CN110483552A - 一种单萜吲哚生物碱类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

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    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
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    • C07D498/22—Heterocyclic compounds containing in the condensed system at least one hetero ring having nitrogen and oxygen atoms as the only ring hetero atoms in which the condensed system contains four or more hetero rings

Abstract

本发明公开了一种单萜吲哚生物碱类化合物及其制备方法与应用，属于医药领域。这种单萜吲哚生物碱类化合物从云南萝芙木枝叶干品中分离得到，其分子式为C21H24N2O5。这种单萜吲哚生物碱类化合物结构新颖，且具有免疫抑制活性，可作为免疫抑制药物的先导化合物，应用前景广阔。该化合物的结构式如下所示：

Description

一种单萜吲哚生物碱类化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种单萜吲哚生物碱类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
云南萝芙木(Rauvolfia yunnanensis)，又名勒毒、辣多和麻三端，属于夹竹桃科萝芙木属植物，主要分布于云南、广西及贵州等地。云南萝芙木药材为云南萝芙木植物的根，主产于云南西双版纳，民间主要用于感冒发热、咽喉肿痛、头痛眩晕、癌症腹痛吐泻、风痒疥症、肝炎、肾炎水肿和蛇咬伤等症。云南萝芙木主要化学成分为单萜吲哚生物碱，主要具有降压、抗癌等药理活性，其机制是干扰DNA复制和拓扑异构酶II抑制剂。云南萝芙木是国内生产利血平的重要植物原料，由于长期的破坏性采挖，野生资源逐年减少。为了资源的持续发展和综合利用，提高该植物资源的利用效率，发明人对云南萝芙木枝叶部分的化学成分及其免疫抑制活性开展了系统研究，发现了一种结构新颖的单萜吲哚生物碱类化合物及其免疫抑制活性，特提出本专利。
发明内容
本发明的目的在于提供一种单萜吲哚生物碱类化合物及其制备方法与应用，这种单萜吲哚生物碱类化合物结构新颖，且具有免疫抑制作用，可用于制备免疫抑制剂，应用前景广阔。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种单萜吲哚生物碱类化合物，其结构式为：
一种上述单萜吲哚生物碱类化合物制备方法，其包括：
采用乙醇提取云南萝芙木枝叶后，对所得提取物中的总生物碱进行萃取，得到总生物碱；
依次采用硅胶柱层析法和ODS反相柱层析法分离纯化所述总生物碱，得到所述单萜吲哚生物碱类化合物。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述提取物的制备方法包括：将所述云南萝芙木枝叶粉碎到20～40目，以90～99％乙醇室温提取2～4次，每次36～60h，提取液合并，过滤，减压浓缩至无乙醇。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，对所述提取物中的总生物碱进行萃取的步骤包括：
用稀HCl水溶液调节所述提取物的pH至2-4，用乙酸乙酯萃取2-4次后，用NaOH调节pH至9-11，再用氯仿萃取2-4次，减压浓缩得所述总生物碱。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，采用所述硅胶柱层析法分离纯化所述总生物碱的步骤包括：
将所述总生物碱上样后，以体积比为1:0～0:1氯仿-甲醇溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集氯仿-甲醇溶液为10：1的洗脱部分，浓缩。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，采用所述ODS反相柱层析法进行分离的步骤包括：将浓缩后的所述氯仿-甲醇溶液为10：1的洗脱部分用50μm的ODS反相柱层析进行分离，以体积比为0:1～1:1的甲醇-水溶液进行梯度洗脱，收集甲醇-水溶液为3：7的洗脱部分，浓缩后用甲醇复溶，静置后，所述的单萜吲哚生物碱类化合物以白色粉末从中析出。
进一步地，在本发明较佳的实施例中，所述总生物碱在经硅胶柱层析分离前，用重量比2～3倍量的甲醇溶解后，用所述总生物碱重1.0～2.0倍的80～100目硅胶拌样。
优选地，所述稀HCl浓度为1～2M。
优选地，所述氯仿-甲醇溶液体积配比依次为1:0、50:1、20:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:1、0:1。
优选地，所述氯仿-甲醇溶液为10：1的洗脱部分浓缩蒸干后，经ODS反相硅胶柱层析前，先用甲醇溶解，再用样品质量1.5～2倍的ODS硅胶拌样。
优选地，所述甲醇-水溶液体积配比为0:1、2:8、3:7、4:6、5:5。
一种如权利要求1所述单萜吲哚生物碱类化合物在制备免疫抑制药物中的应用。
一种药物组合物，其活性成分包括上述单萜吲哚生物碱类化合物，以及药学上可接受的辅料。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的这种单萜吲哚生物碱类化合物是首次被分离出来的新化合物，通过旋光、紫外、核磁共振和质谱测定方法确定了其为单萜吲哚生物碱类化合物，并表征了具体结构。经免疫抑制活性检测试验，结果显示该化合物对T细胞增殖具有显著抑制活性，IC50值为5.9μM，由此说明该化合物具有很好的免疫抑制活性，揭示了该化合物在制备免疫抑制药物中有良好的应用前景，可作为免疫抑制药物的先导化合物，有助于自身免疫性疾病和免疫排斥的治疗。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，以下将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为该单萜吲哚生物碱类化合物的核磁共振氢谱(1H NMR)；
图2为该单萜吲哚生物碱类化合物的核磁共振碳谱(13C NMR)；
图3为该单萜吲哚生物碱类化合物的主要HMBC相关；
图4为该单萜吲哚生物碱类化合物的主要NOESY相关；
图5为该单萜吲哚生物碱类化合物对T细胞增殖抑制活性试验结果。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明提供一种单萜吲哚生物碱类化合物，其结构式为：
该单萜吲哚生物碱类化合物具有免疫抑制活性，可用于制备免疫抑制药物。因此，本发明还提供一种药物组合物，其活性成分包括该单萜吲哚生物碱类化合物，以及药学上可接受的辅料。
所述的药物组合物含有药学上各种常用添加剂(如赋形剂等)，以制成药物制剂。根据治疗目的，可将该药物组合物制成各种类型的给药单位剂型，如片剂、丸剂、粉剂、液体、混悬剂、凝胶、乳液、乳膏、颗粒剂、硬胶囊、栓剂和针剂(溶液及悬浮液，一般为注射剂)等。优选地，该药物组合物的剂型为注射剂，用于局部注射(如皮下、神经周围、关节内腔等)；或者，该药物组合物的剂型为凝胶、乳液、乳膏等，可涂覆于局部；或者，该药物组合物的剂型为片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、硬胶囊等，通过口服给药达到免疫抑制效果。
为了使片剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知的并广泛使用的赋形剂。例如，载体，如乳糖、白糖、氯化钠、葡萄糖、尿素、淀粉、碳酸钙、高岭土、结晶纤维素和硅酸等；粘合剂，如水、乙醇、丙醇、普通糖浆、葡萄糖溶液、淀粉溶液、明胶溶液，羧甲基纤维素、紫胶、甲基纤维素和磷酸钾、聚乙烯吡咯烷酮等；崩解剂，如干淀粉、藻酸钠、琼脂粉和海带粉、碳酸氢钠、碳酸钙、聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯、十二烷基硫酸钠、硬脂酸单甘酯、淀粉和乳糖等；崩解抑制剂，如白糖、甘油三硬脂酸酯、椰子油和氢化油；吸附促进剂，如季胺碱和十二烷基硫酸钠等；润湿剂，如甘油、淀粉等；吸附剂，如淀粉、乳糖、高岭土、膨润土和胶体硅酸等；以及润滑剂，如纯净的滑石，硬脂酸盐、硼酸粉和聚乙二醇等。如果需要，还可以用通常的涂渍材料使片剂作为糖衣片剂、涂明胶膜片剂、肠衣片剂、涂膜片剂、双层膜片剂及多层片剂。
为了使丸剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知的并广泛使用的赋性剂，例如，载体，如乳糖、淀粉、椰子油、硬化植物油、高岭土和滑石等；粘合剂，如阿拉伯树胶粉、黄著胶粉、明胶和乙醇等；崩解剂，如琼脂和海带粉等。
为了使栓剂形式的药物组合物成形，可使用本领域任何已知并广泛使用的赋性剂，例如、聚乙二醇、椰子油、高级醇、高级醇的酯、明胶和半合成的甘油酯等。
为了制备针剂形式的药物组合物，可将溶液和悬浮液消毒，并最好加入适量的氯化钠、葡萄糖或甘油等，制成与血液等渗压的针剂。在制备针剂时，也可使用本领域内任何常用的载体，例如，水、乙醇、丙二醇、乙氧基化的异硬脂醇、聚氧基化的异硬脂醇和聚乙烯脱水山梨醇的脂肪酸酯等。此外，还可加入通常的溶解剂、缓冲剂和止痛剂等。
本发明提供的这种单萜吲哚生物碱类化合物及其药学上可接受的盐在药物组合物中的含量无特殊限制，可在很宽的范围内进行选择，通常可为质量百分比0.1～99.9％，较佳的为质量百分比1～70％，更佳的为质量百分比1～30％。
本发明中，所述的药物组合物的给药方法没有特殊限制。可根据病人年龄、性别和其它条件及症状，选择各种剂型的制剂给药。例如，片剂、丸剂、溶液、悬浮液、乳液、颗粒剂和胶囊是口服给药；针剂可以单纯用针剂进行肌肉、皮内、皮下或腹内注射；栓剂为给药到直肠。
本发明中，可以根据服药方法、病人年龄、性别和其它条件以及症状适当地选择用药剂量。通常的给药剂量可为：约0.01～300mg药物活性成分/kg体重/天。一般来说，每个给药单位剂型可含1～200mg的药物活性成分。在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实施例。
除另有说明，本发明中公开的术语和缩写具有它们标准的含义。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步地详细描述：
实施例1
本实施例提供一种单萜吲哚生物碱类化合物，其制备方法如下：
取采自云南西双版纳地区的云南萝芙木枝叶样品5kg粉碎到20目，以90％乙醇室温提取3次，每次3天，提取液合并，过滤，减压浓缩至无乙醇；加入1M HCl水溶液，调至pH＝3，用乙酸乙酯萃取2次后，用NaOH调节至pH＝10，再用氯仿萃取3次，减压浓缩得总生物碱50g；总生物碱用甲醇溶解后，75g 100～200目硅胶拌样，500g 200～300目硅胶装柱进行硅胶柱层析，以体积配比为1:0、50:1、20:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:1、0:1的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱；收集各部分洗脱液并浓缩，薄层层析检测，合并相同部分。洗脱液的10:1部分浓缩蒸干后为1.9g，用甲醇溶解，2.9g ODS(50μm)硅胶拌样，进一步用50μm ODS反相柱层析，以体积配比为0:1、2:8、3:7、4:6、5:5的甲醇-水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，薄层层析检测，合并相同部分。其中3:7甲醇-水洗脱液部分合并，并用甲醇溶出，所述的单萜吲哚生物碱类化合物以白色粉末从中析出。
实施例2
本实施例提供一种单萜吲哚生物碱类化合物，其制备方法如下：
取采自广东省的云南萝芙木枝叶样品4.5kg粉碎到30目，以92％乙醇室温提取3次，每次3天，提取液合并，过滤，减压浓缩至无乙醇；加入1.5M HCl水溶液，调至pH＝3，用乙酸乙酯萃取3次后，用NaOH调节至pH＝10，再用氯仿萃取3次，减压浓缩得总生物碱43g；总生物碱用甲醇溶解后，65g 100～200目硅胶拌样，430g 200～300目硅胶装柱进行硅胶柱层析，以体积配比为1:0、50:1、20:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:1、0:1的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱；收集各部分洗脱液并浓缩，薄层层析检测，合并相同部分。洗脱液的10:1部分浓缩蒸干后为1.7g，用甲醇溶解，2.6g ODS(50μm)硅胶拌样，进一步用50μm ODS反相柱层析，以体积配比为0:1、2:8、3:7、4:6、5:5的甲醇-水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，薄层层析检测，合并相同部分。其中3:7甲醇-水洗脱液部分合并，并用甲醇溶出，所述的单萜吲哚生物碱类化合物以白色粉末从中析出。
实施例3
本实施例提供一种单萜吲哚生物碱类化合物，其制备方法如下：
取采自广西省的云南萝芙木枝叶样品4kg粉碎到30目，以94％乙醇室温提取3次，每次3天，提取液合并，过滤，减压浓缩至无乙醇；加入2M HCl水溶液，调至pH＝3，用乙酸乙酯萃取2次后，用NaOH调节至pH＝10，再用氯仿萃取4次，减压浓缩得总生物碱39g；总生物碱用甲醇溶解后，75g 100～200目硅胶拌样，400g 200～300目硅胶装柱进行硅胶柱层析，以体积配比为1:0、50:1、20:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:1、0:1的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱；收集各部分洗脱液并浓缩，薄层层析检测，合并相同部分。洗脱液的10:1部分浓缩蒸干后为1.5g，用甲醇溶解，2.8g ODS(50μm)硅胶拌样，进一步用50μm ODS反相柱层析，以体积配比为0:1、2:8、3:7、4:6、5:5的甲醇-水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，薄层层析检测，合并相同部分。其中3:7甲醇-水洗脱液部分合并，并用甲醇溶出，所述的单萜吲哚生物碱类化合物以白色粉末从中析出。
实施例4
本实施例提供一种单萜吲哚生物碱类化合物，其制备方法如下：
取采自贵州省的云南萝芙木枝叶样品3.5kg粉碎到40目，以96％乙醇室温提取2次，每次4天，提取液合并，过滤，减压浓缩至无乙醇；加入1.5M HCl水溶液，调至pH＝2，用乙酸乙酯萃取3次后，用NaOH调节至pH＝9，再用氯仿萃取4次，减压浓缩得总生物碱37g；总生物碱用甲醇溶解后，70g 100～200目硅胶拌样，390g 200～300目硅胶装柱进行硅胶柱层析，以体积配比为1:0、50:1、20:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:1、0:1的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱；收集各部分洗脱液并浓缩，薄层层析检测，合并相同部分。洗脱液的10:1部分浓缩蒸干后为1.5g，用甲醇溶解，2.7g ODS(50μm)硅胶拌样，进一步用50μm ODS反相柱层析，以体积配比为0:1、2:8、3:7、4:6、5:5的甲醇-水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，薄层层析检测，合并相同部分。其中3:7甲醇-水洗脱液部分合并，并用甲醇溶出，所述的单萜吲哚生物碱类化合物以白色粉末从中析出。
实施例5
本实施例提供一种单萜吲哚生物碱类化合物，其制备方法如下：
取采自台湾的云南萝芙木枝叶样品3kg粉碎到40目，以99％乙醇室温提取4次，每次2天，提取液合并，过滤，减压浓缩至无乙醇；加入1.5M HCl水溶液，调至pH＝4，用乙酸乙酯萃取4次后，用NaOH调节至pH＝11，再用氯仿萃取2次，减压浓缩得总生物碱31g；总生物碱用甲醇溶解后，60g 100～200目硅胶拌样，320g 200～300目硅胶装柱进行硅胶柱层析，以体积配比为1:0、50:1、20:1、10:1、8:1、6:1、4:1、2:1、1:1、0:1的氯仿-甲醇溶液进行梯度洗脱；收集各部分洗脱液并浓缩，薄层层析检测，合并相同部分。洗脱液的10:1部分浓缩蒸干后为1.3g，用甲醇溶解，2.5g ODS(50μm)硅胶拌样，进一步用50μm ODS反相柱层析，以体积配比为0:1、2:8、3:7、4:6、5:5的甲醇-水溶液进行梯度洗脱，收集各部分洗脱液并浓缩，薄层层析检测，合并相同部分。其中3:7甲醇-水洗脱液部分合并，并用甲醇溶出，所述的单萜吲哚生物碱类化合物以白色粉末从中析出。
结构鉴定：
经薄层分析和质谱分析确认，实施例1-5所制备的化合物均为相同的化合物。取实施例1制备的化合物，采用现代波谱技术，对其进行结构鉴定：
旋光值为[α]2D0–117.5(MeOH,c 0.04)；紫外光谱(MeOH)，λmax(logε):207(4.75),293(3.68)nm；HRESIMS显示本发明化合物准分子离子峰m/z 385.1766[M+H]+(计算值为385.1758)，结合1H和13C NMR谱(图1和图2，数据归属见表1)给出其分子式C21H24N2O5，不饱和度为11。
表1.化合物的1H NMR和13C NMR数据(溶剂为C5D5N)
13C NMR数据显示的21个碳信号包括1个甲基、1个甲氧基、4个亚甲基、7个次甲基(其中4个为烯基碳)和8个季碳(其中4个为烯基碳、1个为羰基碳)。1H NMR谱显示3个芳香质子在1个ABX自旋体系中[7.64(d,J＝8.1Hz),6.82(d,J＝1.8Hz),6.74(dd,J＝8.1,1.8Hz)]，另外还有1个亚乙基侧链[5.31(m),1.67(d,J＝6.5Hz)]和1个甲氧基[3.73(s)]等特征信号。根据以上数据和既往从云南萝芙木中分离得到的化学成分类型(HelveticaChemica Acta,2006,89:1344-1350.)，我们推测本发明化合物为单萜吲哚生物碱类化合物。在HMBC谱中H2-21与C-19相关，说明亚乙基连接在C-20；H-5与C-2、H2-17与C-7、H2-6与C-16相关提示本发明化合物为picraline型单萜吲哚生物碱(Bioorganic&MedicinalChemistry,2010,18:2152–2158.)。另外，在HMBC谱(如图3所示)中H-9与C-7和C-11相关，H-12与C-8和C-10相关提示羟基连接在C-11；甲氧基氢与羰基碳相关，说明甲氧基连接在C-22。本发明化合物的相对立体构型是通过NOESY实验证实的，在NOESY谱(如图4所示)中，H3-18与H-15相关证明亚乙基侧链为E构型，而H-14与H2-17相关则证明C-17为β取向。最终本发明化合物的结构鉴定为：
经数据库查新发现，该化合物为新化合物，发明人将这种单萜吲哚生物碱类化合物命名为11-hydroxyburnamine。
实验例
下面结合细胞试验对本发明实施例提供的这种单萜吲哚生物碱类化合物在免疫抑制方面的效果进行评价。
1)T细胞分离与纯化方案
取健康献血员的外周血，Ficoll密度梯度离心法分离PBMC。采用免疫磁珠分离法，通过阴性选择从PBMC中获得“未改变的”(untouched)CD4+T细胞。具体操作参照Miltenyi公司Pan T Cell Isolation Kit II(Human)说明书。纯化的CD4+T细胞，通过流式细胞术检测，细胞阳性率大于95％方可用于后续试验。
2)T细胞刺激方案
使用anti-CD3/CD28mAbs刺激T细胞，具体试验步骤均按常规操作进行。
3)免疫抑制活性的检测
采用免疫磁珠分离法从人外周血单个核细胞(PBMC)获得T细胞。铺96孔板，2×105/孔。以anti-CD3/CD28mAbs刺激T活化增殖，96hr后，加入11-hydroxyburnamine，即该单萜吲哚生物碱类化合物(浓度依次为0.2,1,5,25μM)，孵育72hr，CFSE染色结合流式细胞术检测样品，通过与对照(DMSO)进行比较，判定样品对活化T细胞增殖的抑制作用。
4)试验结果
试验结果如图5所示，其清楚地表明，该单萜吲哚生物碱类化合物显示出很好的免疫抑制活性，其对T细胞增殖的抑制活性为IC50＝5.9μM，揭示了本发明提供的这种单萜吲哚生物碱类化合物在制备免疫抑制药物中有良好的应用前景。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (9)

1.一种单萜吲哚生物碱类化合物，其结构式为：
2.一种如权利要求1所述的单萜吲哚生物碱类化合物制备方法，其特征在于，其包括：
采用乙醇提取云南萝芙木枝叶后，对所得提取物中的总生物碱进行萃取，得到总生物碱；
依次采用硅胶柱层析法和ODS反相柱层析法分离纯化所述总生物碱，得到所述单萜吲哚生物碱类化合物。
3.根据权利要求2所述的单萜吲哚生物碱类化合物制备方法，其特征在于，所述提取物的制备方法包括：将所述云南萝芙木枝叶粉碎到20～40目，以90～99％乙醇室温提取2～4次，每次36～60h，提取液合并，过滤，减压浓缩至无乙醇。
4.根据权利要求2所述的单萜吲哚生物碱类化合物制备方法，其特征在于，对所述提取物中的总生物碱进行萃取的步骤包括：
用稀HCl水溶液调节所述提取物的pH至2-4，用乙酸乙酯萃取2-4次后，用NaOH调节pH至9-11，再用氯仿萃取2-4次，减压浓缩得所述总生物碱。
5.根据权利要求2所述的单萜吲哚生物碱类化合物制备方法，其特征在于，采用所述硅胶柱层析法分离纯化所述总生物碱的步骤包括：
将所述总生物碱上样后，以体积比为1:0～0:1氯仿-甲醇溶液为洗脱液进行梯度洗脱，收集氯仿-甲醇溶液为10：1的洗脱部分，浓缩。
6.根据权利要求5所述的单萜吲哚生物碱类化合物制备方法，其特征在于，采用所述ODS反相柱层析法进行分离的步骤包括：将浓缩后的所述氯仿-甲醇溶液为10：1的洗脱部分用50μm的ODS反相柱层析进行分离，以体积比为0:1～1:1的甲醇-水溶液进行梯度洗脱，收集甲醇-水溶液为3：7的洗脱部分，浓缩后用甲醇复溶，静置后，所述的单萜吲哚生物碱类化合物以白色粉末从中析出。
7.根据权利要求5所述的单萜吲哚生物碱类化合物制备方法，其特征在于，所述总生物碱在经硅胶柱层析分离前，用重量比2～3倍量的甲醇溶解后，用所述总生物碱重1.0～2.0倍的80～100目硅胶拌样。
8.一种如权利要求1所述单萜吲哚生物碱类化合物在制备免疫抑制药物中的应用。
9.一种药物组合物，其特征在于，其活性成分包括权利要求1所述的单萜吲哚生物碱类化合物，以及药学上可接受的辅料。
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