CN102138998B

CN102138998B - 枳椇子总黄酮提取物及其在制备抗疲劳、抗缺氧或抗高原缺氧药物或食品中的应用

Info

Publication number: CN102138998B
Application number: CN201110087638XA
Authority: CN
Inventors: 嵇扬; 郑悦
Original assignee: Drug & Instrument Inspection Institute Minister Of Health P L A General Logistics Department
Current assignee: Drug & Instrument Inspection Institute Minister Of Health P L A General Logistics Department
Priority date: 2011-04-08
Filing date: 2011-04-08
Publication date: 2013-04-24
Anticipated expiration: 2031-04-08
Also published as: CN102138998A

Abstract

本发明公开了一种枳椇子总黄酮提取物及其制备方法与应用。该枳椇子总黄酮提取物中总黄酮含量为50-60％；其含有下述质量百分含量的黄酮类物质：杨梅素5-10％、二氢杨梅素1-5％、槲皮素1-10％、二氢槲皮素1-5％、山奈酚0.5-1％和芹菜素0.5-2％。通过实验证明，枳椇子总黄酮提取物具有显著的抗疲劳活性、抗缺氧活性以及抗高原缺氧活性。

Description

枳椇子总黄酮提取物及其在制备抗疲劳、抗缺氧或抗高原缺氧药物或食品中的应用

技术领域

本发明涉及一种枳椇子总黄酮提取物及其在制备抗疲劳、抗缺氧或抗高原缺氧药物或食品中的应用。

背景技术

枳椇子为鼠李科拐枣属植物枳椇(Hovenia acerbaLindl.L)、北枳椇(Hovenia dulcisThunb.)的干燥成熟种子，资源丰富，在陕西、广东、湖北、浙江、江苏、安徽、福建等地都有分布。枳椇子含有的化合物主要有生物碱类化合物【Makoto Takai，YukioOgihara，et al.New peptide alkaloids from Hovenia dulcis and H.tomentella，Phytochemistry，1973；12(12)：2985～2986】；芳香酸类化合物、黄酮类化合物和蒽醌类化合物【沙美，丁林生。枳椇子的化学成分研究，中国药科大学学报，2001；32(6)：418～420】；皂甙类化合物【衣淑珍，傅秋生。枳椇子益智成分研究，第二军医大学学报，2009；30(11)：1281～1287】；脂肪酸类化合物【李克明，任丽娟。枳椇子化学成分的研究-脂肪油中脂肪酸成分分析，中草药，1997；28(11)：653、678】等。目前，从枳椇子中分离出的黄酮类化合物，主要包括：二氢槲皮素(Dihydroquercetin)、槲皮素(Quercetin)、二氢杨梅素(Dihydromyricetin)、杨梅素(Myricetin)、二氢山奈酚(Dihydrokaempferol)、山奈酚(Kaempferol)、3，3’，5，5’，7-五羟基二氢黄酮(3，3：5，5：7-pentahydro-flavanone)和4’，5’，7-三羟基-3’，5’-二甲氧基黄酮(4’，5，7-trihydroxy-3’，5’-methoxy flavanone)等【丁林生，梁侨丽，腾艳芬。枳椇子黄酮类成分研究，药学学报，1997；32(8)：600～602；李克明，任丽娟。枳椇子化学成分研究II黄酮类成分的分离与鉴定，中草药，1999；30(增刊)：60】。

枳椇子水提取液能够减轻非酒精性脂肪性肝炎(NASH)模型大鼠肝组织的脂质沉积和炎性浸润【张敏娜，冯慧，等。氧化应激对非酒精性脂肪性肝炎发病的影响及枳棋子水提取液干预作用，浙江中西医结合杂志，2009；19(5)：276～277】，体内试验，对小鼠移植性肿瘤H₂₂的生长有抑制作用【嵇扬。枳椇子水提取物细胞毒作用与抑瘤功效的研究，中医药学刊，2003；21(4)：538，543】，临床应用能明显改善血脂各项指标【杨丽华。枳椇子对血脂异常患者的调脂作用，中国老年学杂志，2010；30(19)：2852～2853】，可以显著提高小鼠肝脏乙醇脱氢酶的活性【汤银红，丁斌如。枳椇子水提物对乙醇脱氢酶活性的影响，中药药理与临床，2004；20(2)：24】。枳椇子乙醇提取后醋酸乙酯萃取物能够明显降低肝纤维化模型大鼠肝组织中TGF-β的表达量，降低透明质酸(HA)含量，减少肝细胞坏死以及炎性细胞浸润【王飞，张洪，等。枳椇子醋酸乙酯提取物对肝纤维化大鼠血清学指标及TGF-β的影响，中药材，2006；29(6)：577～580】，并具有体外清除羟自由基作用【王飞，张洪，等。枳椇子各部位清除羟自由基作用的比较，华西药学杂志，2006；21(1)：48～50】，对大鼠肝P450同工酶的影响表现出特异性【张洪，宋娟，等。枳椇子醋酸乙酯提取物对大鼠肝同工酶的影响，中国中药杂志，2007；32(18)：1917～1921】。体内试验显示，枳椇子提取物能改善D-半乳糖致亚急性衰老小鼠的学习记忆能力，减轻组织或细胞的过氧化损伤，减少脂质过氧化物的形成，又能增加体内抗氧化酶的活性以增加对自由基损伤的防御功能【汪海涛，嵇扬，等。枳椇子提取物对D2半乳糖致亚急性衰老小鼠氧化损伤的保护作用，中国药学杂志，2008；43(8)：591～593，605】。

发明内容

本发明的目的是提供一种枳椇子总黄酮提取物及其制备方法。

本发明所提供的枳椇子总黄酮提取物，其总黄酮含量为50-60％；所述枳椇子总黄酮提取物中主要含有下述质量百分含量的黄酮类物质：杨梅素5-10％、二氢杨梅素1-5％、槲皮素1-10％、二氢槲皮素1-5％、山奈酚0.5-1％和芹菜素0.5-2％。

上述黄酮类化合物的结构式如下所示：

(式I)

杨梅素：式I中R₁＝OH，R₂＝OH，R₃＝OH的化合物；

槲皮素：式I中R₁＝OH，R₂＝H，R₃＝OH的化合物；

山奈酚：式I中R₁＝H，R₂＝H，R₃＝OH的化合物；

芹菜素：式I中R₁＝H，R₂＝H，R₃＝H的化合物。

(式II)

二氢杨梅素：式II中R₁＝OH，R₂＝OH的化合物；

二氢槲皮素：式II中R₁＝OH，R₂＝H的化合物。

制备所述枳椇子总黄酮提取物的方法，包括下述步骤：

1)将粉碎的枳椇子加水进行回流提取，收集提取液；

2)将所述提取液进行浓缩，得到浓缩液；向所述浓缩液中加入质量浓度为93％-97％的乙醇水溶液进行沉淀，过滤，收集滤液并浓缩除醇，得到醇沉液；

3)向所述醇沉液中加入乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯层，得到枳椇子总黄酮提取物。

其中，步骤1)中，所述粉碎的枳椇子为粗粉(符合中国药典对粗粉的规定)；所述回流提取至少进行一次，优选进行两次并合并两次的提取液；每次提取的时间可为30-60分钟，优选为30分钟；每次提取时，所述枳椇子与水的质量可比为1∶(10-12)，优选质量比为1∶12。

步骤2)中，所述浓缩液是指将所述提取液浓缩至20下℃测定的相对密度为1.01-1.03的浓缩液。所述浓缩液与所述乙醇水溶液的体积比为1∶(1-3)，优选体积比为1∶2。所述乙醇水溶液优选质量浓度为95％的乙醇水溶液；所述沉淀的时间为11-12小时。

步骤3)中，所述萃取至少进行两次，优选进行三次；每次萃取时，所述醇沉液与乙酸乙酯的体积比为1∶(1-2)，优选体积比为1∶1。

上述方法还包括将步骤3)得到的枳椇子总黄酮提取物进行浓缩除去乙酸乙酯溶剂并干燥的步骤。

本发明的再一个目的是提供枳椇子总黄酮提取物的应用。

本发明所提供的枳椇子总黄酮提取物的应用是其制备下述任意一种产品中的应用：1)抗疲劳药物；2)抗疲劳保健品；3)抗疲劳食品；4)抗缺氧药物；5)抗缺氧保健品；6)抗缺氧食品；7)抗高原缺氧药物；8)抗高原缺氧保健品；9)抗高原缺氧食品。

本发明还保护一种药物，该药物可为抗疲劳药物、抗缺氧药物或抗高原缺氧药物；所述药物的活性成分为本发明提供的枳椇子总黄酮提取物。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

用枳椇子总黄酮提取物制备的抗疲劳、抗缺氧或抗高原缺氧药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、口服液等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明还保护一种保健品，该保健品可为抗疲劳保健品、抗缺氧保健品或抗高原缺氧保健品；所述保健品中包含本发明提供的枳椇子总黄酮提取物。

本发明同时还保护一种食品，该食品可为抗疲劳食品、抗缺氧食品或抗高原缺氧食品；所述食品中包含本发明提供的枳椇子总黄酮提取物。

本发明通过一定的提取纯化工艺得到枳椇子总黄酮提取物。采用大鼠跑步试验，以组织中各类生化指标为参数对枳椇子总黄酮提取物进行抗疲劳试验，结果表明：枳椇子总黄酮提取物具有显著的抗疲劳活性；采用MTT法，用H9C2(大鼠心肌细胞系)对枳椇子总黄酮进行了细胞活性检测实验和抗缺氧试验，实验结果发现其具有显著的抗缺氧活性；采用小鼠在低压氧舱中模拟高原环境对枳椇子总黄酮进行抗高原缺氧试验，实验结果发现枳椇子黄酮类化合物具有显著的抗高原缺氧活性。

附图说明

图1为芦丁的标准曲线图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此。

下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和生物材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例中所用槲皮素标准品由中国药品生物制品检验所提供；二氢槲皮素标准品、芹菜素标准品、由上海源叶生物科技有限公司提供；杨梅素、二氢杨梅素标准品由上海同田生物科技有限公司提供。

实施例1、制备枳椇子总黄酮提取物

1、秤取枳椇子粗粉即全部可通过2号筛的粉体(符合中国药典对粗粉的规定)5kg，加入12倍质量的水，回流提取30分钟。

2、倾出提取液，药渣按照第一次提取的条件重复回流提取一次，合并两次提取液。

3、将提取液进行浓缩，至得到相对密度为1.02(20℃测定)的浓缩液。向浓缩液中加入两倍浓缩液体积的质量浓度95％乙醇水溶液，搅拌均匀，静置12小时。

4、将醇沉后溶液过滤，滤液真空浓缩至无醇，得到醇提液。

5、向醇提液加入等体积的乙酸乙酯进行萃取，重复萃取3次，合并乙酸乙脂层。

6、将乙酸乙酯层浓缩、干燥得到，得到16g枳椇子总黄酮提取物干粉。

采用紫外分光光度计法测定提取物中总黄酮和采用高效液相色谱法测定杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素、二氢槲皮素、山奈酚和芹菜素的含量。具体方法如下：

1.紫外分光光度计法

1.1标准曲线制作方法：

取20mg芦丁对照品(芦丁对照品：中国药品生物制品检定所，批号100080-200306)，用水溶解于50ml容量瓶中；分别取2.5、5、7.5、10、12.5ml芦丁标准液于25ml容量瓶中；加入0.75ml 5％NaNO₃溶液，摇匀；6min后加入0.75ml 10％Al(NO₃)₃溶液，摇匀；6min后加入10ml 4％NaOH溶液，摇匀；用甲醇定容；测定OD500；以OD500为横轴，芦丁含量为纵轴，制作标准曲线图。

1.2样品检测方法

取少量样品，称重；溶于4ml甲醇中；取2ml样品溶液于25ml容量瓶中；加入0.75ml 5％NaNO₃溶液，摇匀；6min后加入0.75ml 10％Al(NO₃)₃溶液，摇匀；6min后加入10ml 4％NaOH溶液，摇匀；用甲醇定容；测定OD₅₀₀；根据标准曲线计算黄酮含量。

1.3对照设置

与标准曲线和样品检测同时设置对照溶液。于25ml容量瓶中加入0.75ml5％NaNO₃溶液，摇匀；6min后加入0.75ml 10％Al(NO₃)₃溶液，摇匀；6min后加入10ml4％NaOH溶液，摇匀；用甲醇定容；测定OD₅₀₀。

2.高效液相色谱法

2.1色谱条件

Diamonsil^RC18色谱柱(250mm×4.6mm，5μl，DIKMA)；流动相A为含0.1％乙酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱，洗脱程序见表1-1；流速0.8mL/min；柱温30℃；检测器波长290nm；进样体积5μl；分析时间120min。

表1-1梯度洗脱程序

2.2标准品溶液的配制

精密秤取各标准品(杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素、二氢槲皮素、山奈酚、芹菜素)一定量，用甲醇溶解并定容于10ml容量瓶中，配成相应浓度的标准品溶液，4℃冰箱中备用。

2.3样本制备

精密称取枳椇子总黄酮提取物0.0210g，加甲醇8ml，充分溶解后，定容于10ml容量瓶。

2.4实验步骤

准确移取枳椇子总黄酮提取物各10ul，按照色谱条件进行分别测定，相同条件下再进各标准品溶液各10ul，标识相应峰，并计算峰下面积。

2.5数据分析

采用Shimadzu LCsolution工作站进行分析。

(二)总黄酮测定结果

2.1总黄酮含量

通过紫外分光光度法，得到芦丁的标准曲线为y＝0.2642x-0.0056，r²＝0.9963(见图1)。重复提取八批次，测定得到枳椇子总黄酮提取物中总黄酮含量为50-60％。

2.2高效液相色谱结果

通过高效液相色谱对样品及目前得到的标准品的检测，我们测定出上述枳椇子总黄酮提取物(重复提取八批次)中主要含有下述质量百分比的黄酮化合物：杨梅素5-10％、二氢杨梅素1-5％、槲皮素1-10％、二氢槲皮素1-5％、山奈酚0.5-1％、芹菜素0.5-2％。

实施例2、枳椇子总黄酮提取物的抗疲劳实验

1、试验药物

实施例1制备的枳椇子总黄酮提取物，其中总黄酮含量为53.08％；诺迪康胶囊由四川诺迪康威光制药有限公司提供。

2、试验动物

SD大鼠(上海斯莱克实验动物有限责任公司，合格证号SCXK(沪)2007-0005)。

3、仪器及试剂

半自动生化仪(Screen Master3000)；酶标仪(Thermo)；水浴锅(恒科DK-8AD)；动物跑步机(成都泰盟科技有限公司FT-200)；肝肌糖原检测试剂盒(南京建成，批号20100526)；肌酸激酶检测试剂盒(长征，批号20100403)；乳酸脱氢酶检测试剂盒(长征，批号20100415)；乳酸检测试剂盒(南京建成，批号20100526)；乙酰胆碱酯酶检测试剂盒(南京建成，批号20100516)；血尿素氮检测试剂盒(南京建成，批号20100519)；总抗氧化能力检测试剂盒(南京建成，批号20100526)；考马斯亮蓝蛋白检测试剂盒(南京建成，批号20100502)；超氧化物歧化酶检测试剂盒(南京建成，批号20100526)；丙二醛检测试剂盒(南京建成，批号20100526)；血糖检测试剂盒(长征，批号批号20100329)；血红蛋白检测试剂盒(南京建成，批号20100522)等。

4、试验方法

将56只SD大鼠完全随机分成7组，分别为正常组、低剂量组(4mg/kg/d枳椇子总黄酮提取物)、中剂量组(8mg/kg/d枳椇子总黄酮提取物)、高剂量组(16mg/kg/d枳椇子总黄酮提取物)、诺迪康药组(280mg/kg/d)、杨梅素组(1mg/kg/d)和模型组。每组每天分别按1ml/100g体重灌胃给药，其中正常组和模型组灌胃给水，共给药7天。给药期间，还对大鼠进行跑步适应性训练，速度为15m/min，每天30min。第8天，除正常组外所有大鼠进行速度为25m/min的跑步，1h后立即处死。分两部分取血，一部分抗凝，一部分不抗凝。取肝脏、肌肉和脑。正常组直接处死，取血、肝脏、肌肉、脑。3000r/min离心取血清、血浆，并保存血细胞。所有样本立即存于-70℃冰箱。使用试剂盒检测相应指标。

5、试验结果

见表1。

表1枳椇子抗疲劳活性数据

与模型组比较，标记“*”表示P＜0.05，标记“**”表示P＜0.01

由表1可见，枳椇子总黄酮提取物对大鼠组织中疲劳相关的能量储备减少、代谢产物堆积、自由基过量等都有明显的改善。

上述实验结果表明，枳椇子总黄酮提取物具有抗疲劳作用，因此可用于制备抗疲劳药物或食品。

实施例3、枳椇子总黄酮提取物的抗缺氧实验

1、试验药物

实施例1制备的枳椇子总黄酮提取物，其中总黄酮含量为53.08％。

2、细胞株

大鼠心肌细胞系H9C2由中国科学院上海细胞生物研究所提供。

3、培养液

DMEM培养液+10％胎牛血清。

4、其它材料

胰酶(Invitrigen)；DMSO(sigma)；MTT(sigma)；培养皿(Corning)；移液管(Corning)；96孔板(Corning)；CO₂孵箱(SANYO)；酶标仪(Biotek76833)等。

5、试验方法

以104个/孔的细胞浓度接种96孔板，每孔100μl，在37℃5％CO₂、95％空气条件下培养。24小时后，加入样品液，设立复孔、DMSO缺氧对照和DMSO正常对照各3个，37℃，5％CO₂作用2h。将培养板转入无氧培养箱中，37℃5％CO₂、95％N₂条件下培养24h。每孔加入10μl 5mg/ml MTT(噻唑蓝)，37℃5％CO₂、95％空气条件下共孵育4h后，每孔加入150μl DMSO溶液，于37℃下摇床震荡15min，用酶标仪检测570nm下的OD值。

6、试验结果

见表2。

表2枳椇子总黄酮抗缺氧活性

表1中，OD值越接近正常对照组抗缺氧效果越好，“*”表示与缺氧对照组比较P＜0.05。

由表1可见，枳椇子总黄酮提取物对缺氧大鼠心肌细胞有保护作用。

上述实验结果表明，枳椇子总黄酮提取物具有抗缺氧作用，因此可用于制备抗缺氧药物或食品。

实施例4、枳椇子总黄酮提取物的抗高原缺氧实验

1、试验药物

2、试验动物

昆明种小鼠，雄性，SPF级(中国药品生物制品检定所；合格证号SCXK(京)2009-0017)

3、仪器及试剂

全自动生化仪(Beckman LX-20)；血糖试剂盒(德国，prodia dianostics 090700)谷丙转氨酶试剂盒(德国，prodia dianostics 110801)；谷草转氨酶试剂盒(德国，prodia dianostics 011501)；肌酸激酶检测试剂盒(烟台澳斯邦生物工程有限公司101101)；乳酸脱氢酶检测试剂盒(德国，prodia dianostics 091300)；血尿素氮检测试剂盒(德国，prodia dianostics 090900)等。

4、试验方法

将40只小鼠完全随机分成4组，分别为正常组、模型组、枳椇子总黄酮提取物组(16mg/kg/d)、诺迪康药组(280mg/kg/d)组。每组每天分别按0.4ml/20g体重灌胃给药，其中正常组和模型组灌胃给水，共给药5天。进入低压氧舱，模拟10000m海拔，5小时后拔眼球取血，3000r/min离心取血清。使用试剂盒检测相应指标。

5、试验结果

见表3。

表3、小鼠10000m海拔、5小时停留后生化指标改变

注：★标识为与模型组比，差异显著；*标识为与空白组比，差异显著。

由表1可见，枳椇子总黄酮提取物对小鼠因高原缺氧所致谷丙转氨酶、谷草转氨酶、乳酸脱氢酶、肌酸激酶、尿素氮等的改变都有明显的改善。

上述实验结果表明，枳椇子总黄酮提取物具有抗高原缺氧作用，因此可用于制备抗高原缺氧药物或食品。

Claims

1.一种制备枳椇子总黄酮提取物的方法，包括下述步骤：

1）将粉碎的枳椇子加水进行回流提取，收集提取液；

2）将所述提取液进行浓缩，得到浓缩液；向所述浓缩液中加入质量浓度为93%-97%的乙醇水溶液进行沉淀，过滤，收集滤液并浓缩除醇，得到醇沉液；

3）向所述醇沉液中加入乙酸乙酯进行萃取，收集乙酸乙酯层，得到枳椇子总黄酮提取物；

步骤1）中，所述粉碎的枳椇子为枳椇子粗粉；所述回流提取至少进行一次；所述回流提取的时间为30-60分钟；每次提取时，所述枳椇子与水的质量比为1：10-12；

步骤2）中，所述浓缩液是指将所述提取液浓缩至20℃下测定的相对密度为1.01-1.03的浓缩液；所述浓缩液与所述乙醇水溶液的体积比为1：1-3；所述乙醇水溶液为质量浓度95%的乙醇水溶液；所述沉淀的时间为11-12小时；

步骤3）中，所述萃取至少进行两次；每次萃取时，所述醇沉液与乙酸乙酯的体积比为1:1-2。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中，所述回流提取进行两次；每次提取的时间为30分钟；每次提取时，所述枳椇子与水的质量比为1：12；

步骤2）中，所述浓缩液与所述乙醇水溶液的体积比为1:2。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3）中，所述萃取进行三次；每次萃取时，所述醇沉液与乙酸乙酯的体积比为1:1。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于：所述方法还包括对步骤3）得到的枳椇子总黄酮提取物进行浓缩、干燥的步骤。

5.权利要求1-4中任一项所述方法制备得到的枳椇子总黄酮提取物。

6.根据权利要求5所述的枳椇子总黄酮提取物，其特征在于：所述枳椇子总黄酮提取物中总黄酮含量为50-60%；所述枳椇子总黄酮提取物含有下述质量百分含量的黄酮类物质：杨梅素5-10%、二氢杨梅素1-5%、槲皮素1-10%、二氢槲皮素1-5%、山奈酚0.5-1%和芹菜素0.5-2%。

7.权利要求5或6所述的枳椇子总黄酮提取物在制备下述任意一种产品中的应用：1）抗疲劳药物；2）抗疲劳保健品；3）抗疲劳食品；4）抗缺氧药物；5）抗缺氧保健品；6）抗缺氧食品；7）抗高原缺氧药物；8）抗高原缺氧保健品；9）抗高原缺氧食品。

8.一种药物，其活性成分为权利要求5或6所述的枳椇子总黄酮提取物；所述药物为抗疲劳药物或抗缺氧药物或抗高原缺氧药物。

9.一种保健品，其包含权利要求5或6所述的枳椇子总黄酮提取物；所述保健品为抗疲劳保健品或抗缺氧保健品或抗高原缺氧保健品。

10.一种食品，其包含权利要求5或6所述的枳椇子总黄酮提取物；所述食品为抗疲劳食品或抗缺氧食品或抗高原缺氧食品。