CN111956648B - 生物碱香草木宁碱和大叶桉亭在制备治疗白癜风的药物中的用途 - Google Patents

生物碱香草木宁碱和大叶桉亭在制备治疗白癜风的药物中的用途 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物碱香草木宁碱和大叶桉亭在制备治疗白癜风的药物中的用途，经试验结果显示：该生物碱香草木宁碱和大叶桉亭可以稳定的促进黑素生成和提高酪氨酸酶活性，具有较好的浓度依赖性；对B16细胞内黑色素含量的促进也呈现浓度依赖性，其中香草木宁碱最低浓度1µM浓度时对黑素生成也有较明显的促进作用，其黑素的相对含量分别可达119%，提升细胞黑色素含量的作用，该生物碱类香草木宁碱和大叶桉亭作为治疗臼瘢风的药物用途的先导化合物。

Description

生物碱香草木宁碱和大叶桉亭在制备治疗白癜风的药物中的 用途
技术领域
本发明涉及两种生物碱香草木宁碱和大叶桉亭在制备治疗白癜风的药物及药物组合物中的用途。
背景技术
白癜风是一种常见的免疫性皮肤病，全球患病率从0.5％-2.0％不等。由黑素细胞受损而引起皮肤或者黏膜的色素脱失，以出现褪色的白斑为主要特征，发病机制尚不明确，我国一般人群患病率为0.56％左右，以青少年为主。男性和女性发病率相等。该疾病虽对人的生存不构成威胁，但会严重影响人的外观形象，给人带来很大的精神压力，妨碍工作、学习、社交等正常活动。虽然白癜风的治疗方法很多，但治愈率较低，疗效不佳，尤其是疾病愈后的复发率高。
香草木宁碱：白色固体，英文名Kokusaginine，别名：6,7-Dimethoxy dictamnine，4,6,7-Trimethoxyfuro[2,3-b]quinoline-water；分子式：C14H13NO4分子量259.26，CAS登录号：484-08-2，熔点：171℃，可溶于氯仿、乙酸乙酯、丙酮、甲醇。可来源于臭草Rutagraveolens，臭山羊Orixa japonica、花椒Zanthoxylum bungeanum Maxim.、臭常山属Ormasp.，山油柑属Acronychia sp.，吴茱萸属Evodia sp.，拟芸香属HaplopAyllum sp..蜜茱萸属Melicope sp.植物，具有提高去甲肾上腺素和多巴胺水平(鼠大脑)；光毒作用(啤酒酵母菌，白色念珠菌)；杀虫、抗炎以及抑制人乳腺癌细胞及耐药株细胞增殖的作用；解痉挛作用，对小鼠口服的半数致死量为150-250毫克/公斤，其结构式如下：
Figure SMS_1
大叶桉亭：无色粉末，英文名Robustine，别名8-羟基白鲜碱，4-甲氧基呋喃并[2,3-B]喹啉-8-醇(4-Methoxyfuro[2,3-b]quinolin-8-ol)分子式：C12H9NO3分子量215.20，CAS登录号：2255-50-7，可来源于高加索白鲜Dictamnus caucasicus,山杨树Haplophyllumb ucharicum,蝙蝠葛H.dauricum,H.dubium,H.obtusifolium,H.pedicellatum,H.perforatum,H.ramosissimum,H.robustum，花椒藤，两面针，人参叶等植物，熔点：147–149℃，易溶于丙酮、氯仿，微溶于乙醇，不溶于水。具有抗肿瘤、杀虫、抗ADP诱导的血小板聚集功能，对小鼠口服的半数致死量为300毫克/公斤，其结构式如下：
Figure SMS_2
本发明所述的两种生物碱香草木宁碱和大叶桉亭，经试验表明：该两种生物碱在B16黑素细胞中显示出良好的激活酪氨酸酶，提升细胞黑色素含量的作用，可作为用于治疗白癜风药物及药物组合物中的用途。
发明内容
本发明目的在于，提供一种生物碱香草木宁碱和大叶桉亭在制备治疗白癜风的药物中的用途，经试验结果显示：该生物碱香草木宁碱和大叶桉亭可以稳定的促进黑素生成和提高酪氨酸酶活性，具有较好的浓度依赖性；对B16细胞内黑色素含量的促进也呈现浓度依赖性，其中香草木宁碱最低浓度1μM浓度时对黑素生成也有较明显的促进作用，其黑素的相对含量分别可达119％，提升细胞黑色素含量的作用，该生物碱类香草木宁碱和大叶桉亭作为治疗臼瘢风的药物用途的先导化合物。
本发明所述一种生物碱香草木宁碱和大叶桉亭在制备治疗白癜风药物中的用途。
一种生物碱香草木宁碱和大叶桉亭在制备治疗白癜风药物组合物中的用途。
本发明所述的生物碱香草木宁碱和大叶桉亭在制备治疗白癜风的药物中的用途，所涉及的生物碱香草木宁碱和大叶桉亭是从芸香全草中提取的，其制备方法按下列步骤进行：
制备芸香全草提取液：
a、将干燥的芸香全草30kg粉碎后，用浓度为95％的乙醇回流提取3次，每次提取时间2h，过滤，合并提取液，将提取液在温度45℃条件下用旋转蒸发仪减压浓缩至无醇味，得到芸香提取液；
分离纯化：
b、将步骤a所得提取液加入石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取4-6次，将萃取液减压蒸干，分别得到石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取物浸膏；
c、将步骤b所得的石油醚萃取物浸膏用正向硅胶100-200目柱层析分离，用体积比100:0-1:1的石油醚:乙酸乙酯依次梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，得到10个流分Fr1－Fr10，流分经硅胶薄层层析(TLC)分析，将流分Fr8－Fr10合并，得到合并流分F1；
d、将步骤c所得的合并流分F1用正向硅胶(100-200目)柱层析分离，用体积比50：1-1:1的石油醚:乙酸乙酯进行梯度洗脱，得到4个流分F1-1-F1-4；
e、将步骤d中得到的流分F1-1用MCI柱层析分离，用20％-100％甲醇-水梯度洗脱，流分F1-3用MCI柱层析分离，凝胶Sephadex LH-20柱和半制备高效液相反复分离纯化，用体积比55％乙腈-水等度洗脱，得到香草木宁碱；
f、经硅胶薄层层析(TLC)分析，将流分Fr2-F7合并，得到合并流分F2；
g、将步骤f中得到的合并流分F2用HPD-100型大孔树脂分离，用体积比20％-100％的甲醇-水进行梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，干燥，经硅胶薄层层析(TLC)分析得到5个流分F2-1-F2-5；
h、将流分F2-4过凝胶Sephadex LH-20柱，用80％甲醇-水洗脱，半制备高效液相色谱反复分离纯化,用体积比55％乙腈-水等度洗脱，得到大叶桉亭。
将上述得到的两种生物碱香草木宁碱和大叶桉亭经高分辨质谱以及核磁共振测定，与文献对比，确认其结构。
附图说明
图1和图2为本发明两种生物碱香草木宁碱和大叶桉亭对酪氨酸酶活性及黑色素含量的影响，注:(NC空白对照；阳性对照(8-MOP)；与空白对照相比,*p<0.05,**p<0.01,***p<0.001；****p<0.0001n＝3)。
具体实施方式
实施例
本发明所述的生物碱香草木宁碱和大叶桉亭对小鼠B16黑色素瘤细胞黑素含量测定实验：
将分离得到的生物碱香草木宁碱和大叶桉亭对B16黑色素瘤细胞的黑素含量测定：
筛选模型：小鼠B16黑素瘤细胞系；
细胞来源：中科院细胞库提供；
培养条件：10％胎牛血清和1％青霉素链霉素的改良Eagle培养基(DMEM)培养基中，培养至细胞汇合度达到80％以上时，加入0.5-2mL胰酶消化，使用细胞计数仪进行细胞计数；使细胞密度调整至2.0×105个/皿接种于直径150mm培养皿中，置温度37℃，5％CO2培养箱内；
细胞传代及接种：取对数期的B16黑素瘤细胞，弃培养液，磷酸缓冲液(PBS)清洗2次，胰酶消化后，细胞密度调整至2×105个/孔，接种于6孔板中培养过夜(约12h-16h)；
设置溶剂对照组二甲亚砜(DMSO)2μL和阳性对照组8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)50μM，每组设3个复孔，于温度37℃5％CO2培养箱内培养48h/72h后进行酪氨酸酶活性和黑色素含量测定实验；
测定方法：
细胞内的相对黑色素含量测定：
黑色素含量测定参照文献(Cho,Jun等.2017)的方法操作：B16黑素瘤细胞接种于6孔板中、细胞密度设为2×105个/孔，待细胞完全贴壁，弃去培养基，每孔加入2mL全新培养基和适量的香草木宁碱和大叶桉亭相应浓度储备母液，使终浓度为1μM、10μM、50μM，并设置溶剂对照组二甲亚砜(DMSO)2μL/孔和阳性对照组50μM的8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)，每组设3个复孔，于温度37℃5％CO2恒温培养箱中培养72h，弃去培养基，每孔加入100μL细胞裂解液(RIPA)裂解液，用细胞刮收集细胞至1.5mL EP管中，置于旋转仪使细胞和裂解液充分混匀40min再进行12000×rpm，温度4℃离心22min；上清用BCA法检测总蛋白浓度C，在沉淀中加入190μL的1N NaOH裂解液，置温度80℃水浴中1h后，酶标仪测定波长为405nm处吸光度值；采用相对黑色素含量值，即黑素相对含量＝黑素OD405/蛋白浓度C；黑素生成激活率＝实验组黑素相对含量/溶剂对照组黑素相对含量×100％；
细胞内酪氨酸酶活性测定：
采用酪氨酸酶多巴速率氧化法：B16黑素瘤细胞接种于6孔板中、细胞密度设为1×105个/孔，接种12h后细胞完全贴壁，弃去培养基，加入全新培养基并加入不同浓度待测香草木宁碱和大叶桉亭作用48h，弃去培养基，每孔加入100μL含有1％脱氧胆酸钠+0.1％曲拉通X-100(TritonX-100)的磷酸缓冲液(PBS缓冲液)中裂解，用细胞刮收集细胞至1.5mL EP管中，放入温度﹣20℃冰箱中冷冻20min，再放置室温溶解后，温度4℃，12000rpm，离心20min，此时可以配制10Mm L-多巴(L-Dopa)溶液，配置完成后避光室温放置，转移3μL上清至96孔酶标板用蛋白定量(BCA)试剂检测总蛋白浓度C；转移90μL上清至96孔酶标板，再加入10μL 10mM的L-多巴(L-Dopa)，温度37℃避光孵育至各孔有浅棕褐色出现，迅速在490nm处测定OD值，相对酪氨酸酶激活率＝酪氨酸酶OD490/蛋白浓度C；酪氨酸酶相对激活率＝实验组酪氨酸酶相对含量/溶剂对照组酪氨酸酶相对含量×100％；
统计学分析
计算各处理组的酪氨酸酶活性和黑素相对含量。实验数据使用GraphPad Prism 6(La Jolla,CA,USA)软件进行统计分析，以平均数±标准差(mean±SD)表示，组间差异采用单因素方差分析，以p>0.05表示差异无统计学意义，p<0.05表示差异有统计学意义；
分别以1μM，10μM，50μM浓度梯度将两种生物碱香草木宁碱和大叶桉亭作用于B16细胞48h/72h，观察其对酪氨酸酶激活率及黑素含量的影响，以8-甲氧基补骨脂素(8-MOP)作为阳性对照药，对其进行了浓度梯度的比较；B16细胞经不同浓度的香草木宁碱和大叶桉亭作用48h/72h之后，测定细胞内酪氨酸酶活性和相对黑素含量，结果见表1和图1，与空白对照组相比，差异有统计学意义(*p<0.05，**p<0.01)；
表1.两种生物碱化合物对酪氨酸酶活性及黑色素含量的影响
Figure SMS_3
Figure SMS_4
注：*与空白对照组(NC)比较，P<0.05；**与空白对照组(NC)比较，P<0.01；***与空白对照组(NC)比较，P<0.001；****与空白对照组(NC)比较，P<0.0001；
从表中可以看出：以1μM，10μM，50μM浓度梯度的比较，48h/72h之后，测定细胞内酪氨酸酶活性和相对黑素含量；结果显示：两种生物碱类化合物香草木宁碱和大叶桉亭均化可以稳定的促进黑素生成和提高酪氨酸酶活性，具有较好的浓度依赖性；对B16细胞内黑色素含量的促进也呈现浓度依赖性，其中在香草木宁碱最低浓度1μM浓度时对黑素生成也有较明显的促进作用，其黑素的相对含量分别可达119％。该2种生物碱类化合物可作为治疗臼瘢风的药物用途的先导化合物。

Claims (1)

1.一种生物碱香草木宁碱和大叶桉亭在制备治疗白癜风药物中的用途。
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