CN112933120B - 贝壳杉提取物在制备抗非酒精性脂肪肝的产品中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了贝壳杉提取物(Agathis dammara，AD)的药物新用途。所述新用途为贝壳杉提取物在制备抗非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)的产品中的应用。本发明采用两种与临床相关的非酒精性脂肪肝疾病模型：蛋氨酸‑胆碱缺乏饮食(methionine and choline‑deficient diet，MCD diet)和高脂饮食(high‑fat diet，HFD)诱导的C57BL/6小鼠非酒精性脂肪肝。实验证明，将贝壳杉提取物口服灌胃，能明显抑制MCD饮食和高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝的发生、发展，可用于非酒精性脂肪肝的防治。

Description

贝壳杉提取物在制备抗非酒精性脂肪肝的产品中的应用
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及贝壳杉提取物在制备抗非酒精性脂肪肝的产品中的应用。
背景技术
贝壳杉(拉丁名Agathis dammara)乔木，分类学上属于裸子植物门，松柏纲，松柏目，南洋杉科，贝壳杉属，主要分布在亚洲热带地区，我国厦门、福州等地引种栽培。其叶中挥发油主含萜类化合物，其中β-荜澄茄烯为其主要成分，此外还含烷、醇、酮及少量的醛、醚和酯等化合物，在医药、香料、日化等方面有重要用途，在植物化学分类学中亦有重要意义。贝壳杉的药理作用可大致分为以下几方面：抗肿瘤；抗菌；抗炎；镇静；平喘作用。
非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除酒精之外其他明确的损肝因素所致的肝细胞内脂肪过度沉积为主要特征的临床病理综合征，包括单纯性脂肪肝(simple fatty liver，SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis， NASH)及其相关肝硬化。随着肥胖及其相关代谢综合征全球化的流行趋势，NAFLD现已成为欧美等发达国家和我国富裕地区慢性肝病的重要病因，普通成人NAFLD的患病率为10％～30％，其中10％～20％为NASH，后者10年内肝硬化发生率高达25％。NAFLD的发病机制主要与过多的热量摄入而导致的肥胖有关，有些学者认为 NAFLD与胰岛素抵抗密切相关。近年来有研究表明，炎性介质和细胞因子如肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-α，TNF-α)、白介素、转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、成纤维细胞生长因子21(fibroblast growth factor 21，FGF21)、血清瘦素(serumleptin)水平在NAFLD发病机制中也起着一定作用。NAFLD目前尚无理想的特效治疗药物，目前临床仅采用改善胰岛素抵抗、维护机体内环境脂质代谢、能量代谢和抗氧化物的平衡等方法，促使机体保持在适应性反应阶段，延缓或阻止脂肪性肝病的病理进展。
目前尚无贝壳杉及其单体成分对NAFLD相关作用的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种贝壳杉提取物的新用途。
本发明所提供的贝壳杉提取物新用途是其在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的产品中的应用。
所述非酒精性脂肪肝(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)，包括单纯性脂肪肝(simple fatty liver，SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，NASH) 及其相关肝硬化。
具体的，所述非酒精性脂肪肝可为高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝和/或蛋氨酸、胆碱缺乏(methionine choline deficient diet,MCD)饮食诱导的非酒精性脂肪肝。
进一步的所述贝壳杉提取物的应用还可包括下述至少一种：
1)在制备抑制肝脏脂质沉积的产品中的应用；
2)在制备抑制肝脏损伤的产品中的应用；
3)在制备抑制肝脏炎症和脂质合成相关因子表达的产品中的应用；
4)在制备降低肝脏和血清中甘油三酯(TG)水平的产品中的应用。
其中，所述肝脏脂质沉积包括肝脏组织脂质沉积和/或肝脏细胞脂质沉积。
所述抑制肝脏损伤具体体现在抑制血清中谷丙转氨酶(alanineaminotransferase， ALT)的水平。
所述炎症的相关因子为白细胞介素-6(interleukin-6，IL-6)和/或肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor-α，TNF-α)。
所述脂质合成的相关因子为乙酰辅酶A羧化酶1(acetyl-CoA carboxylase 1，ACC1)。
所述产品包括药物和/或保健品。
本发明中所述贝壳杉提取物为贝壳杉的乙醇提取物或贝壳杉的乙醇水溶液提取物；所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为60％-100％(具体可为95％)。
本发明中所述贝壳杉的乙醇提取物或贝壳杉的乙醇水溶液提取物均可按照现有公开的方法进行制备。
如可参考下述方法进行制备：将贝壳杉根干燥、粉碎后，用体积分数95％乙醇的浸泡，加热至微沸状态，进行回流提取，收集提取液，浓缩、干燥，得到贝壳杉提取物。
上述方法中，所述浸泡的时间可为1h；所述回流提取至少进行1次，优选进行3 次；每次回流提取的时间为1-2小时。
本发明中所述贝壳杉提取物中活性成分为C01(式I)、C02(式Ⅱ)、C03(式Ⅲ)、 C04(式Ⅳ)。
Figure BDA0002310216920000031
进一步的，本发明还分别保护上述四种单体的应用。
本发明所述的四种单体的应用是C01(式I)、C02(式Ⅱ)、C03(式Ⅲ)、C04(式Ⅳ)中的至少一种在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的产品中的应用。
所述非酒精性脂肪肝可为高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝和/或蛋氨酸、胆碱缺乏 (methionine choline deficient diet,MCD)饮食诱导的非酒精性脂肪肝。
以贝壳杉提取物或上述任一所述单体为活性成分制备的药物也属于本发明的保护范围。
所述药物可通过注射、口服、喷射、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。
需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。
所述药物可以制成注射液、悬浮剂、粉剂、片剂、颗粒剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。
本发明采用两种与临床相关的非酒精性脂肪肝模型：MCD饮食和高脂饮食诱导的小鼠NAFLD。实验证明，将贝壳杉提取物口服灌胃，能明显抑制MCD饮食和高脂饮食诱导的小鼠NAFLD的发生、发展，明确其有效活性单体成份为扁柏酮、CAS: 112971-23-0、南洋杉酮、南洋杉醇酮，可用于非酒精性脂肪肝疾病的防治。
本发明提供的抗非酒精性脂肪肝的药品安全、低毒，药理作用较强；其原料来源丰富，可从贝壳杉植物中提取得到。本发明为预防、诊断、检测、保护、治疗和研究非酒精性脂肪肝病提供了一种新的药物来源，且容易推广应用，能够在较短的时间内产生巨大的社会效益和经济效益。
附图说明
图1为贝壳杉提取物(AD)灌胃减轻MCD饮食诱导的小鼠肝脏脂质沉积。
图2为贝壳杉提取物(AD)灌胃减轻MCD饮食诱导的小鼠肝脏损伤。
图3为贝壳杉提取物(AD)灌胃降低MCD饮食诱导的小鼠肝脏脂质合成和炎症因子的高表达。包括：Q-PCR检测小鼠肝脏组织中ACC1及炎性因子IL-6和 TNF-α的表达。
图4为贝壳杉提取物(AD)灌胃降低高脂饮食(HFD)诱导的小鼠体重上升。
图5为贝壳杉提取物(AD)灌胃降低高脂饮食(HFD)诱导的小鼠血脂升高。
图6为贝壳杉提取物(AD)灌胃减轻高脂饮食(HFD)诱导的小鼠肝脏脂质沉积。
图7为贝壳杉提取物(AD)灌胃减轻高脂饮食(HFD)诱导的小鼠肝脏损伤。
图8为贝壳杉提取物(AD)抑制TNF-α诱导的HepG2细胞炎症。包括：MTT 检测贝壳杉提取物的最大安全剂量。
图9为贝壳杉提取物(AD)及其单体成分抑制油酸(oleic acid，OA)诱导的 HepG2细胞脂质沉积。包括：MTT检测贝壳杉单体的最大安全剂量。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的定量试验，均设置5-6次重复实验，结果取平均值。
实施例1、贝壳杉提取物(AD)及其单体的制备
1、贝壳杉提取物的制备
干燥、粉碎的贝壳杉根粉末(367g)，放入3.0L的圆底烧瓶中，加入95％乙醇2.5L浸泡1h后，加热至微沸状态，加热回流提取2h，提取液趁热过滤。药渣再用95％乙醇2.0L，加热回流提取2次，每次1.5h。合并滤液，旋转蒸发仪浓缩、真空干燥、称重，得到贝壳杉提取物105.3g(提取率：28.7％)。
2、单体的制备
取上述制备的贝壳杉提取物(100.0g)，加1.0L的水混悬，用二氯甲烷进行萃取，每次萃取剂用量1.0L，萃取3次，合并萃取液，得到二氯甲烷层萃取物34.0g。
二氯甲烷层萃取物(34g)按1：2的比例用硅胶拌样，上到柱体积为3.3L的硅胶柱层析进行纯化，依次用二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇进行梯度洗脱，洗脱梯度为纯二氯甲烷、二氯甲烷/甲醇50：1、20：1、10：1、5：1、2：1、1：1，纯甲醇(v/v)，每个梯度6L。随后依据薄层层析结果，合并相同组分，共得到22个流份。将1号流份(4.4g)拌入7.0g硅胶中，上样至硅胶柱(柱体积261ml)，分别用石油醚、石油醚/乙酸乙酯洗脱，洗脱梯度为石油醚(600ml)、石油醚/乙酸乙酯30：1、20：1、 10：1、5：1、4：1、3：1、2：1、1：1(每个梯度各400ml)。用薄层色谱法合并相同流份，得到9个子流份(A～I)。子流份A在室温重结晶得到化合物1(12.5mg)，子流份G、H、I分别室温重结晶得到单体化合物2、3、4。
采用HPLC法分析检测各单体的纯度，各单体纯度＞95％。检测条件如下：
流动相：乙腈100％；流速：1ml/min；色谱柱：Welch Ultimate XB-C18(250mm ×4.6mm i.d.，5μm)；柱温：40℃；检测波长：254nm,210nm。
运用质谱、核磁共振谱对化合物的结构进行鉴定。
化合物1，ESI-MS m/z 301[M+H]+，1H-NMR(CDCl3,600MHz)δH:6.85 (1H,br.s),6.63(1H,br.s),3.15(1H,m),1.26(6H,d,J＝7.0Hz),1.23(3H,s,),1.16 (3H,s),1.13(3H,s)；13C-NMR(CDCl3,151MHz)δC:218.0,151.2,145.7,132.5, 126.9,126.7,111.9,50.6,47.4,37.6,37.1,34.7,30.2,27.0,26.9,24.7,22.7,22.6, 21.1,20.5。
化合物2，ESI-MS m/z 301[M+H]+，1H-NMR(CDCl3,600MHz)δH:5.49 (1H,br.s),1.13-1.18(12H)；13C-NMR(CDCl3,151MHz)δC:216.8,184.3,133.9, 122.7,51.6,50.6,47.5,42.4,42.1,38.0,35.2,34.7,33.0,25.6,23.9,22.7,19.7,19.6,14.8。
化合物3，ESI-MS m/z 301[M+H]+，1H-NMR(CDCl3,600MHz)δH:5.50 (1H,m),4.40(2H,s),3.26(1H,br.s),2.70(1H,td,J＝14.6,5.3Hz),2.29(1H,br.d,J＝ 11.5Hz),2.27(1H,dt,J＝14.7,3.8Hz),2.14(1H,m),2.12(1H,m),2.10(1H,m),1.94(1H, m),1.75(1H,br.dd,J＝6.2,3.1Hz),1.73(1H,m),1.68(1H,m),1.63(1H,td,J＝12.8,3.7 Hz),1.56(1H,dd,J＝12.2,4.1Hz),1.50(1H,td,J＝13.9,4.0Hz),1.45(1H,qd,J＝12.5, 4.2Hz),1.14(3H,s),1.10(6H,s),1.07(3H,s)；
13C-NMR(CDCl3,151MHz)δC:216.5,214.9,133.3,123.3,64.1,51.5,50.7,47.4,45.9,41.7,38.0,35.3,34.6,32.5,25.6,23.9,22.6,19.5,18.9,14.8。
化合物4，ESI-MS m/z 301[M+H]+，1H-NMR(CDCl3,600MHz)δH:6.20 (1H,s),6.04(1H,s),5.56(1H,m),4.40(2H,d,J＝3.8Hz),3.23(1H,br.t,J＝4.5Hz),2.31 (1H,br.d,J＝14.1Hz),2.15(1H,dd,J＝14.1,2.6Hz),2.10(1H,m),2.00(1H,m),1.94 (1H,m),1.86(1H,dd,J＝12.2,3.9Hz),1.81(1H,m),1.78(1H,m),1.65(1H,td,J＝13.4, 3.9Hz),1.51(1H,m),1.22(3H,s),1.17(3H,s),1.10(3H,s),1.10(3H,s)；13C-NMR (CDCl3,151MHz)δC:214.7,200.5,143.7,133.1,123.8,123.6,64.1,48.6,48.1,45.9,43.4, 42.0,36.4,32.4,25.4,22.9,22.5,19.3,19.0,16.0。
将四个单体分别命名为C01(hinokione,式I)；C02 (1,2,3,4,4α,4β,5,6,7,8,8α,9-dodecahydro-2,4β,8,8-tetramethyl-7-oxo-2-Phenanthrenecarbo xylic acid,式Ⅱ)；C03(Araucarone,式Ⅲ)；C04(Araucarenolone,式Ⅳ)。
分子结构式如下所示：
Figure BDA0002310216920000061
实施例2、贝壳杉提取物及其单体的药效学试验
1.实验材料
1.1实验动物
实验所用小鼠为平均体重20-25g的雄性C57BL/6小鼠，购自北京大学医学部—实验动物中心，遵循实验室动物护理原则(NIH出版号85-23，修订版1996)，并且实验方案得到北京大学医学部动物伦理委员会的批准：所有小鼠在12小时光照/12 小时黑暗循环下饲养，自由获取食物和水。
1.2动物饲料
动物繁殖饲料为商品化供应的啮齿类动物用饲料，包括普通饲料，蛋氨酸胆碱缺乏饲料和高脂饲料。
2.体内实验方法
2.1 MCD饮食诱导的非酒精性脂肪肝模型的建立
采用8周龄的雄性C57BL/6小鼠，使用MCD饲料喂饲，连续7天造模，得到 MCD饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝模型。
2.2高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝模型的建立
采用8周龄的雄性C57BL/6小鼠，使用高脂饲料喂饲，连续6周造模，得到高脂饮食诱导的小鼠非酒精性脂肪肝模型。
2.3贝壳杉提取物抗非酒精性脂肪肝的药效作用
2.3.1贝壳杉提取物抗MCD饮食诱导的非酒精性脂肪肝的药效作用
将雄性C57BL/6野生型小鼠随机均分为对照组(6只)、MCD模型组(6只)、贝壳杉提取物(200mg/kg，6只)给药组。每天灌胃一次，模型组小鼠喂饲MCD饮食7天造成非酒精性脂肪肝模型；给药组在造模的前一天给予药物。实验持续7天后，处死动物取材。
2.3.2贝壳杉提取物抗高脂饮食(HFD)诱导的非酒精性脂肪肝的药效作用
将雄性C57BL/6野生型小鼠随机均分为对照组(6只)、HFD模型组(9只)、贝壳杉提取物(100mg/kg，6只)给药组、贝壳杉提取物(200mg/kg，9只)给药组。每天灌胃一次，模型组小鼠喂饲高脂饮食6周造成非酒精性脂肪肝模型；给药组在造模的前一天给予药物。实验持续6周后，处死动物取材。
2.4动物操作
2.4.1采集小鼠血清
小鼠摘眼球取血约600μL，37℃孵育30min，用离心机4000rpm离心30min，取上层血清，冻存于-30℃冰箱备用。
2.4.2小鼠取材
称取小鼠体重，记录体重值。摘眼球取血后处死，大头针固定解剖盘(塑料泡沫盒)中。切开小鼠皮肤及皮下薄膜，暴露出内脏各器官。心脏磷酸盐缓冲溶液(phosphatebuffered solution，PBS)灌流后用镊子捏住边缘膜系结构完整剪下整个肝脏，放入10 cm培养皿中，称量记录肝脏重量值。留取同一部位肝脏进行形态学检测，取剩余肝脏分成小块，立即冷冻于液氮中，之后保存于-80℃。样品用于脂质抽提和RNA提取。
另外，留取形态学观察的肝脏组织使用4％多聚甲醛固定过夜，之后转入20％蔗糖。肝脏组织经脱水、固定、包埋后制备冰冻切片，用于油红O染色。
2.5RNA提取
(1)从-80℃取出组织后，按每100mg组织或六孔板每孔1mL的量加入 Trizol匀浆，室温(肝脏组织)或冰上(细胞)静置5min。
(2)4℃，12000rpm离心10min(细胞提取RNA时省略这一步)。
(3)取上清，加入氯仿200L，剧烈混匀30s，室温静置3min。
(4)4℃，13000rpm离心15min。
(5)取上清(450L)，加入450L预冷的异丙醇，上下颠倒混匀5s，室温静置 10min。
(6)4℃，13000rpm离心10min。
(7)弃上清，加入1mL预冷的75％乙醇(DEPC水配制)洗涤沉淀。
(8)4℃，13000rpm离心10min。再洗涤一次，重复(7)(8)。
(9)室温干燥RNA。
(10)用适量二乙基焦磷酰胺(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水溶解RNA，并使用NanoDropTM微量紫外-可见光分光光度计测定其浓度和质量。RNA样品保存于 -80℃。
2.6脂质抽提
(1)肝组织：从-80℃取出的肝脏组织块称重后，迅速放入含1mL预冷的PBS 的EP管，匀浆器匀浆15s。
(2)将匀浆液转移至10mL的玻璃管，加入2：1(体积比)的氯仿/甲醇溶液 4mL，封口膜封盖。
(3)剧烈涡旋，充分混匀匀浆液和氯仿/甲醇溶液，离心(4℃，2000rpm)30min 分相。
(4)将上层水相转移至新的玻璃管中，再抽提一次(细胞脂质抽提省略这一步)。
(5)将下层有机相转移到另一只玻璃管中，注意避免吸到两相界面处的蛋白层和残留的水相。
(6)向装水相的玻璃管中加入3mL氯仿/甲醇溶液，封口膜封盖，剧烈涡旋混匀后，离心(4℃，2000rpm)30min分相，弃上层水相(细胞脂质抽提省略这一步)。
(7)取下层有机相，转入第一次抽提得到的有机相中。
(8)氮气吹干有机相，加3％Triton X-100(v/v)500μL(肝组织)或50μL(细胞)，反复吹打后，置于恒温摇床，50℃振荡30min以促进脂质溶解。
(9)使用由3％Triton X-100配制的标准品测定样品中的总胆固醇(totalcholecterol，TC)和TG水平，并以称取的肝脏重量或细胞蛋白浓度校正，即为肝脏组织或细胞中的TC/TG含量。
2.7油红O染色
(1)冰冻切片晾干，细胞爬片PBS洗3次。
(2)4％多聚甲醛固定10min。
(3)双蒸水洗三次(组织切片1min/次)。
(4)60％异丙醇孵育10min。
(5)油红O染色30min：油红O为H2O与0.5％贮备液(溶于异丙醇)按2： 3体积比稀释后过滤所得，过滤后1-2h内使用。
(6)60％异丙醇漂洗2次。
(7)双蒸水洗2次。
(8)苏木精染核1-3min。
(9)双蒸水洗2次。
(10)90％甘油封片，照相。
3.体外实验方法
3.1HepG2细胞的培养与体外细胞脂质沉积及炎症模型的建立。
(1)复苏后的细胞传代两次后接种六孔板或十二孔板。
(2)加50mM 10％胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)的达尔伯克(氏)改良伊格尔(氏)培养基(dulbecco's modified eagle medium，DMEM)培养12h，实验组同时给予药物孵育，由二甲基亚砜(Dimethyl Sulphoxide，DMSO)溶解，对照组及模型组给予同浓度DMSO。
(3)细胞去除培养基，PBS洗涤细胞3次，每孔加入1mL Trizol用于提取 RNA、细胞油红O染色或脂质抽提。
3.2MTT实验
(1)收集对数生长期的HepG2细胞。
(2)调整细胞悬浮液的浓度：在超净台里，用酒精将细胞计数板和盖玻片擦洗干净，取细胞悬浮液20μL，用枪头抵住盖玻片一侧的中间部位打入计数板中。在低倍镜视野下，数位于四个方角的4个大方格内的细胞，求平均值浮液的浓度即为：平均值×104(个/mL)。96孔板每个孔接种的细胞数目为1×104个(每个孔加100μL)，用完全培养基来调整细胞悬浮液的浓度。
(3)按实验需求分组：调零组(不含HepG2细胞)、对照组、给药组(设6个平行孔)。
(4)将96孔板在37℃孵箱内(相对湿度90％，CO2浓度5％)孵育，至细胞铺满孔底，用空白培养基(不含FBS)饥饿12h之后，换成含有0.3mmol/L油酸(oleic acid，OA)的完全DMEM(含有10％FBS)，继续孵育24h。然后往给药组中加入浓度呈梯度的药物(AD及其单体)，继续培养12h。
(5)终止培养，吸弃培养液，每孔加入5.0g/L的四甲基偶氮唑盐 (3-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT)溶液20μL，于37℃细胞培养箱中再培养4h。
(6)4h后吸去上清(注意不要吸走孔底的紫色结晶)。每孔加入150μL的 DMSO，并放入酶标仪，振板10min，使蓝色结晶甲臜完全溶解，然后在540nm波长处测吸光值，按以下公式计算出细胞存活率：
细胞存活率＝(给药组-调零组)/(对照组-调零组)
3.3贝壳杉提取物抗HepG2细胞炎症的药效作用
HepG2细胞接种于六孔板，密度调整为2×105个/mL，用含10％FBS DMEM培养至贴壁，用含0.5％FBS的空白DMEM饥饿细胞24h。用含有100ng/mL TNF-α的完全DMEM(含有10％FBS)培养HepG2细胞，给药组同时给予25μg/mL贝壳杉提取物孵育。培养12h后收集细胞，用于检测炎症因子表达。
3.4贝壳杉提取物及其单体成分抗HepG2细胞脂质沉积的药效作用
HepG2细胞接种于十二孔板，接种细胞浓度为2×105个/mL，用含10％FBS DMEM培养至贴壁，用空白DMEM(不含FBS)饥饿12h。用含有0.3mmol/L OA 的完全DMEM(含有10％FBS)培养HepG2细胞24h后，给药组分别给予12.5 μg/mL贝壳杉提取物、25μmol/L的单体孵育12h。然后进行细胞油红O染色或细胞脂质抽提。
实验结果：
1.贝壳杉提取物(AD)灌胃抑制MCD饮食诱导的小鼠NAFLD
1.1AD对MCD饮食诱导的小鼠肝脏脂质沉积的影响
NAFLD最主要的病理征是肝脏脂质沉积。因此，我们对实验小鼠肝脏进行冰冻切片和油红O染色，并进行肝脏组织脂质抽提。结果表明：模型组小鼠的肝脏脂质沉积较Control组显著性加重，TG水平显著上调，TC水平没有明显变化，而AD给药显著抑制肝脏脂质沉积和TG水平(图1)。
1.2AD对MCD饮食诱导的小鼠肝脏损伤的影响
NAFLD的特征之一是肝脏损伤。谷丙转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase，AST)是反映肝细胞损伤的酶，ALT主要存在于肝细胞浆中，AST主要存在于肝细胞浆的线粒体中。当肝细胞损伤时，ALT首先进入血中；当肝细胞严重损伤、危及线粒体时，AST也会进入血中。因此，ALT反映了早期肝损伤水平。我们对实验小鼠血清中ALT、AST进行了检测。结果表明：模型组小鼠血清ALT和AST表达量较Control组显著性上调，而AD给药显著抑制 ALT的水平，但对AST水平没有显著影响(图2)，说明AD可以减轻MCD饮食诱导的早期肝损伤。
1.3AD对MCD饮食诱导的小鼠脂质合成基因和炎症因子高表达的影响
NAFLD病理进展往往伴随肝细胞炎症，同时脂质合成增加。因此，我们对实验小鼠脂质合成相关基因及炎症因子mRNA表达水平进行了检测。结果表明：模型组小鼠肝脏组织中ACC1、IL-6、TNF-α的mRNA表达量较Control组显著性上调，而AD给药显著抑制以上基因的mRNA表达(图3)。
2.贝壳杉提取物(AD)灌胃抑制高脂饮食诱导的小鼠NAFLD
2.1 AD对高脂饮食诱导的小鼠体重上升的作用
AD抗非酒精性脂肪肝药效实验中，模型组小鼠进行高脂饮食喂饲，给药组小鼠在造模同时灌胃给予AD。6周后小鼠处死取材，结果表明：与Control组相比，模型组小鼠体重显著上升；造模同时给予100mg/kg或200mg/kg的AD能抑制HFD 诱导的小鼠体重上升(图4)。
2.2 AD对高脂饮食诱导的小鼠血脂水平升高的影响
高脂饮食可以造成血脂水平的升高。因此，我们对实验小鼠血清中的TG、TC水平进行了检测。结果表明：模型组小鼠的血清TG和TC较Control组显著上调，而AD 200mg/kg给药组则显著降低HFD诱导的小鼠TG水平的升高，但对TC 水平没有影响(图5)。
2.3 AD对高脂饮食诱导的小鼠肝脏脂质沉积的影响
NAFLD最主要的病理特征是肝脏脂质沉积。因此，我们对实验小鼠肝脏进行冰冻切片和油红O染色，并进行肝脏组织脂质抽提。结果表明：模型组小鼠的肝脏脂质沉积较Control组加重，TG和TC水平显著上调，而AD给药显著抑制HFD诱导的小鼠肝脏脂质沉积和TG水平的升高，但对TC水平没有显著影响(图6)。
2.4 AD对高脂饮食诱导的小鼠肝脏损伤的影响
肝脏损伤是非酒精性脂肪肝的重要特征。当肝细胞损伤时，ALT首先进入血中，当肝细胞严重损伤、危及线粒体时，AST也会进入血中。因此，ALT反映了早期肝损伤水平。我们对实验小鼠血清中ALT、AST进行了检测。结果表明：模型组小鼠血清ALT和AST表达量较Control组显著性上调，而AD给药(100mg/kg或200 mg/kg)均显著抑制HFD诱导的小鼠血清ALT水平的升高，但对AST水平没有显著影响(图7)，说明AD可以减轻高脂饮食诱导的早期肝损伤。
3.在HepG2细胞上验证AD抑制肝细胞脂质沉积和抗炎症的作用
3.1贝壳杉提取物(AD)对HepG2细胞炎症的影响
在HepG2细胞上进行AD的MTT实验，进行药物最大安全浓度筛选。并且选择安全浓度孵育细胞，同时采用TNF-α刺激细胞炎症反应，抽提RNA检测炎症相关基因的表达。结果表明：AD(25μg/mL)在体外水平能显著抑制TNF-α诱导的IL-6 表达的上调，对IL-1β的上调也有降低趋势(图8)。
3.2贝壳杉提取物(AD)及其单体成分对HepG2细胞脂质沉积的影响
在HepG2细胞上进行贝壳杉单体的MTT实验，筛选药物最大安全浓度。以OA 孵育HepG2细胞24h造成肝细胞脂质沉积模型，再用药物最大安全浓度孵育细胞， 12h后对细胞进行油红O染色或脂质抽提。结果表明：AD(12.5μg/mL)及其四个单体成分(25μmol/L)在体外细胞水平均能够显著抑制OA诱导的肝细胞脂质沉积(图 9)。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

Claims (3)

1.贝壳杉提取物在制备预防和/或治疗非酒精性脂肪肝的药物中的应用；
所述贝壳杉提取物为贝壳杉根的乙醇或乙醇水溶液的提取物；所述乙醇的体积分数为60-100%。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述非酒精性脂肪肝为高脂饮食诱导的非酒精性脂肪肝和/或蛋氨酸、胆碱缺乏饮食诱导的非酒精性脂肪肝。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述预防和/或治疗非酒精性脂肪肝体现在下述至少一方面：
1)抑制肝脏脂质沉积；
2)抑制肝脏损伤；
3)抑制肝脏炎症和脂质合成相关因子表达；
4)降低肝脏和血清中甘油三酯水平。
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非酒精性脂肪肝发病机制和治疗的研究进展;郭亮等;《生命科学》;20181130;第30卷(第11期);第1165-1172页 *

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