CN102462797B - 大蒜总皂苷的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大蒜总皂苷的制备方法，所述方法包括大蒜粉碎双提，药液回收乙醇，醇沉，离心，得药液I；药渣乙醇回流，得药液II；I、II合并回收乙醇，过大孔树脂，乙醇洗脱，洗脱液回收，干燥，得大蒜总皂苷。该制备方法操作简单，产品含量高，质量可控，能够产业化。本发明还公开了用该方法制得的大蒜总皂苷，其具有良好的抗肿瘤活性，安全低毒，可充分利用大蒜提蒜油后的药渣，成本低，能制成抗肿瘤药物、保健品、食品。

Description

大蒜总皂苷的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及医药领域，具体而言，本发明涉及一种大蒜总皂苷的制备方法，还涉及用该方法制得的大蒜总皂苷及其药物组合物，以及该大蒜总皂苷在制备抗肿瘤药物、保健品或食品中的应用。

背景技术

肿瘤是当今社会危害人类健康的重大疾病之一，已成为仅次于心血脑管疾病的世界第二大死因疾病。恶性肿瘤治疗方案一般采取手术方法，并配合放化疗治疗。相比具有一定毒副作用的化疗药物，中药抗肿瘤药具有独特的优势，其具有祛邪、扶正或增效、减毒的作用，因此一直是研究的热点。

大蒜用于防病治病历史悠久，其主要含有含硫有机化合物、氨基酸类、酶类、糖类、脂类、皂苷类、维生素和微量元素等多种成分。现代药理研究表明，大蒜有抗菌、消炎、降血脂、降血压、抗血栓、抗肿瘤、抗衰老、抗氧化以及增强机体免疫力等多种功效。大蒜的主要治疗作用成分集中在含硫化合物上，研究和应用较多的是大蒜的脂溶性成分大蒜油和蒜油中的主要有效成分二烯丙基三硫(即大蒜素)，目前已有大蒜素注射液、大蒜油胶囊以及蒜油的不同保健品面市。对于大蒜中的其它成分如皂苷的研究表明，该类成分也具有重要的生物活性。大蒜皂苷作为大蒜水溶性成分的重要组成部分，国内外关于其化学结构和药理作用有一些报道，但目前大蒜总皂苷的制备方法及其活性研究、开发利用相关报道较少，特别是大蒜皂苷在预防和治疗肿瘤方面的用途未能得到充分、有效地利用。

大蒜皂苷的化学研究主要集中在多种糖苷类衍生物的分离以及结构鉴定方面。截至到2006年，通过2D-NMR和FAB-MS，已有10种呋甾烷和7种螺甾烷得到了分离，结构得到了确认(Harunobu Amagase.Clarifying the RealBioactive Constituents of Garlic[J].The Journal of Nutrition，April 9-11，2005：716S-725S)。目前已报道的大蒜总皂苷中含有呋甾皂苷，有proto-desgalactotigonin、proto-eruboside-B、sativoside-B₁(Harunobu Amagase.Clarifying the Real Bioactive Constituents of Garlic[J].The Journal of Nutrition，April 9-11，2005：716S-725S；Virginia Lanzotti.The analysis of onion andgarlic[J].Journal of Chromatography A，1112(2006)3-22；Matsuura H等，Afurostanol glycoside from garlic，bulbs of Allium sativumL.Chem Pharm Bull，1988，36：3659)和proto-iso-eruboside-B等，螺甾皂苷有eruboside-B、iso-eruboside-B和sativoside-C(彭军鹏等，大蒜中两种新的载体皂苷成分及其对血液凝聚性的影响[J].药学学报，1996，31(8)：607-612)等，以及甾体皂苷sativoside-R1、sativoside-R2、sativoside-B2，-B3，-B4，and-B5等(HarunobuAmagase.Clarifying the Real Bioactive Constituents of Garlic[J].The Journal ofNutrition，April 9-11，2005：716S-725S；Matsuura H等，New spirostanolglycosides from garlic.The 38th annual meeting of the American society ofpharmacognosy，Iowa，July 1997；Matsuura，H.等，Further studies on steroidalglycosides from bulbs，roots and leaves of Allium sativum L.Chem.Pharm.Bull.37：2741-2743)。

药理活性方面，文献报道大蒜皂苷具有降脂、抗凝血、抗肿瘤、细胞毒性和抗菌等功能(Matsuura，H.等，Further studies on steroidal glycosides frombulbs，roots and leaves of Allium sativum L.Chem.Pharm.Bull.37：2741-2743；Nishino，H.等，1986，Glycyrrhetic acid nhibits tumor-promoting activity ofteleocidin and  12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate in two stage mouse skincarcinogenesis.Jpn.J.Cancer Res.77：33-38；Harwood，H.J.等，1993，Pharmacologic consequences of cholesterol absorption inhibition：alteration incholesterol metabolism and reduction in plasma cholesterol concentrationinduced by the synthetic saponin b-tigogenin cellobioside(CP-88818；tiqueside).J.Lipid Res.34：377-395；H.Koch，Deutsche Apothe k.Zeits.133(1993)63.)。相关研究主要有以下几方面：

(1)胆固醇代谢：有研究证实大蒜总皂苷具有心血管系统疾病的改良作用。Matsuura.H对胆固醇大鼠分别注射大蒜总皂苷和一定含量的皂苷溶液，剂量由0.003增至3g/kg体重，16周后部分大蒜皂苷组的血浆胆固醇含量下降了60％，提示大蒜总皂苷具有降低胆固醇的作用(Matsuura.H，Recent advanceson the nutritional effects associated with the use of garlic as a supplement，Journal of Nutrition，2001，1000S-1005S 6；Kim J.H.等，Effect of crude saponinof Korean Red Ginseng on High-Fat Diet Induced Obesity in rats，[J].PharmacolSci，97，124-131(2005))。Koch也指出大蒜的降胆固醇功能的物质基础即为水溶性皂苷(Koch HP.Saponine in knoblauch und ku chenzwiebel.Dtsch ApothZtg.1993；133：3733-43)。其它相关研究进一步表明总皂苷降低血浆胆固醇作用的活性物质来自于大蒜提取物中的螺甾烷类皂苷(Matsuura H.Saponins ingarlic as modifiers of the risk of cardiovascular disease.J Nutr.2001；131：1000S-5S；Slowing K等，Effect of garlic in cholesterol-fed rats.J Nutr.2001；131：994S-9S)。

(2)抗血栓及心血管疾病预防：大蒜总皂苷有着抗血小板凝集和提高纤溶活性的作用。一方面，大蒜皂苷中呋甾皂苷iso-eruboside-B有明显的延长血液凝固时间和提高纤溶活性的作用，表明有延缓血栓形成的作用，该作用机制是大蒜皂苷中的特殊苷元β-chlorogenin具有的抗血小板凝集作用。另一方面，大蒜又能促进纤维蛋白溶解，螺甾皂苷proto-iso-eruboside-B可提高纤溶活性，使已形成的血栓消失(彭军鹏等，大蒜中两种新的载体皂苷成分及其对血液凝聚性的影响[J].药学学报，1996，31(8)：607-612)，有治疗血栓病的作用。另有研究表明，大蒜对于动脉粥样硬化，脑血栓等心血管疾病的预防和治疗作用非常突出。

(3)抗菌：相关实验证明大蒜总皂苷也具有一定的抗菌活性。Matsuura.H等对大蒜总皂苷中的两种呋甾皂苷进行了抗菌试验，和两性霉素B对比显示，这两种皂苷混合物对白色念珠菌有显著的抑制作用，但抗菌谱窄，且作用力稍弱于两性霉素B(Matsuura H等，New spirostanol glycosides from garlic.The38th annual meeting of the American society of pharmacognosy，Iowa，July1997)。

(4)抗肿瘤以及细胞毒性：众多研究表明大蒜具有抗肿瘤作用。大蒜及其他百合科种属植物中的甾体皂苷及其苷元经hela细胞体外实验证实具有肿瘤抑制作用。并且Nishino证明螺甾皂苷eruboside-B具有与甘草次酸相似的体内抗肿瘤作用(Nishino，H.等，1986，Glycyrrhetic acid nhibitstumor-promoting activity of teleocidin and 12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetatein two stage mouse skin carcinogenesis.Jpn.J.Cancer Res.77：33-38)。另外该研究也提到eruboside-B具有细胞毒的作用，这些细胞系包括BC1、Lu1、Col2、KB和KB-V。

尽管大蒜总皂苷有诸多药理作用，并且大蒜皂苷单体抗肿瘤作用有报道，但大蒜总皂苷抗肿瘤祛邪扶正(细胞毒和增强免疫作用)作用没有报道。

此外，在现有技术中，对于大蒜总皂苷的制备也存在方法复杂、可操作性差、产业化难度大等缺陷。因此，目前在大蒜总皂苷的产业化工艺研究和应用领域，在提高大蒜总皂苷的收率、含量方面都有待于提高，需要开发一种操作步骤简单、易于工业化、获得的大蒜总皂苷收率高、含量高的新方法。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的一个目的是提供一种大蒜总皂苷的制备方法。本发明的另一个目的是提供根据所述制备方法制得的大蒜总皂苷。本发明又一个目的是提供包含所述大蒜总皂苷的药物组合物，以及所述大蒜总皂苷在制备抗肿瘤药物和增强免疫力的保健品、食品中的应用。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的。

一方面，本发明提供一种大蒜总皂苷的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)将大蒜粉碎后双提，得挥发油、药液和药渣；

2)将经步骤1)得到的药液减压回收水，浓缩后加乙醇醇沉，离心，得药液I；

3)将经步骤1)得到的药渣加乙醇回流提取，得药液II；

4)合并药液I、II，减压回收乙醇至无醇味，加水稀释，离心，得上清药液III；

5)将药液III过大孔树脂，依次水洗和/或乙醇洗，收集洗脱液，减压回收乙醇，减压干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。

优选地，在上述制备方法中，所述步骤1)包括：

将大蒜粉碎成颗粒(参照专利ZL200510083951.0)，双提1-3次，水提1-2次，分别加3-9倍水，每次0.5-2小时，从而得挥发油、药液和药渣。

优选地，所述步骤2)包括：

将大蒜提取挥发油后的剩余药液在温度＜80℃下减压回收水，以大蒜g/mL药液为单位计，将药液浓缩至1∶0.8-1.2，使药液在60℃下的相对密度为0.9-1.10，得到的浓缩液加乙醇，使含醇量达到70％-80％，醇沉过夜，离心，得上清药液I。

优选地，所述步骤3)包括：

将大蒜提取挥发油后的剩余药渣淋干水分，加3-5倍95％乙醇回流，提取1-2次，每次0.5-1.5小时，得药液，合并为药液II。

优选地，所述步骤4)包括：

合并药液I、II，减压回收至无醇味，使其25℃时相对密度为1.00-1.10，加水稀释，加水量为药材重量的0.5-0.9倍，离心，得上清药液III。

优选地，所述步骤5)包括：

将药液III过苯乙烯型大孔树脂，所述树脂优选DM-130、AB-8或HPD100，按照树脂与生药重量比计，上样量为1∶0.8-1.1，依次水洗4-6BV和/或30％乙醇洗2-4BV，70％-95％乙醇洗4-6BV，收集水洗后乙醇洗脱液，或30％乙醇洗脱后的乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，温度＜60℃下减压干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。

另一方面，本发明提供根据上述制备方法制得的大蒜总皂苷。此外，本发明还提供包含所述大蒜总皂苷的药物组合物。

又一方面，本发明提供根据上述制备方法制得的大蒜总皂苷在制备抗肿瘤药物、抗菌药物中的应用以及在制备增强免疫力、降血脂、抗血栓的保健品和食品中的应用。

以下是本发明的详细描述：

为了克服大蒜总皂苷在抗肿瘤防治领域和大蒜应用领域存在的不足，充分利用大蒜提取大蒜油之后的药渣，研制疗效显著且毒副作用小的抗肿瘤药物、保健品或食品，以满足防治、保健的需求，经过深入研究，本发明人开发了一种大蒜总皂苷的新型制备方法，该方法具有操作简单、收率高、含量高、产品质量可控、适合于产业化生产等优点，所获得的产品具有抗肿瘤活性，并有协同增强免疫的作用，可以制成抗肿瘤药物、保健品和食品，并且安全低毒，应用前景广阔。

根据本发明的一个具体实施方式，所采用的技术方案如下：

●药材提取工艺：

1、大蒜粉碎成适当颗粒(依据已经授权的专利ZL200510083951.0)，双提2-3次，水提1-2次，分别加3-9倍水，每次0.5-2h，得挥发油、药液和药渣；

2、药液合并，减压回收水(温度＜80℃)，浓缩至1∶0.8-1.2(生药g/mL药液)(60℃相对密度0.9-1.10)，得浓缩液，加乙醇醇沉，使含醇量达到70％-80％，过夜，离心，得上清药液I；

3、药渣淋干水液，加3-5倍95％乙醇回流，提取1-2次，每次0.5-1.5小时，得药液，合并为药液II；

4、合并药液I、II，减压回收至无醇味，使其25℃时相对密度1.00-1.10，加水稀释，加水量为药材重量的0.5-0.9倍，离心，得上清药液；

5、药液过苯乙烯型大孔树脂，优选DM-130或AB-8或HPD100，上样量1∶0.8-1.1(树脂与生药重量比)，依次水洗4-6BV和/或30％乙醇洗2-4BV，70％-95％乙醇洗4-6BV，收集水洗后乙醇洗脱液，或30％乙醇洗后的乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，减压干燥(温度＜60℃)、喷雾干燥或冷冻干燥，得棕色或深黄色粉末。

根据本发明的另一个具体实施方式，对制得的大蒜总皂苷进行相应的鉴定：

●大蒜总皂苷的质量控制

首先，进行大蒜总皂苷的定性鉴别：

1、化学方法

将本发明的大蒜总皂苷进行发泡试验、Liebermann-Burchard、Salkowaki反应(魏璐雪主编，《中药制剂分析》，湖北：湖北科学技术出版社，1991：98-99)，结果呈阳性，表明本发明的大蒜总皂苷含有皂类化合物。

1.1发泡试验

取少量样品于带塞试管中，加2mL水溶解，用力振摇3分钟，即产生持久性蜂窝状泡沫(维持10分钟以上)，且泡沫量不少于液体体积的1/3(检查皂苷的反应)。

1.2Liebermann-Burchard反应

取少量样品置试管中，加醋酐1mL，混旋后沿试管壁加入少量浓硫酸，在两液层中间出现蓝黑色色环(检查皂苷的反应)。

1.3Salkowaki反应

取少量样品置试管中，加入氯仿1mL，混旋后沿试管壁加入少量硫酸，硫酸层显血红色或青色，氯仿层显绿色荧光(检查甾体皂苷的专属性反应)。

2、薄层色谱法

将本发明的大蒜总皂苷制成浓度为1mg/mL的甲醇溶液进行薄层色谱法鉴定，以氯仿-正丁醇-甲醇-水或正丁醇-乙酸乙酯-水为展开剂，以10％硫酸乙醇溶液为显色剂。结果见图1-2。

第二，进行大蒜总皂苷的定量测定：

因目前国内外大蒜皂苷类化合物无对照品销售，大蒜皂苷母核结构与薯蓣皂苷元(见图4)和知母皂苷元A-Ⅲ(见图5)具有相类似的结构。可选择二者作为大蒜总皂苷含量测定的对照品。根据目前已知的大蒜皂苷结构，大蒜皂苷苷元为β-chlorogenin，其结构如图6所示。结构上β-chlorogenin在B环无双键，C25为D型；知母皂苷元A-Ⅲ在B环无双键，C25为L构型，薯蓣皂苷元B环C5和C6为双键连接，C25为D型。理论上推测，知母皂苷元A-Ⅲ更适合作为大蒜总皂苷测定的对照品，本研究对两个对照品进行了筛选。

实验结果(图7)显示知母皂苷元A-Ⅲ(ii)与大蒜总皂苷样品(iii)紫外吸收光谱峰形基本一致，与二者相比，薯蓣皂苷元(i)在420nm处出现一吸收峰，可能是由于B环C5和C6双键产生的吸收；因此选用知母皂苷元A-Ⅲ作为对照品。

根据本发明的具体实施方式，以知母皂苷元A-Ⅲ为对照品，采用香草醛-高氯酸比色法建立了大蒜总皂苷的含量测定方法，使产品质量得到控制。经方法学验证，该方法准确可靠，稳定性(RSD％＝0.25％)、精密度(RSD％＝0.24％，)、重现性(RSD％＝1.52％)良好，加样回收率为100.5％，RSD值为1.48％(n＝6)。经该方法检测，在本发明的大蒜总皂苷中，总皂苷含量以知母皂苷元A-Ⅲ计不低于30％(下文本发明的总皂苷含量都以知母皂苷元A-Ⅲ计)。具体测定方法的建立和验证参见具体实施方式部分。

经该方法检测，在本发明的大蒜总皂中，总皂苷含量以知母皂苷元A-Ⅲ计不低于30％。部分批次样品的总皂苷含量测定结果见实施例5。

为了和已公开的专利对比，同时采用对方的方法、对照品和本申请的方法、对照品，对本申请制得的样品进行了含量测定，测定结果见实施例6。

本发明提供了一种大蒜总皂苷的新型制备方法，与现有技术相比，本发明主要具有以下优势：

首先，本发明的制备方法主要采用水和乙醇提取，制备方法操作简单，产品含量较高，易于产业化，可以大大改善大蒜总皂苷的提取现状；

其次，大蒜油的提取广泛见于大蒜应用领域，本发明的制备方法可以充分利用大蒜提取大蒜油之后剩余的药液和药渣作为大蒜总皂苷的提取原料，提高了大蒜的利用率；

再次，实验证明用本发明方法制备的大蒜总皂苷具有良好的抗肿瘤活性，安全低毒，能制成抗肿瘤药物、保健品，并且成本低廉，应用前景良好。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施例，其中：

图1为本发明的大蒜总皂苷粗提物过苯乙烯型大孔树脂不同乙醇梯度洗脱液及纯化样品薄层色谱图(TLC图谱)，其中，薄层板采用硅胶G，展开剂为氯仿-正丁醇-甲醇-水(13∶10∶10∶8)，显色剂为10％硫酸乙醇溶液加热显色，样品情况如下：

1#：大蒜总皂苷粗提物；

2#：大蒜总皂苷粗提物过大孔树脂上样液；

3#：大孔树脂水洗脱液；

4#：大孔树脂10％EtOH洗脱液纯化样品；

5#：大孔树脂30％EtOH洗脱液；

5-1#：大孔树脂30％EtOH洗脱液纯化样品；

6#：大孔树脂50％EtOH洗脱液；

6-1#：大孔树脂50％EtOH洗脱液纯化样品；

7#：大孔树脂70％EtOH洗脱液；

7-1#：大孔树脂70％EtOH洗脱液纯化样品；

8#：大孔树脂95％EtOH洗脱液。

图2为本发明的大蒜总皂苷粗提物过苯乙烯型大孔树脂不同乙醇梯度洗脱液纯化样品薄层色谱图(TLC图谱)，其中薄层板采用硅胶G，展开剂为正丁醇-乙酸乙酯-水＝7∶3∶2(上层)，显色剂为10％硫酸乙醇溶液加热显色，样品情况如下：

2#：大孔树脂水洗脱液；

3#：大孔树脂10％EtOH洗脱液纯化样品；

5#：大孔树脂30％EtOH洗脱液纯化样品；

7#：大孔树脂50％EtOH洗脱液纯化样品；

8#：大孔树脂70％EtOH洗脱液纯化样品；

9#：大孔树脂95％EtOH洗脱液纯化样品；

A：大蒜总皂苷粗提物纯化样品1；

B：大蒜总皂苷粗提物纯化样品2。

图3为大蒜总皂苷样品薄层色谱图(TLC图谱)，其中薄层板采用硅胶G，展开剂为氯仿-正丁醇-甲醇-水(13∶10∶10∶8)，显色剂为10％硫酸乙醇溶液加热显色，样品情况如下：

1#：大蒜总皂苷粗提物纯化样品；

2#：大蒜总皂苷粗提物杂质样品；

3#：大蒜总皂苷粗提物杂质样品；

4#：大蒜总皂苷样品1；

5#：大蒜总皂苷样品2；

图4为薯蓣皂苷元的结构。

图5为知母皂苷元A-Ⅲ的结构。

图6为大蒜皂苷苷元β-chlorogenin的结构。

图7为知母皂苷元A-Ⅲ、薯蓣皂苷元及本发明制备的大蒜总皂苷样品的紫外-可见吸收光谱的比较结果，其中i为薯蓣皂苷元，ii为知母皂苷元A-Ⅲ，iii为本发明制备的大蒜总皂苷样品。

图8为采用香草醛-高氯酸比色法建立大蒜总皂苷的标准曲线图。

图9为本发明的大蒜总皂苷对小鼠肉瘤S180模型的抑瘤作用，其中横排第一排：模型组；第2、3、4排分别为大蒜总皂苷高、中、低剂量组。

具体实施方式

下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均已标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

大蒜原料：山东金乡

大孔树脂：AB-8购自南开大学化工厂；DM-130购自鲁抗立科药物化学有限公司；HPD100购自沧州宝恩化工有限公司

阳性药物顺铂：顺铂由齐鲁制药有限公司生产(批号905011CF)。

胃癌细胞株：MKN45细胞从北京协和细胞资源中心购买。

试剂：RPMI1640培养基(GIBCO公司lot8109038)；胎牛血清(GIBCO16000公司)；胰蛋白酶(Solarbio公司)；MTT(Sigma)；DMSO(Sigma)等购自北京奥信拓普科技有限公司。

SD大鼠：雄性，体重(180±10)g，清洁级动物，中国药品生物制品检定所提供。

实施例1：采用香草醛-高氯酸比色法建立大蒜总皂苷的含量测定方法

标准溶液的配制：精密称取知母皂苷元A-Ⅲ对照品(98％)(金测分析技术(天津)有限公司)5.04mg，置于25mL容量瓶中，加入甲醇定容，超声至样品完全溶解。制成浓度为0.2016mg/mL，备用。

样品溶液的配制：精密称取大蒜总皂苷样品(批号080901)10.16mg至25mL容量瓶中，加入甲醇定容，超声至样品完全溶解，备用。

样品测定条件：样品溶液置具塞试管中，挥干溶剂后，加入0.2mL 5％香草醛-冰醋酸和1.0mL高氯酸，密塞，摇匀，于90℃水浴下反应30min，冰浴10min终止反应，准确加入冰醋酸至10.0mL，密塞，摇匀。空白试剂对照，在540nm波长下测定吸光度。

标准曲线的制作：分别精密量取上述知母皂苷元对照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9mL，水浴挥干溶剂。各加入0.2mL 5％香草醛-冰醋酸和1.0mL高氯酸，密塞，摇匀，于90℃水浴下反应60min，冰浴10min终止反应，精密加冰醋酸至10.0mL，密塞，摇匀。空白试剂对照，于540nm波长进行测定样品吸光度。对结果分析得标准曲线方程为A＝4.8396x+0.0666，r＝0.9993(n＝9)，其中x为质量(mg)，A为吸光度。测得数据如下表所示，标准曲线图如图6所示。在所测试质量范围0.0202～0.1814mg内有良好的线性关系。

表1 对照品质量与吸光度的关系

对所建立的大蒜总皂苷的含量测定方法进行了方法学考察。

1.稳定性考察

精密量取上述样品溶液0.5mL，水浴挥干溶剂，按照样品测定条件显色，冰浴10min终止反应，分别经0、10、20、30、40、50、60min测量吸光度值，结果如表2所示，RSD％＝0.25％，(n＝6)在反应结束后1小时内测量稳定性良好。

表2 稳定性考察

2.精密度考察

精密量取上述样品溶液0.5mL，水浴挥干溶剂，按照样品测定条件测定6次，结果如表3所示。RSD％＝0.24％，(n＝6)。

表3 精密度考察

3.重现性考察

称取上述大蒜总皂苷样品(批号080901)0.20mg 6份，按上文所述样品溶液配制方法配制，水浴挥干溶剂，按照样品测定条件测定，结果如表4所示。RSD％＝1.52％(n＝6)。

表4 样品重现性考察

4.加样回收率实验

精密称取6份已知含量的大蒜皂苷(批号080901)4.4mg，分别加入2.5mg知母皂苷元A-Ⅲ，置25mL容量瓶中，用甲醇溶解，定容，取0.5mL至10mL具塞试管中，水浴挥干溶剂，按照样品测定条件测定，空白试剂对照，结果见表5，平均回收率为100.5％，RSD值为1.48％(n＝6)。

表5 加样回收试验

实施例2：大蒜总皂苷的制备、定性和定量

大蒜5kg，粉碎(直径0.5-1cm)，双提1次，水提2次，分别加6、5、3倍水，每次0.5小时，药液减压回收水(温度＜80℃)，浓缩1∶1.1(60℃相对密度1.0)，水浓缩液加乙醇醇沉，使含醇量达到70％，放置过夜，离心，得药液I；药渣(淋干)，加4倍95％乙醇回流2次，每次0.5小时，得药液II，合并药液I、II，减压回收(25℃，相对密度1.00)，加水稀释至提取药材的0.7倍(3500mL)，离心，药液减压回收(温度＜80℃)，上清液过DM-130，上样量1∶0.8，水洗6BV，30％乙醇洗4BV，85％乙醇洗6BV，收集洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，冷冻干燥，得深黄色粉末(5g)。

采用化学法(发泡试验、Liebermann-Burchard、Salkowaki反应)和薄层层析鉴定所得到的粉末中含有大蒜总皂苷(见图3)。经采用实施例1所述方法测定粉末中的总皂苷含量以知母皂苷A-Ⅲ计为37.38％，出膏率为0.10％(按生品计算：大蒜总皂苷出膏率＝总皂苷重量/大蒜生品重量×100％)，0.262％(按干品计算：出膏率＝总皂苷重量/(大蒜生品重量-大蒜含水量)×100％)

实施例3：大蒜总皂苷的制备、定性和定量

大蒜20kg，粉碎(直径0.5-1cm)，双提2次，水提1次，分别加5、4、4倍水，每次0.5小时，药液减压回收水(温度＜80℃)，浓缩1∶1.2(60℃相对密度1.05)，水浓缩液加乙醇醇沉，使含醇量达到80％，放置过夜，离心，得药液I；药渣(淋干)，加3倍95％乙醇回流2次，每次1小时，得药液II，合并药液I、II，减压回收(25℃，相对密度1.10)，加水稀释至提取药材的0.6倍(12000mL)，离心，药液减压回收(温度＜80℃)，上清液过AB-8，上样量1∶0.9，水洗5BV，30％乙醇洗2BV，95％乙醇洗4BV，收集洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，减压干燥(温度＜60℃)，得棕色粉末(26.6g)。

采用和实施例2中相同的方法测定粉末中的总皂苷含量为34.6％，出膏率为0.133％(按生品计算)，0.349％(按干品计算)。

实施例4：大蒜总皂苷的制备、定性和定量

大蒜5kg，粉碎(直径0.5-1cm)，双提1次，水提1次，分别加5、4倍水，每次1小时，药液减压回收水(温度＜80℃)，浓缩至1∶0.8(60℃相对密度0.9)，水浓缩液，加乙醇醇沉，使含醇量达到75％，放置过夜，离心，得药液I；药渣(淋干)，加5倍95％乙醇回流1次，每次1h，得药液II，合并药液I、II，减压回收(25℃，相对密度1.06)，加水稀释至提取药材的0.8倍(4000mL)，离心，药液减压回收(温度＜80℃)，上清液过HPD100上样量1∶1.1，水洗4BV，30％乙醇洗3BV，90％乙醇洗5BV，收集洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，冷冻干燥，得黄棕色粉末(2.8g)。

采用和实施例2中相同的方法测定粉末中的总皂苷含量为50.67％，出膏率为0.056％(按生品计算)，0.147％(按干品计算)。

实施例5：不同批次制备的大蒜总皂苷的含量测定

进一步对部分批次获得的样品进行总皂苷含量测定，结果见下表6。

表6

批次	总皂苷含量(％)
		080901(实施例4)	50.67
090730	42.50
		090928	53.82
100830	31.64

实施例6：本发明的方法和现有技术方法的比较

采用CN200910103133.0的方法、对照品和本申请的方法、对照品，对本申请的样品进行了含量测定，所述含量测定的方法参考罗红，刘福玉，李慧等.“比色法测定大蒜总皂苷含量”，华南国防医学杂志，2009，23(5)：51-53，测定结果如下表7。

表7

从实验结果中可以看出，采用CN200910103133.0提供的对照品人参皂苷Re及文献中提供的方法与本申请建立的方法和采用的对照品知母皂苷元A-Ⅲ来测定同一批样品，其结果显示：专利CN200910103133.0所测得样品含量比本申请测得含量偏高，在CN200910103133.0中提供的样品最高含量为44.10％，如果采用本申请的方法与对照品测定，则这个数值可能更低；相反本申请样品不论采用哪种方法测定含量均超过它们提供的最高值，从这一点来看本申请样品质量(即样品有效成分含量)与对比专利相比有优势。

实施例7：大蒜总皂苷对肿瘤细胞的生长抑制作用的研究

MKN45细胞用含10％新生牛血清的1640完全培养基(NaHCO3.2g，100U/mL青霉素，100μg/mL链霉素)培养，37℃、5％CO₂培养箱中培养至细胞覆盖率80～90％以上时传代，选取生长状态良好的细胞用于实验研究。采用MTT法(李仪奎主编，中药药理实验方法学，上海科学技术出版社，2006：782)测定大蒜总皂苷对胃癌MKN45细胞增殖的抑制并测定药物半数抑制浓度(IC50)。

收集对数生长期MKN45细胞，以3×10⁴/孔的密度加入96孔板，每孔100μl。将不同质量浓度的药物(批号为090730和100622的大蒜总皂苷)各100μl加入实验孔，使大蒜总皂苷的终浓度分别20、10、5、2.5、1.25、0.625、0.3125、0.156、0.078、0.0395、0.0198、0.0099、0.0049、0.00248、0.00124、0.00064、0.00032、0.00016mg/ml。同时设立空白对照、阴性对照组和阳性对照组，其中阴性对照孔接种等量细胞，并加入含终浓度为0.1％的DMSO的完全培养液；空白孔不接种细胞，只加入等量完全培养液；顺铂作为阳性对照组，其剂量按临床用量换算，终质量浓度为0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125、0.00625、0.003125、0.00156、0.00078、0.0004、0.0002、0.0001mg/ml。每一浓度设3个复孔，培养48、72小时。每孔加入5mg/ml MTT溶液10μl，继续培养4小时，去上清，每孔加入200μl DMSO，震荡溶解10分钟，室温10分钟，在酶标仪570nm处测光密度(OD)值，计算细胞抑制率、绘制细胞增殖抑制曲线并测定药物半数抑制浓度(IC50)。

计算细胞抑制率的公式：细胞抑制率(％)＝(阴性对照组OD值-实验药物组OD值)/(阴性对照组OD值-空白组OD值)×100％；以药物浓度为横坐标、存活率为纵坐标绘制浓度效应曲线，求出回归方程，得出抑制50％细胞生长的浓度(IC50)。实验结果见表8、表9。

表8 大蒜总皂苷对肿瘤细胞(人胃癌MKN45细胞)杀伤作用的半数致死量(IC50)

表9 大蒜总皂苷对肿瘤细胞(人胃癌MKN45细胞)增殖的抑制率

此外，采用同样方法，测定了大蒜总皂苷对其他肿瘤细胞杀伤作用的半数致死量，结果见表10。

表10 大蒜总皂苷对肿瘤细胞(人胃癌MKN45、AGS、HGC、宫颈癌HeLa、肝癌HepG2细胞)杀伤作用的半数致死量(IC50)

以上结果表明，大蒜总皂苷对不同肿瘤细胞株均具有杀伤作用。

实施例8：大蒜总皂苷对于T淋巴细胞增殖的实验研究

受试药物：大蒜总皂苷提取物5#、(2+5)#、2#+5#由中国中医科学院中医基础理论研究所中药质量分析室制备并提供，上述样品以DMSO溶解，实验前配制。

阳性药物：ConA

动物：SD大鼠，雄性，体重(180±10)g，清洁级动物，实验动物室提供。

试剂：淋巴细胞分离液(Sigma公司)、RPMI1640培养基(GIBCO公司)；胎牛血清(GIBCO公司)；DMSO(Sigma)等购自北京奥信拓普科技有限公司，快速细胞增殖检测试剂盒(Bio-Vision公司)；

仪器：全自动酶标仪，Thermo MK-3；CO2培养箱，Revco 300T；倒置显微镜，OLYMPUS-IMT-2；洁净工作台BCN-1360B型，北京东联哈尔仪器制造有限公司；微量移液器，德国Eppendorf；台式高速离心机TDL-40B型，上海安亭科学仪器厂；电子分析天平，CP64上海奥豪斯公司。

实验方法：

麻醉SD大鼠，取出脾脏；将脾剪碎成单细胞(取上清液)缓慢加入预先已加入淋巴细胞分离液的离心管中，脾悬液与分离液的比例为1∶1。以4℃、2000r/min离心20分钟，液相分为三层，用微量进样器抽取中层淋巴细胞放入无菌的离心管中。PBS洗涤2次，均以2000r/min离心10分钟，弃上清。用少量RPIM1640培养液(含10％血清)打散，用血细胞计数板统计调节细胞初始浓度至1×10⁶/ml，取100μl加入96孔培养板，于37℃、5％CO2培养箱中培养24小时。

将不同质量浓度的药物各100μl加入实验孔，使终浓度分别20、10、5、2.5、1.25、0.625、并同时设立空白对照和阳性对照组，空白对照组加入100μl无菌生理盐水，在阳性药物对照组中加入100μl ConA(终浓度为5μg/ml)，每一浓度设3个复孔，培养48、72小时。每孔加入5mg/ml WST溶液20μl，继续培养4小时，在酶标仪于450nm波长读取各孔吸光度(A)，以A值反映淋巴细胞增殖率。结果见表11。

表11 大蒜成分对大鼠脾淋巴细胞增殖(A)影响的WST检测

注：与对照组比^**：p＜0.001，^*：p＜0.01

与对照组比较，大蒜总皂苷提取物5#、(2+5)#、2#+5#对大鼠T淋巴细胞增殖具有明显的促进作用(p＜0.01)，其中(2+5)#促增殖作用更为明显(p＜0.001)。

实施例9：大蒜总皂苷的急性毒性测定

ICR小鼠，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供。许可证编号：SCXK(京)2007-0001。体重：19.68±0.73g。性别：雌雄各半。每组10只。

试验方法：

给药途径：口服灌胃。

将小鼠随机分为5组，分别1次给予受试样品(本发明的大蒜总皂苷)23.53、20.00、17.00、14.45、12.28g/kg(剂量系数i＝0.85)。给药后观察小鼠在外观，行为活动，精神状态等方面的变化，共观察7天，记录各组死亡数。

实验采用BLISS法设计。统计学t检验。结果表明大蒜总皂苷小鼠口服给药的LD₅₀为17.09g/kg，具有安全低毒的效果。

实施例10：大蒜总皂苷小鼠S180移植瘤的抑制作用

ICR小鼠，70只，18-20g，雌雄各半，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号SCXK(京)2007-0001。试验开始前给予常规基础饲料适应5天～7天。小鼠的饲养环境为屏障环境，温度为21～25℃，相对湿度40～70％。

试验方法：

每只动物右腋皮下接种S180肉瘤细胞2×10⁶，24小时后，随机分为7组，分别为空白组(给同量生理盐水)、模型组(给与同量的溶剂对照)、阳性药组(环磷酰胺25mg/kg，腹腔注射，2天1次。生产厂家：天津金世制药有限公司，批号：20091101)、大蒜总皂苷样品高、中、低剂量组口服给药，连续10天，观察抑瘤率及给药前后的体重变化。

本发明的大蒜总皂苷对小鼠肉瘤S180模型的抑瘤作用结果见表12和图9。

表12 大蒜总皂苷对小鼠肉瘤S180模型的抑瘤作用

Claims (5)

1.一种大蒜总皂苷的制备方法，所述方法包括以下步骤：

1)将大蒜粉碎后双提，得挥发油、药液和药渣；

其中，所述步骤1)包括：

将大蒜粉碎成颗粒，双提1-3次，水提1-2次，分别加3-9倍水，每次0.5-2小时，从而得挥发油、药液和药渣；

2)将经步骤1)得到的药液减压回收水，浓缩后加乙醇醇沉，离心，得药液I；

其中，所述步骤2)包括：

将大蒜提取挥发油后的剩余药液在温度<80℃下减压回收水，以大蒜g/mL药液为单位计，将药液浓缩至1：0.8-1.2，使药液在60℃下的相对密度为0.9-1.10，得到的浓缩液加乙醇，使含醇量达到70％-80％，醇沉过夜，离心，得上清药液I；

3)将经步骤1)得到的药渣加乙醇回流提取，得药液II；

其中，所述步骤3)包括：

将大蒜提取挥发油后的剩余药渣淋干水分，加3-5倍95％乙醇回流，提取1-2次，每次0.5-1.5小时，得药液，合并为药液II；

4)合并药液I、II，减压回收乙醇至无醇味，加水稀释，离心，得上清药液III；

5)将药液III过大孔树脂，依次水洗和/或乙醇洗，收集洗脱液，减压回收乙醇，减压干燥、喷雾干燥或冷冻干燥；

其中，所述步骤5)包括：

将药液III过苯乙烯型大孔树脂，按照树脂与生药重量比计，上样量为1:0.8-1.1，依次水洗4-6BV和/或30％乙醇洗2-4BV，70％-95％乙醇洗4-6BV，收集水洗后乙醇洗脱液，或30％乙醇洗脱后的乙醇洗脱液，减压回收乙醇至无醇味，温度<60℃下减压干燥、喷雾干燥或冷冻干燥。

2.如权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤4)包括：

合并药液I、II，减压回收至无醇味，使其25℃下相对密度为1.00-1.10，加水稀释，加水量为药材重量的0.5-0.9倍，离心，得上清药液III。

3.如权利要求1所述的制备方法，其中，所述步骤5)中的所述树脂选自DM-130、AB-8或HPD100。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法制得的大蒜总皂苷在制备抗肿瘤药物中的应用。

5.如权利要求1-3中任一项所述的方法制得的大蒜总皂苷在制备增强免疫力的保健品和食品中的应用。