黄酮提取物和灯盏细辛总咖啡酸酯提取物,加入约30倍量注射用水混悬后,用1.0mol/L碳酸氢钠调pH值约为8-9,使提取物溶解澄明,得灯盏细辛总黄酮和总咖啡酸酯提取物溶液;
(2)、取所述配比的人参茎叶总皂苷提取物,加入约5倍量注射用水溶解,得人参茎叶总皂苷提取物溶液;
(3)、将上述(1)的灯盏细辛总黄酮和总咖啡酸酯提取物溶液、和(2)的人参茎叶总皂苷提取物溶液混匀,得混合提取物溶液;
(4)、另取相当于灯盏细辛总黄酮提取物、灯盏细辛总咖啡酸酯提取物和人参茎叶总皂苷提取物总重量90%的维生素C,用3倍量注射用水溶解,与上述(3)的混合提取物溶液混匀,用0.2mol/L碳酸氢钠调pH至7.0~7.5,按0.05g/100ml加入活性炭,再加15%乙醇至总提取物浓度约为0.75g/100ml,搅拌10分钟,分别用0.45μm、0.22μm的微孔滤膜滤过,滤液按10ml/支分装入西林瓶,加盖丁基胶塞及铝盖,115℃热压灭菌30分钟,贴标签,检验,即得。
实施例4
本实施例为由下述重量份配比的中药提取物制成的中药注射剂(水针):
人参总皂苷提取物l份,灯盏细辛总黄酮提取物5份,灯盏细辛总咖啡酸酯提取物20份。
其中:
人参总皂苷提取物为通过下述方法从中药材人参中提取制得的物质:
①水提:取人参药材,粉碎,加8倍量水提取2次,每次2小时,合并水提液,浓缩至药材重量的1/2;
②醇沉:在上述①浓缩后的水提液中加入乙醇使乙醇浓度达到75%,4℃冷藏,静置24小时以上,滤过,将滤液回收乙醇,再滤过;
③过大孔树脂柱:将上述②处理后的药液以0.5BV/h的速度通过X-5大孔吸附树脂柱,先用水洗至洗脱液呈近无色,弃去水洗脱液;继续用20%乙醇洗脱至洗脱液呈近无色,弃去20%乙醇洗脱液;再用3BV的95%乙醇洗脱,收集95%乙醇洗脱液;
④丙酮沉淀:将上述③收集的95%乙醇洗脱液回收乙醇,按0.4g/100ml加入活性炭,煮沸15分钟,滤过,滤液浓缩,加入2倍量丙酮,搅拌,静置30分钟,滤过,将滤渣干燥,得人参总皂苷提取物,其总皂苷含量为81%。
灯盏细辛总黄酮提取物和灯盏细辛总咖啡酸酯提取物为通过下述方法从灯盏细辛中提取制得的物质:
①碱溶液渗漉提取:取灯盏细辛药材,铡碎,加入15%碳酸氢钠溶液浸泡1小时后,以20-30ml/min.kg速度渗滤提取,收集相当于药材重量8倍量的渗漉液;
②过大孔树脂柱:将上述①收集的渗漉液以3BV/h的速度通过AB-8大孔吸附树脂,先用水洗脱至洗脱液呈近无色,弃去水洗脱液;再用4BV 50%乙醇洗脱,收集50%乙醇洗脱液;
③第一次酸沉:将上述②收集的50%乙醇洗脱液回收乙醇,用10%盐酸溶液调pH值为4-5,4℃冷藏,静置12小时以上,滤过,酸沉后的滤液和沉淀分别备用;
④提取总黄酮:取上述③酸沉后的沉淀,用少量水洗涤2次,再用少量80%乙醇洗涤2次,再加入6倍量水,使沉淀混悬,用2%氢氧化钠溶液调pH值为7-8使溶解,放置12小时以上,滤过,滤液用10%盐酸溶液调pH值为4-5,4℃冷藏,静置12小时以上,滤过,将沉淀用少量水洗涤2次,再用少量80%乙醇洗涤2次,再加入6倍量水,使沉淀混悬,用2%氢氧化钠溶液调pH值为7-8使溶解,放置12小时以上,滤过,滤液用10%盐酸溶液调pH值为4-5,4℃冷藏,静置12小时以上,滤过,将沉淀用少量水洗涤2次,再用少量80%乙醇洗涤2次,再加入6倍量水,使沉淀混悬,用2%氢氧化钠溶液调pH值为7-8使溶解,按0.5g/100ml加入活性炭,煮沸10分钟,滤过,滤液用10%盐酸溶液调pH值为4-5,4℃冷藏,静置12小时以上,滤过,取沉淀用少量水洗涤3次,再用少量80%乙醇洗涤3次,减压干燥(80℃,-0.09MPa),即得灯盏细辛总黄酮提取物,其总黄酮含量为84%;
⑤提取总咖啡酸酯:取上述③酸沉后的滤液,用2%氢氧化钠溶液调节pH值为7.0左右,并浓缩至约为药材重量的1/5,加入乙醇至含醇量为75%,4℃冷藏,放置12小时以上,滤过,滤液回收乙醇,以1BV/h的速度通过聚酰胺树脂柱,先用水洗脱至洗脱液呈近无色,再用4 BV的75%乙醇洗脱,收集75%乙醇洗脱液,回收乙醇,浓缩,减压干燥(80℃,-0.09MPa),即得灯盏细辛总咖啡酸酯提取物,其总咖啡酸酯含量为82%。
本实施例中药注射剂(水针)通过下述方法制得:
(1)、取所述配比的灯盏细辛总黄酮提取物和灯盏细辛总咖啡酸酯提取物,加入约60倍量注射用水混悬后,用1mol/L氢氧化钠调pH值约为9-10,使提取物溶解澄明,得灯盏细辛总黄酮和总咖啡酸酯提取物溶液;
(2)、取所述配比的人参总皂苷提取物,加入约6倍量注射用水溶解,得人参总皂苷提取物溶液;
(3)、将上述(1)的灯盏细辛总黄酮和总咖啡酸酯提取物溶液、和(2)的人参总皂苷提取物溶液混匀,得混合提取物溶液;
(4)、另取相当于灯盏细辛总黄酮提取物、灯盏细辛总咖啡酸酯提取物和人参总皂苷提取物总重量20%的焦亚硫酸钠,用4倍量注射用水溶解,与上述(3)的混合提取物溶液混匀,用0.2mol/L盐酸调pH至6.0~6.5,按0.2g/100ml加入活性炭,再加5%乙醇至总提取物浓度约为1.25g/100ml,搅拌10分钟,分别用0.45μm、0.22μm的微孔滤膜滤过,滤液按5ml/支分装入西林瓶,加盖丁基胶塞及铝盖,115℃热压灭菌30分钟,贴标签,检验,即得。
实施例5
本实施例为由下述重量份配比的中药提取物制成的中药注射剂(水针):
人参茎叶总皂苷提取物2份,灯盏细辛总黄酮提取物20份,灯盏细辛总咖啡酸酯提取物15份。
其中:
人参茎叶总皂苷提取物为通过下述方法从人参茎叶中提取制得的物质:
①水提:取人参茎叶药材,粉碎,加10倍量水提取3次,每次1.5小时,合并水提液,浓缩至药材重量的1/2;
②醇沉:在上述①浓缩后的水提液中加入乙醇使乙醇浓度达到65%,4℃以下冷藏,静置24小时以上,滤过,将滤液回收乙醇,再滤过;
③过大孔树脂柱:将上述②处理后的药液以0.4BV/h的速度通过D101大孔吸附树脂柱,先用水洗至洗脱液呈近无色,弃去水洗脱液;继续用10%乙醇洗脱至洗脱液呈近无色,弃去10%乙醇洗脱液;再用3BV的80%乙醇洗脱,收集80%乙醇洗脱液;
④丙酮沉淀:将上述③收集的80%乙醇洗脱液回收乙醇,按0.6g/100ml加入活性炭,煮沸10分钟,滤过,滤液浓缩,加入3倍量丙酮,搅拌,静置30分钟,滤过,将滤渣干燥,即得人参茎叶总皂苷提取物,其总皂苷含量为82%。
灯盏细辛总黄酮提取物和灯盏细辛总咖啡酸酯提取物为通过下述方法从灯盏细辛中提取制得的物质:
①碱溶液渗漉提取:取灯盏细辛药材,铡碎,加入20%氢氧化钠溶液浸泡2小时后,以5-15ml/min.kg速度渗滤提取,收集相当于药材重量5倍量的渗漉液;
②过大孔树脂柱:将上述①收集的渗漉液以2BV/h的速度通过HPD100大孔吸附树脂,先用水洗脱至洗脱液呈近无色,弃去水洗脱液;再用3BV 95%乙醇洗脱,收集95%乙醇洗脱液;
③第一次酸沉:将上述②收集的95%乙醇洗脱液回收乙醇,用10%硫酸溶液调pH值为2-3,4℃冷藏,静置12小时,滤过,酸沉后的滤液和沉淀分别备用;
④提取总黄酮:取上述③酸沉后的沉淀,用少量水洗涤2次,再加入10倍量水,使沉淀混悬,用5%氢氧化钠溶液调pH值为8左右使溶解,按0.3g/100ml加入活性炭,煮沸15分钟,滤过,滤液用20%硫酸溶液调pH值为2-3,4℃冷藏,放置12小时,滤过,将沉淀用少量水洗涤2次,再用少量50%乙醇洗涤3次,减压干燥(80℃,-0.09MPa),即得灯盏细辛总黄酮提取物,其总黄酮含量为82%;
⑤提取总咖啡酸酯:取上述③酸沉后的滤液,用10%碳酸钠溶液调节pH值为7.0左右,并浓缩至约为药材重量的1/5,以0.8BV/h的速度通过聚酰胺树脂柱,先用水洗脱至洗脱液呈近无色,再用3BV的85%乙醇洗脱,收集85%乙醇洗脱液,回收乙醇,浓缩,减压干燥(80℃,-0.09MPa),即得灯盏细辛总咖啡酸酯提取物,其总咖啡酸酯含量为75%。
本实施例中药注射剂(水针)通过下述方法制得:
(1)、取所述配比的灯盏细辛总黄酮提取物和灯盏细辛总咖啡酸酯提取物,加入20倍量注射用水混悬后,用0.5mol/L氢氧化钠调pH值约为11左右,使提取物溶解澄明,得灯盏细辛总黄酮和总咖啡酸酯提取物溶液;
(2)、取所述配比的人参茎叶总皂苷提取物,加入20倍量注射用水溶解,得人参茎叶总皂苷提取物溶液;
(3)、将上述(1)的灯盏细辛总黄酮和总咖啡酸酯提取物溶液、和(2)的人参茎叶总皂苷提取物溶液混匀,得混合提取物溶液;
(4)、另取相当于灯盏细辛总黄酮提取物、灯盏细辛总咖啡酸酯提取物和人参茎叶总皂苷提取物总重量50%的半胱氨酸,用8倍量注射用水溶解,与上述(3)的混合提取物溶液混匀,用0.5mol/L硫酸调pH至6.5~7.0,按0.7g/100ml加入活性炭,再加8%乙醇至总提取物浓度约为2.5g/100ml,搅拌10分钟,分别用0.45μm、0.22μm的微孔滤膜滤过,滤液按5ml/支分装入西林瓶,加盖丁基胶塞及铝盖,115℃热压灭菌30分钟,贴标签,检验,即得。
实施例6
本实施例为由下述重量份配比的中药提取物制成的中药注射剂(水针):
人参总皂苷提取物5份,灯盏细辛总黄酮提取物2份,灯盏细辛总咖啡酸酯提取物10份。
其中:
人参总皂苷提取物为通过下述方法从人参中提取制得的物质:
①水提:取人参药材,粉碎,加8倍量水提取2次,每次1小时,合并水提液,浓缩至药材重量的1/2;
②醇沉:在上述①浓缩后的水提液中加入乙醇使乙醇浓度达到80%,4℃以下冷藏,静置24小时以上,滤过,将滤液回收乙醇,再滤过;
③过大孔树脂柱:将上述②处理后的药液以0.5BV/h的速度通过D101大孔吸附树脂柱,先用水洗至洗脱液呈近无色,弃去水洗脱液;继续用10%乙醇洗脱至洗脱液呈近无色,弃去10%乙醇洗脱液;再用5BV的65%乙醇洗脱,收集65%乙醇洗脱液;
④丙酮沉淀:在上述③收集的65%乙醇洗脱液中加入乙醇使含醇量为80%,静置24小时,滤过,滤液回收乙醇,按0.2g/100ml加入活性炭,煮沸10分钟,滤过,滤液浓缩,加入2倍量丙酮,搅拌,静置30分钟,滤过,将滤渣干燥,即得人参总皂苷提取物,其总皂苷含量为82%。
灯盏细辛总黄酮提取物和灯盏细辛总咖啡酸酯提取物为通过下述方法从灯盏细辛中提取制得的物质:
①碱溶液渗漉提取:取灯盏细辛药材,加入10%碳酸钠溶液浸泡2小时后,以10-20ml/min.kg速度渗滤提取,收集相当于药材重量12倍量的渗漉液;
②过大孔树脂柱:将上述①收集的渗漉液以2BV/h的速度通过D101大孔吸附树脂,先用水洗脱至洗脱液呈近无色,弃去水洗脱液;再用3BV 75%乙醇洗脱,收集75%乙醇洗脱液;
③第一次酸沉:将上述②收集的75%乙醇洗脱液回收乙醇,用20%硫酸溶液调pH值为3-4,4℃冷藏,静置12小时,滤过,酸沉后的滤液和沉淀分别备用;
④提取总黄酮:取上述③酸沉后的沉淀,用少量水洗涤3次,再用少量70%乙醇洗涤3次,减压干燥(80℃,-0.09MPa),即得灯盏细辛总黄酮提取物,其总黄酮含量为86%;
⑤提取总咖啡酸酯:取上述③酸沉后的滤液,用10%碳酸氢钠溶液调节pH值为7.0左右,并浓缩至约为药材重量的1/5,加入乙醇至含醇量为70%,4℃冷藏,放置12小时,滤过,滤液回收乙醇,以0.6BV/h的速度通过聚酰胺树脂柱,先用水洗脱至洗脱液呈近无色,再用5BV的70%乙醇洗脱,收集70%乙醇洗脱液,回收乙醇,浓缩,减压干燥(80℃,-0.09MPa),即得灯盏细辛总咖啡酸酯提取物,其总咖啡酸酯含量为81%。
本实施例中药注射剂(水针)通过下述方法制得:
(1)、取所述配比的灯盏细辛总黄酮提取物和灯盏细辛总咖啡酸酯提取物,加入10倍量注射用水混悬后,用0.8mol/L氢氧化钠调pH值约为12左右,使提取物溶解澄明,得灯盏细辛总黄酮和总咖啡酸酯提取物溶液;
(2)、取所述配比的人参总皂苷提取物,加入15倍量注射用水溶解,得人参总皂苷提取物溶液;
(3)、将上述(1)的灯盏细辛总黄酮和总咖啡酸酯提取物溶液、和(2)的人参总皂苷提取物溶液混匀,得混合提取物溶液;
(4)、另取相当于灯盏细辛总黄酮提取物、灯盏细辛总咖啡酸酯提取物和人参总皂苷提取物总重量70%的焦亚硫酸钠,用10倍量注射用水溶解,与上述(3)的混合提取物溶液混匀,用0.5mol/L盐酸调pH至6.3~6.8,按0.5g/100ml加入活性炭,再加12%乙醇至总提取物浓度约为2.5g/100ml,搅拌10分钟,分别用0.45μm、0.22μm的微孔滤膜滤过,滤液按2.5ml/支分装入安瓿,熔封,115℃热压灭菌30分钟,贴标签,检验,即得。
实施例7
本实施例为由下述重量份配比的中药提取物制成的中药注射剂(水针):
人参茎叶总皂苷提取物18份,灯盏细辛总黄酮提取物7份,灯盏细辛总咖啡酸酯提取物8份。
其中:
人参茎叶总皂苷提取物为通过下述方法从人参茎叶中提取制得的物质:
①水提:取人参茎叶药材,加10倍量水提取3次,每次.5小时,合并水提液,浓缩至药材重量的1/2;
②醇沉:在上述①浓缩后的水提液中加入乙醇使乙醇浓度达到65%,4℃以下冷藏,静置24小时以上,滤过,将滤液回收乙醇,再滤过;
③过大孔树脂柱:将上述②处理后的药液以0.5BV/h的速度通过D101大孔吸附树脂柱,先用水洗至洗脱液呈近无色,弃去水洗脱液;继续用10%乙醇洗脱至洗脱液呈近无色,弃去10%乙醇洗脱液;再用2BV的95%乙醇洗脱,收集95%乙醇洗脱液;将95%乙醇洗脱液回收乙醇,浓缩,干燥,即得人参茎叶总皂苷提取物,其总皂苷含量为68%。
灯盏细辛总黄酮提取物和灯盏细辛总咖啡酸酯提取物为通过下述方法从灯盏细辛中提取制得的物质:
①碱溶液渗漉提取:取灯盏细辛药材,加入10%氢氧化钠溶液浸泡2小时后,以10-20ml/min.kg速度渗滤提取,收集相当于药材重量8倍量的渗漉液;
②过大孔树脂柱:将上述①收集的渗漉液以2BV/h的速度通过HPD100大孔吸附树脂,先用水洗脱至洗脱液呈近无色,弃去水洗脱液;再用3BV 60%乙醇洗脱,收集60%乙醇洗脱液;
③第一次酸沉:将上述②收集的60%乙醇洗脱液回收乙醇,用10%硫酸溶液调pH值为2-3,4℃冷藏,静置12小时,滤过,酸沉后的滤液和沉淀分别备用;
④提取总黄酮:取上述③酸沉后的沉淀,用少量水洗涤2次,再用少量50%乙醇洗涤3次,减压干燥(80℃,-0.09MPa),即得灯盏细辛总黄酮提取物,其总黄酮含量为72%;
⑤提取总咖啡酸酯:取上述③酸沉后的滤液,用10%碳酸钠溶液调节pH值为7.0左右,滤过,浓缩,减压干燥(80℃,-0.09MPa),即得灯盏细辛总咖啡酸酯提取物,其总咖啡酸酯含量为63%。
本实施例中药注射剂(水针)通过下述方法制得:
(1)、取所述配比的灯盏细辛总黄酮提取物和灯盏细辛总咖啡酸酯提取物,加入30倍量注射用水混悬后,用0.5mol/L氢氧化钠调pH值约为8左右,使提取物溶解澄明,得灯盏细辛总黄酮和总咖啡酸酯提取物溶液;
(2)、取所述配比的人参茎叶总皂苷提取物,加入15倍量注射用水溶解,得人参茎叶总皂苷提取物溶液;
(3)、将上述(1)的灯盏细辛总黄酮和总咖啡酸酯提取物溶液、和(2)的人参茎叶总皂苷提取物溶液混匀,得混合提取物溶液;
(4)、另取相当于灯盏细辛总黄酮提取物、灯盏细辛总咖啡酸酯提取物和人参茎叶总皂苷提取物总重量75%的焦亚硫酸钠,用10倍量注射用水溶解,与上述(3)的混合提取物溶液混匀,用0.1mol/L氢氧化钠调pH至6.5~7.0,按0.4g/100ml加入活性炭,再加10%乙醇至总提取物浓度约为1.25g/100ml,搅拌10分钟,分别用0.45μm、0.22μm的微孔滤膜滤过,滤液按10ml/支分装入西林瓶,加盖丁基胶塞及铝盖,115℃热压灭菌30分钟,贴标签,检验,即得。
实施例8
本实施例为由下述重量份配比的中药提取物制成的中药注射剂(水针):
人参茎叶总皂苷提取物16份,灯盏细辛总黄酮提取物11份,灯盏细辛总咖啡酸酯提取物6份。
其中:
人参茎叶总皂苷提取物为通过下述方法从人参茎叶中提取制得的物质:
①水提:取人参茎叶药材,加10倍量水提取3次,每次.5小时,合并水提液,浓缩至药材重量的l/2;
②醇沉:在上述①浓缩后的水提液中加入乙醇使乙醇浓度达到65%,4℃以下冷藏,静置24小时以上,滤过,将滤液回收乙醇,再滤过;在滤液中再加入乙醇使乙醇浓度达到85%,4℃以下冷藏,静置24小时以上,滤过,将滤液回收乙醇,浓缩,干燥,即得人参茎叶总皂苷提取物,其总皂苷含量为52%。
灯盏细辛总黄酮提取物和灯盏细辛总咖啡酸酯提取物为通过下述方法从灯盏细辛中提取制得的物质:
①碱溶液渗漉提取:取灯盏细辛药材,加入10%氢氧化钠溶液浸泡2小时后,以10-20ml/min.kg速度渗滤提取,收集相当于药材重量8倍量的渗漉液;
②醇沉:在上述①收集的渗漉液中加入乙醇使乙醇浓度达到60%,4℃以下冷藏,静置24小时以上,滤过,收集滤液;
③第一次酸沉:将上述②收集的滤液回收乙醇,用10%硫酸溶液调pH值为4-5,4℃冷藏,静置12小时,滤过,酸沉后的滤液和沉淀分别备用;
④提取总黄酮:取上述③酸沉后的沉淀,用少量水洗涤2次,再用少量50%乙醇洗涤3次,减压干燥(80℃,-0.09MPa),即得灯盏细辛总黄酮提取物,其总黄酮含量为59%;
⑤提取总咖啡酸酯:取上述③酸沉后的滤液,用10%碳酸钠溶液调节pH值为7.0左右,滤过,浓缩,减压干燥(80℃,-0.09MPa),即得灯盏细辛总咖啡酸酯提取物,其总咖啡酸酯含量为53%。
本实施例中药注射剂(水针)通过下述方法制得:
(1)、取所述配比的灯盏细辛总黄酮提取物和灯盏细辛总咖啡酸酯提取物,加入约45倍量注射用水混悬后,用1.0mol/L碳酸氢钠调pH值约为8-9,使提取物溶解澄明,得灯盏细辛总黄酮和总咖啡酸酯提取物溶液;
(2)、取所述配比的人参茎叶总皂苷提取物,加入约10倍量注射用水溶解,得人参茎叶总皂苷提取物溶液;
(3)、将上述(1)的灯盏细辛总黄酮和总咖啡酸酯提取物溶液、和(2)的人参茎叶总皂苷提取物溶液混匀,得混合提取物溶液;
(4)、另取相当于灯盏细辛总黄酮提取物、灯盏细辛总咖啡酸酯提取物和人参茎叶总皂苷提取物总重量75%的亚硫酸钠,用6倍量注射用水溶解,与上述(3)的混合提取物溶液混匀,用0.1mol/L碳酸氢钠调pH至6.3~6.8,按0.3g/100ml加入活性炭,再加12%乙醇至总提取物浓度约为2.5g/100ml,搅拌15分钟,分别用0.45μm、0.22μm的微孔滤膜滤过,滤液按5ml/支分装入西林瓶,加盖丁基胶塞及铝盖,115℃热压灭菌30分钟,贴标签,检验,即得。
发明人以上述实施例1制得的本发明药物注射液(水针)为实验药物,按照国家食品药品监督局《药品注册管理办法》的规定要求,设计试验方案,进行了下述主要药效学试验研究(对沙土鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用、对局灶性脑缺血大鼠神经功能障碍的保护作用、改善小鼠微循环试验)和长期毒性试验研究:
1对沙土鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用
1.1试验材料
1.1.1药品
本发明药物:按照上述实施例4的配方和方法制得的水针,发明人自制。(试验中药物浓度均以总黄酮、总咖啡酸酯及总皂苷的总量计,下同)
阴性对照药:0.9%NaCl,四川科伦药业股份有限公司生产,批号:A061121。
阳性对照药:尼莫地平注射液,山东新华制药股份有限公司生产,批号:050108,规格:2mg/10ml/支×5支。配制方法:临用时用5%葡萄糖配成所需浓度供试验用。
1.1.2仪器
电热恒温鼓风干燥箱,上海跃进医疗器械厂出品。
电子天平,北京赛多利斯天平有限公司出品,分辨值:0.001g。
TD-5-L离心机,上海安亭科学仪器厂制造。
UV1240型紫外-可见分光光度计,日本岛津。
1.1.3试剂
MDA检测试剂盒:南京建成生物工程研究所提供,批号:20070327;
GSH-PX检测试剂盒:南京建成生物工程研究所提供,批号:20070328;
SOD检测试剂盒:南京建成生物工程研究所提供,批号:20070327;
LDH试剂盒:南京建成生物工程研究所提供,批号:20070328;
一氧化氮(N0):南京建成生物工程研究所提供,批号:20070403;
一氧化氮合酶(Nos):南京建成生物工程研究所提供,批号:20070328;
总蛋白(双缩脲法)试剂:南京建成生物工程研究所提供,批号:20070328。
1.1.4动物
沙土鼠54只,雄性,体重60~80g,由浙江省实验动物中心提供,实验动物生产许可证号:SCXK(浙)2003-0001。试验时在成都中医药大学实验动物中心实验动物观察室饲养及观察。使用许可证:SCXK(川)2004-049。
1.2方法和结果
选取沙土鼠54只,按体重随机分为6组,分别为:假手术组、模型组、阳性对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组。各组分别按表1所示药物和剂量于手术前腹腔注射连续给药10天,于第10天末次给药后30min开始手术。各组动物均在乙醚麻醉下分离双侧颈总动脉,除假手术组外各组用血管夹夹闭双侧颈总动脉,40min后开夹使血流再通,缝合待动物清醒后正常进水进食。各组于再灌注后24h断头取脑,称重。将脑均分为2份。一份取大脑皮层测定水含量,并做病理切片观察海马CA1区锥体神经元,以2个视野下的存活锥体神经元数总和来表示海马损伤的程度。另一份用0.5mol/L、PH=7.8的磷酸盐缓冲水溶液冰浴下制备10%脑组织匀浆,按试剂盒操作步骤测定匀浆中MDA、GSH-PX、LDH、SOD、NO及NOS的含量,试验结果见表2~4。
表1 对沙土鼠脑缺血再灌注损伤的神经保护作用-给药方案
组别 |
受试药物 |
药物浓度(mg/ml) |
给药体积(ml/kg) |
给药剂量(mg/kg) |
临床倍数(倍) |
给药途径 |
假手术组模型组阳性对照组高剂量组中剂量组低剂量组 |
-0.9%NaCl尼莫地平注射液本发明药物本发明药物本发明药物 |
--0.375mg1.20.60.3 |
-1010101010 |
---1.510.675.332.67 |
--201684 |
-i.pi.p.i.p.i.p.i.p. |
表2对脑再灌注损伤沙土鼠脑组织GSH-PX、LDH活力和大脑皮层含水量的影响(X±SD)
组别 |
剂量×天数(mg/kg×d) |
鼠数(只) |
GSH-PX活力(酶活力单位) |
LDH活力(U/mg) |
大脑皮层含水量(%) |
假手术组模型组阳性对照组高剂量组中剂量组低剂量组 |
----1.33×1012.0×106.0×103.0×10 |
999999 |
130.36±6.88137.30±7.88138.15±8.14126.12±5.45**128.54±6.13*135.54±6.76 |
320.23±16.94345.68±13.87△313.04±23.36**316.43±19.54**315.12±20.76**335.64±21.52 |
59.03±14.2372.53±7.5968.39±6.6162.47±9.3565.14±9.1172.97±10.03 |
注:①模型组与假手术组比较 △P<0.05 △△P<0.01 △△△P<0.001;
②各给药组与模型组比较 *P<0.05 **P<0.01 ***<0.001。
表2结果显示,本发明药物高剂量、中剂量组分别能明显和显著升高GSH-PX活力(P<0.05),且能显著降低LDH活力(P<0.05和P<0.01)。
表3对脑再灌注损伤沙土鼠脑组织NO、NOS、SOD和MDA含量的影响(X±SD)
组别 |
剂量×天数(mg/kg×d) |
鼠数(只) |
NO(umol/mg) |
NOS(U/mg) |
SOD活力(U/mg) |
MDA含量(nmol/mg) |
假手术组模型组阳性对照组高剂量组中剂量组低剂量组 |
----1.33×1012.0×106.0×103.0×10 |
999999 |
1.55±0.072.67±0.18△△△1.96±0.17***1.56±0.11***1.65±0.13***1.78±0.15*** |
11.54±1.1216.66±1.12△△△13.74±0.53**12.05±1.06***12.57±0.76***12.94±0.55*** |
47.97±9.5524.55±3.25△△44.17±8.01***43.14±6.19***40.31±7.03**37.43±7.48* |
3.85±0.324.82±0.39△△3.81±0.17**3.69±0.22***4.32±0.184.38±0.22 |
注:①模型组与假手术组比较 △P<0.05 △△P<0.01 △△△P<0.001;
②各给药组与模型组比较 *P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001。
表3结果显示,本发明药物高剂量、中剂量、低剂量组与模型组比较均能显著增加SOD活力(P<0.001,P<0.01和P<0.05)。高剂量组与模型组比能明显降低MDA含量(P<0.001)。
脑缺血再灌注后脑组织NOS活力显著升高(P<0.001),NO含量显著升高(P<0.001),对脑组织产生有害作用。本发明药物高剂量、中剂量、低剂量组与模型组比较均能显著降低脑内NO水平(P<0.001);高剂量、中剂量、低剂量组与模型组比较均能显著降低脑内NOS活性(P<0.01或P<0.05)。
表4对沙土鼠脑缺血再灌注后海马CA1区神经元密度的影响(X±SD)
组别 |
剂量×天(mg/kg×d) |
鼠数(只) |
神经元密度(个/2个高倍视野) |
假手术组模型组阳性对照组高剂量组中剂量组低剂量组 |
----1.33×1012.0×106.0×103.0×10 |
999999 |
171.89±16.84108.33±6.71△△△150.44±12.91***146.77±11.76***136.09±8.88**126.83±7.22** |
注:①模型组与假手术组比较△△△P<0.001;
②各给药组与模型组比较**P<0.01 ***P<0.001。
表4结果显示,本发明药物高剂量组、中剂量组及低剂量组分别能明显和显著减轻沙土鼠全脑缺血再灌注后海马CA1区神经元的损伤,增加其存活率(P<0.05和P<0.01)。
上述沙土鼠脑缺血再灌注损伤神经保护试验结果显示:本发明药物高剂量组、中剂量组及低剂量组与模型组比较能明显增加再灌注损伤模型动物大脑皮层SOD、GSH-PX酶活力,降低LDH活力,降低脑内NO水平和NOS活性,促进自由基的清除,减少MDA的产生,对抗脂质过氧化,降低大脑皮层水含量,减轻后海马CA1区神经元的损伤,增加其存活率,且均有统计学差异(P<0.05,P<0.01或P<0.001)。
2对局灶性脑缺血大鼠神经功能障碍的保护作用
2.1试验材料
2.1.1药品
本发明药物:按照上述实施例4的配方和方法制得的水针,发明人自制。
阴性对照药:0.9%NaCl,四川科伦药业股份有限公司生产,批号:A061121。
阳性对照药:舒血宁注射液,北京双鹤高科天然药物有限公司生产,批号:050618,规格:5ml×10支,每支含总黄酮苷4.2mg,含银杏内酯A 0.3mg,合计含4.5mg提取物/5ml。
2.1.2仪器
ACS-3H-B电子秤:中山市金利电子衡器有限公司。
SHANGPING JA2003电子天平:上海天平仪器厂。
2.1.3试剂
戊巴比妥钠:中国医药集团(上海)化学试剂公司进口分装,25g/瓶,A.R级,批号:040506。
龙胆紫:成都科龙化工试剂厂,规格:25g,批号:041011。
2.1.4动物
健康SD种大鼠,50只,雌雄各半,体重200~250g。由成都中医药大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK(川)2004-11。试验时在成都中医药大学实验动物中心实验动物观察室饲养及观察。使用许可证:SCXK(川)2004-049。
2.2方法和结果
取健康SD种大鼠50只,随机分为5组,分别为:模型组、阳性对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组。每组10只,按表5所示药物和剂量尾静脉注射给药,1次/日,连续7天。于末次给药后30min,左侧颈内动脉注射血(凝块直径小于0.1mm的血栓混悬液0.4ml)造模,此后于第2,6,12和24h采用0-3级评分标准(见表6)评定每只大鼠的意识和运动能力。在处死前,又以0-3级标准(见表7)进行神经行为学的评分。随后颈总动脉注射龙胆紫染色,处死动物,开颅取出脑组织,称全脑重,遂切下未染色的脑组织(即缺血区脑组织)称重,求出其占全脑重量的百分率,结果见表8~10。
表5对局灶性脑缺血大鼠神经功能障碍的保护作用-给药方案
组别 |
受试药物 |
药物浓度(mg/ml) |
给药体积(ml/kg) |
给药剂量(mg/kg) |
临床倍数(倍) |
给药途径 |
模型组阳性对照组高剂量组中剂量组低剂量组 |
0.9%NaCl舒血宁注射液本发明药物本发明药物本发明药物 |
-0.3751.20.60.3 |
1010101010 |
--1.510.675.332.67 |
-201684 |
i.vi.vi.vi.vi.v |
表6大鼠的意识和运动能力评分标准
评分 |
标准 |
0分1分2分3分 |
正常活动自发活动+/-触觉刺激不能唤醒疼痛刺激不能唤醒,无自发活动 |
表7 大鼠神经行为学的评分标准
评分 |
标准 |
0分1分2分3分 |
未观察到行为缺陷前肢弯曲抵抗侧推力量下降,但无旋转抵抗侧推力下降,但有旋转 |
表8改善局灶性脑缺血大鼠意识和运动能力的作用
组别 |
剂量(mg/kg) |
鼠数(只) |
大鼠的意识和运动能力评分 |
2h |
6h |
12h |
24h |
模型组阳性对照组高剂量组中剂量组低剂量组 |
--1.512.06.03.0 |
1010101010 |
2.30±0.481.60±0.51*1.49±0.46**1.54±0.62*2.17±0.46 |
1.60±0.520.80±0.42**0.74±0.33**1.43±0.441.52±0.48 |
1.00±00.50±0.52**0.50±0.44**0.70±0.360.80±0.56 |
0.70±0.480.30±0.480.30±0.480.30±0.500.40±0.42 |
注:各给药组与模型组比较*P<0.05,**P<0.01。
表8结果显示,大剂量本发明药物注射能显著改善大鼠局灶性脑缺血2~12h的意识和运动能力(P<0.01),中剂量能明显改善大鼠局灶性脑缺血2h的意识和运动能力(P<0.05)。
表9改善局灶性脑缺血大鼠神经行为学的作用
组别 |
剂量(mg/kg) |
鼠数(只) |
大鼠神经行为学评分(分,X±SD) |
模型组阳性对照组高剂量组中剂量组低剂量组 |
--1.512.06.03.0 |
1010101010 |
1.80±0.421.20±0.63*1.20±0.56*1.40±0.501.60±0.44 |
注:各给药组与模型组比较 *P<0.05 **P<0.01。
表9结果显示,大剂量本发明药物注射能显著改善大鼠局灶性脑缺血的神经行为学症状(P<0.05)。
表10本发明药物注射液减少大鼠脑缺血百分率作用(X±SD)
组别 |
剂量×天(mg/kg×d) |
鼠数(只) |
全脑重量(g) |
缺血区重量(g) |
大鼠脑缺血百分率(%) |
模型组阳性对照组高剂量组中剂量组低剂量组 |
--1.512.06.03.0 |
1010101010 |
1.74±0.141.65±0.121.82±0.131.84±0.181.77±0.23 |
0.78±0.170.46±0.12**0.44±0.18**0.52±0.20*0.66±0.21 |
45.13±9.3328.20±7.84**24.56±7.35**32.85±8.38*37.39±8.04 |
注:各给药组与模型组比较*P<0.05,**P<0.01。
表10结果显示,大、中剂量本发明药物注射能显著和明显降低局灶性脑缺血大鼠缺血区重量和脑缺血百分比(P<0.01和P<0.05),中、小剂量有作用的趋势。
上述局灶性脑缺血大鼠神经功能障碍试验结果显示:本发明药物大剂量注射能显著改善大鼠局灶性脑缺血2~12h的意识和运动能力(P<0.01);还能显著改善大鼠局灶性脑缺血的神经行为学症状(P<0.05)。中剂量注射能明显改善大鼠局灶性脑缺血2h的意识和运动能力(P<0.05);大剂量注射和中剂量注射能显著和明显降低局灶性脑缺血大鼠缺血区重量和脑缺血百分比(P<0.01和P<0.05),中、小剂量有作用的趋势。
3改善小鼠微循环试验
3.1试验材料
3.1.1药品
本发明药物:按照上述实施例4的配方和方法制得的水针,发明人自制。
阳性对照药:舒血宁注射液,北京双鹤高科天然药物有限公司生产,批号:050618,规格:5ml×10支,每支含总黄酮苷4.2mg,含银杏内酯A 0.3mg,合计含4.5mg提取物/5ml。
阴性对照药:0.9%NaCl,四川科伦药业股份有限公司生产,批号:A050506。
盐酸肾上腺素注射液(Adr):上海禾丰制药有限公司出品,批号:0503027,规格:1mg/1ml×10支。临用时用生理盐水配成0.1%(v/v)溶液备用。
3.1.2仪器
XSN-H生物显微镜,重庆光电仪器有限公司出品。
BI-2000医学图像分析系统,泰盟科技有限公司出品。
3.1.3试剂
戊巴比妥钠:佛山市化工实验厂进口分装,AR级,25g/瓶,批号:030526。用蒸馏水配成1%溶液。
3.1.4动物
昆明种小鼠,雌雄各半,体重18~22g,健康一级动物,由成都中医药大学实验动物中心提供,合格证号:SCXK(川)2004-11。试验时在成都中医药大学实验动物中心实验动物观察室饲养及观察。使用许可证:SCXK(川)2004-049。
3.2方法和结果
取昆明种小鼠60只,体重18~22g,随机分为6组,分别为:空白对照组、模型组、阳性对照组、高剂量组、中剂量组、低剂量组。每组10只,雌雄各半。实验时分别腹腔注射0.3%戊巴比妥钠0.1ml/10g麻醉,然后将小鼠俯卧位固定在小鼠观察台上,滴加少许香柏油于耳廓表面,使耳廓平铺于耳拖上,置显微镜载物台上。尾静脉注射0.1%Adr 10ml/kg,同时按表11所示药物和剂量尾静脉注射给药一次,然后用40倍镜观察给药前及给药后1min、5min、10min、15min耳廓微循环的微血管管径、血液流态(参照表12评分标准)、血液流速及毛细血管开放数量的情况,实验结果见表13~17。
表11 对局灶性脑缺血大鼠神经功能障碍的保护作用-给药方案
组别 |
受试药物 |
药物浓度(mg/ml) |
给药体积(ml/kg) |
给药剂量(mg/kg) |
临床倍数(倍) |
给药途径 |
空白对照组模型组阳性对照组高剂量组中剂量组低剂量组 |
-0.9%NaCl舒血宁注射液本发明药物注射液本发明药物注射液本发明药物注射液 |
--0.3751.360.680.34 |
-1010101010 |
---1.51263 |
--201894.5 |
-i.vi.vi.vi.vi.v |
表12血液流态评分标准
分级 |
0级 |
1级 |
2级 |
3级 |
4级 |
5级 |
6级 |
流速分值 |
线流0分 |
线粒流1分 |
粒线流2分 |
粒流3分 |
粒缓流4分 |
粒摆流5分 |
停流6分 |
表13本发明药物注射液对小鼠耳廓毛细血管网交点开放数的影响(x±SD)
组别 |
剂量×次(mg/kg×次) |
鼠数(只) |
耳廓微循环毛细血管网点开放数(个/视野) |
滴加Adr前 |
滴加Adr后1min |
滴加Adr后5min |
滴加Adr后10min |
滴加Adr后15min |
空白对照组模型组阳性对照组高剂量组中剂量组低剂量组 |
----1.5×113.6×16.8×13.4×1 |
101010101010 |
12.7±1.711.84±1.9712.7±1.5912.63±1.5712.48±1.3912.58±1.65 |
12.54±1.325.51±2.23△△△8.11±1.56**7.85±1.34*7.23±0.896.85±1.05 |
12.56±1.677.56±1.87△△△10±1.64**10.06±1.36**9.35±1.129.04±1.25 |
12.52±1.469.04±2.1△△△11.17±1.53*11.08±1.04*10.53±1.5410.05±1.11 |
12.34±1.1412.47±1.7812.61±1.4412.22±1.8311.85±1.3412.14±1.31 |
注:①模型组与对照组比较 △P<0.05 △△P<0.01;
②各给药组与模型组比较*P<0.05 **P<0.01。
表13显示,12mg/kg本发明药物注射液能明显促进注射盐酸肾上腺素后1min、5min小鼠耳廓毛细血管网交点开放数(P<0.05)。
表14本发明药物注射液对小鼠耳廓微循环血液流速的影响
组别 |
剂量×次(mg/kg×次) |
鼠数(只) |
耳廓微循环血液流速(μm/s,x±SD) |
滴加Adr前 |
滴加Adr后1min |
滴加Adr后5min |
滴加Adr后10min |
滴加Adr后15min |
空白对照组模型组阳性对照组高剂量组中剂量组低剂量组 |
----1.5×113.6×16.8×13.4×1 |
101010101010 |
754.26±42.01756.55±38.43744.62±51.79752.65±40.84755.36±38.89753.25±42.96 |
761.26±44.19319.04±49.7△△△378.18±72.25**383.38±40.49**353.50±43.86351.55±34.39 |
759.12±50.14385.97±55.6△△△463.55±48.88**448.46±58.23*432.43±55.11417.12±54.21 |
762.04±46.26501.5±40.74△△574.36±54.66**553.94±35.32*534.38±41.91529.53±31.80 |
764.63±48.03650.14±32.18△△680.03±52.56675.03±38.18667.04±43.53646.39±48.71 |
注:①模型组与对照组比较 △△△P<0.001;
②各给药组与模型组比较*P<0.05 **P<0.01。
表14显示,12mg/kg本发明药物注射液在滴加Adr后5min、10min能明显对抗肾上腺素所致小鼠耳廓微血管收缩,加快血流速度(P<0.05)。
表15本发明药物注射液对小鼠耳廓微循环血液流态的影响
组别 |
剂量×次(mg/kg×次) |
鼠数(只) |
耳廓微循环血液流态(分,x±SD) |
滴加Adr前 |
滴加Adr后1min |
滴加Adr后5min |
滴加Adr后10min |
滴加Adr后15min |
空白对照组模型组阳性对照组同剂量组中剂量组低剂量组 |
----1.5×113.6×16.8×13.4×1 |
101010101010 |
0±00±00±00±00±00±0 |
0±02.8±0.422△△2.3±0.483*2.3±0.534*2.5±0.5342.6±0.524 |
0±02.4±0.516△△△1.7±0.483**1.8±0.593*1.8±0.306*2.0±0.444 |
0±01.7±0.483△△1.1±0.316**1.1±0.458*1.3±0.4391.5±0.548 |
0±00.4±0.516△0.1±0.3160.4±0.5110.4±0.5110.4±0.511 |
注:①模型组与对照组比较 △△△P<0.01;
②各给药组与模型组比较*P<0.05 **P<0.01。
表15显示,12~6mg/kg本发明药物注射液在滴加Adr后5min~10min能明显改善肾上腺素所致小鼠耳廓微循环血流速度减慢(P<0.05)。
表16本发明药物注射液对小鼠耳廓微循环第三级动脉血管管径的影响
组别 |
剂量×次(mg/kg×次) |
鼠数(只) |
耳廓微循环第三级动脉血管管径(μm,x±SD) |
滴加Adr前 |
滴加Adr后1min |
滴加Adr后5min |
滴加Adr后10min |
滴加Adr后15min |
空白对照组模型组阳性对照组高剂量组中剂量组低剂量组 |
----1.5×113.6×16.8×13.4×1 |
101010101010 |
12.864±1.68412.928±1.21912.833±1.72512.784±1.38513.101±1.39212.890±1.496 |
12.886±1.4926.551±0.916△△△7.896±1.362*7.859±1.374*7.113±1.7587.107±1.439 |
12.833±2.1078.278±1.026△△△9.655±1.035**9.732±1.132**9.085±0.9979.231±1.084 |
12.96±2.31710.163±0.93△ △12.3451±.487***11.873±1.237**11.338±1.21811.073±1.087 |
12.728±1.71612.919±1.41812.444±1.34712.311±1.78413.084±1.78312.845±1.793 |
注:①模型组与对照组比较 △△P<0.01 △△△P<0.001;
②各给药组与模型组比较*P<0.05 **P<0.01。
表16显示,12mg/kg本发明药物注射液在滴加Adr后1min~10min能明显对抗肾上腺素所致小鼠耳廓微动脉血管收缩(p<0.05)。
表17本发明药物注射液对小鼠耳廓微循环第三级静脉血管管径的影响
组别 |
剂量×次(mg/kg×次) |
鼠数(只) |
耳廓微循环第三级静脉血管管径(μm,x±SD |
滴加Adr前 |
滴加Adr后1min |
滴加Adr后5min |
滴加Adr后10min |
滴加Adr后15min |
空白对照组模型组阳性对照组高剂量组中剂量组低剂量组 |
----1.5×113.6×16.8×13.4×1 |
101010101010 |
23.164±1.65823.439±2.12123.846±1.45623.547±2.38423.665±2.95323.285±1.889 |
22.856±1.69312.076±2.005△△△15.046±1.34**14.274±1.382*13.657±1.08413.332±1.143 |
22.889±1.72214.32±2.083△△△17.741±1.093***16.637±1.328**15.887±1.496*14.923±1.338 |
22.988±1.52519.49±1.974△△△21.701±2.198*21.563±1.665*18.747±1.46318.001±1.324 |
23.021±1.54221.789±0.827△22.779±1.82922.469±1.09821.778±1.34521.342±1.204 |
注:①模型组与对照组比较 △P<0.05 △△△P<0.001:
②各给药组与模型组比较*P<0.05 **P<0.01 ***P<0.001。
表17显示,12~6mg/kg本发明药物注射液在滴加Adr后1min~10min能显著或明显对抗肾上腺素所致小鼠耳廓微静脉血管收缩(P<0.01或p<0)。
上述改善小鼠微循环试验结果显示:本发明药物注射具有改善小鼠耳廓微循环功能,能明显促进注射盐酸肾上腺素后小鼠耳廓毛细血管网交点开放数,能明显对抗肾上腺素所致小鼠耳廓微血管收缩,微静脉血管收缩血,血流速度减慢,具有扩张微血管和加快血流速度的作用。
4毒性试验:
发明人还以上述实施例4所得的本发明药物注射液(水针)进行了长期毒性试验研究,结果表明:80、40、20mg/kg(高、中、低)三剂量以0.5ml/100g大鼠连续90天腹腔注射给药,各组动物各外观体征均未见异常,饲料消耗和体重增长均正常。对部分脏器系数的影响无明显的量效关系,相应脏器的病理组织镜检也未见异常,提示这种影响不是药物的毒性反应所致。对血清钾、钠、氯离子也有一定影响,但这种影响产生的变化值均很小且都在正常范围内波动,无生物学意义。
结论:在80mg·kg-1以下剂量大鼠连续90天腹腔注射给药是安全的。