KR20160139072A - 딱지꽃 추출물 또는 이로부터 유래된 폴리페놀계 화합물을 유효성분으로 하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 딱지꽃 추출물 또는 이로부터 유래된 폴리페놀계 화합물을 유효성분으로 하는 비만 및 2형 당뇨 등의 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

Description

딱지꽃 추출물 또는 이로부터 유래된 폴리페놀계 화합물을 유효성분으로 하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition comprising Ptentilla Chinensis extract or isolated polyphenolic compounds for prevention or treatment of metabolic disease}

본 발명은 딱지꽃 추출물 또는 이로부터 유래된 폴리페놀계 화합물을 유효성분으로 하는 비만 및 2형 당뇨 등의 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

비만과 2형 당뇨는 현재 세계에서 가장 큰 건강상 위협되는 질환 중의 하나이다. 2형 당뇨의 발병의 가장 중요한 특징은 인슐린 저항성이다. 아직 정확한 메카니즘을 밝혀지지 않았지만 지방조직, 골격 근육 및 간과 같은 당을 대사하는 주요한 기관들이 인슐린 저항성(insulin resistance)에 매우 중요한 역할을 가질 것으로 생각된다. 최근의 연구들은 이러한 기관에서의 미토콘드리아 장애가 인슐린 저항성, 비만을 포함한 많은 종류의 대사질환과 관련이 있을 것으로 시사한다(Kelley et al . Diabetes. 2002;51(10):2944-2950; Petersen et al . Science. 2003;300(5622):1140-1142) 미토콘드리아 기능을 향상시키는 것은 비만 및 당뇨에서 인슐린 저항성을 치료하고 예방하는 데 새로운 치료적 접근법을 제공할 수 있을 것이다(Liu et al . Adv Drug Deliv Rev. 2009;61(14):1343-1352)

AMP-activated protein kinase(AMPK)는 세포 에너지 상태의 센서이며 세포 대사를 조절하는 데 중요한 역할을 한다(Hardie et al . Nat Rev Mol Cell Biol. 2007;8(10):774-785) AMPK는 AMP/ADP에 의하여 직접적으로 활성화되거나 upsteam kinases, liver kinase B1(LKB1) 또는 Ca2+/칼모듐(calmodium) 의존성 프로테인 키나아제에 의한 스레오닌 잔기 172(threonine residue 172)의 인산화를 통하여 활성화된다.

AMPK는 acetyl-CoA carboxylase를 인산화하고 저해하는 지방산 합성에 매우 중요한 효소이며, 지방산 산화를 촉진하고 지방의 축적을 감소시킨다(Fullerton et al . Nat Med. 2013;19(12):16491654; O’'NeillHM et al . Mol Cell Endocrinol. 2013;366(2):135-151). AMPK는 미토콘드리아 산화 물질대사와 관련된 유전자들의 전사를 조절하는 peroxisome proliferator-activated receptor-γ coactivator1α(PGC1α)를 직접적으로 인산화시키고 활성화시킴으로써 미토콘드리아 기능을 향상시키는 것으로 알려져 있다(Jager et al . Proc Natl Acad Sci USA. 2007;104(29):12017-12022).

두 개의 독립된 그룹은 PGC1α가 Sirtuin1(Sirt1)의 활성화를 통하여 AMPK에 의해 조절된다는 것을 보여준다(Canto et al. Curr Opin Lipidol. 2009; 20(2):98-105; Fulco et al . Dev Cell. 2008;14(5):661-673). Fulco et al은 AMPK에 의한 Sirt1 활성화가 주로 nicotinamide-phosphoribosyltranferase(NAMPT)의 up-regulation에 의해 주로 매개된다는 것을 제안하였다. NAMPT는 nicotin amide를 nicotinamide adenine dinucleotide(NAD+)의 산화로 전환되는 것을 촉매한다. 반면, 다른 그룹들은 AMPK가 NAD+대 nicotine-amide adenine dinucleotide reduced form(NADH)의 비율을 NAMPT 활성과는 독립적으로 바꿈으로써 Sirt1을 활성화시키고 궁극적으로 PGC1α활성에서 변화를 유도한다는 증거를 제공했다(Rodgers et al . Nature. 2005;434(7029):113-118; Lagouge et al . Cell. 2006;127(6):11091122). 더구나, AMPK 활성화는 autophagy activating kinase 1 복합체와 같은 unc-51의 인산화를 통하여 자식작용(autophagy)을 직접적으로 자극하거나 Mammalian target of rapamycin(mTOR) signaling 억제를 통하여 간접적으로 자식작용(autophagy)을 자극한다. 오토파지는 지방 덩어리(lipid droplet)의 축적을 방지하고 지방대사를 조절한다. AMPK의 활성화는 인슐린 저항성을 감소시키고 지방산의 대사를 조절하고 미토콘드리아 기능을 향상시키고 오토파지를 통하여 손상된 미토콘드리아를 제거함으로써 비만 및 2형 당뇨 치료의 잠재적 치료제로서 가능성을 제공한다(Hardie et al . Diabetes. 2013;62(7):21642172; Liesa et al . Cell Metab. 2013;17(4):491-506).

한편, 딱지꽃은 학명은 Ptentilla Chinensis이며, 장미과(Rosaceae)의 일종이다. 직사광선이 내리쬐는 아주 건조한 하천 상류의 계류구간이나 해변의 자갈모래땅 바닥에 붙어사는 하원초본식생을 특징짓는 종이다. 드물게 주 서식지 주변의 인공 제방이나 길바닥에서도 관찰되는 식물이다. 잎 뒷면에 백색 솜털이 빼곡히 나 있어 복사열로 인한 극단적 건조를 이겨낸다. 양지꽃속(Potentillaspp.) 가운데에서 가장 극한 건조 환경까지 사는 지표종이다. 이른 봄에 어린잎을 식용했다고 하며, 식물체 전체 또는 뿌리를 건조해서 약으로 사용하기도 했다. 딱지꽃은 위릉채라고 불리기도 하며, 뿌리를 포함한 모든 부분이 약재로 쓰이고 있다. 풍증을 없애주며, 지혈, 해독, 소종 등의 효능이 있으며 적용질환은 풍습성의 근골통증, 폐결핵, 자궁내막염, 월경과다, 토혈, 이질, 혈변 및 종기 등으로 알려져 있으며, 비만 및 당뇨 등의 대사성 질환에 대한 약효는 전혀 알려져 있지 않다.

대한민국등록특허 1,434,994

본 발명자들은 AMPK를 활성화시키면서 지방산의 대사를 조절할 수 있는 물질을 개발하여 결과적으로 당뇨 및 비만 등의 대사성 질환의 예방 및 치료제로 활용할 수 있는 식물 추출물을 찾고자 하였으며 다양한 식물 추출물을 탐색하는 중에 딱지꽃 추출물 또는 이로부터 유래된 폴리페놀계 화합물이 이러한 기능을 가진다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하게 된 것이다.

따라서, 본 발명자들은 딱지꽃 추출물을 유효성분으로 하는 비만 및 2형 당뇨 등의 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명은 딱지꽃으로부터 유래된 폴리페놀계 화합물을 유효성분으로 하는 비만 및 2형 당뇨 등의 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 딱지꽃 추출물(Ptentilla Chinensis )을 유효성분으로 하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 딱지꽃 추출물을 유기용매를 이용하여 분획한 분획물을 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 화학식 1의 폴리페놀계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 딱지꽃 추출물 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 딱지꽃 추출물 추출물 또는 이로부터 유래된 폴리페놀계 화합물들은 대사성 질환을 유발하는 AMPK/Sirt1/PGC1α pathway를 활성화함으로써 열발생에 중요한 견갑골 갈색지방조직 유전자들을 변화시킴으로써 유익한 대사작용을 확인하였으므로, 본 발명의 딱지꽃 추출물 또는 폴리페놀계 화합물은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증 및 비알콜성 지방간 등의 대사성 질환의 치료 등에 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

도 1 은 본 발명의 분획물의 AMPK 및 ACC 활성화에 대한 효과를 보여주는 것이다.
도 2 및 3은 본 발명의 분획물의 autophagy를 유도한다는 것을 보여주는 것이다.
도 4는 본 발명의 분획물의 처리로 인하여 올레산으로 유도된 지방축적을 저해하는 효과를 보여주는 그래프이다.(OA: oleic acid)
도 5는 본 발명의 분획물의 미토콘드리아 기능과 관련된 유전자들의 발현에 미치는 효과를 보여주는 것이다.
도 6은 PGC1α 디아세틸레이션에 대한 Sirt1녹다운으로 인한 효과를 보여주는 것이다.
도 7은 본 발명의 분획물의 간과 iBAT조직에서 PGC1α 디아세틸레이션에 대한 효과를 보여주는 것이다.
도 8은 본 발명의 분획물로 처리된 마우스의 간, skeletal muscle, iBAT에서 AMPK 활성화에 대한 효과를 보여주는 것이다.
도 9는 간(A, B) 및 BAT(C, D)에서 각각 Sirt1, PGC1α, PPARγ의 단백질 함량의 증가를 보여주는 것이다.
도 10은 본 발명의 분획물로 처리된 마우스의 간에서 mRNA 발현 변화를 보여주는 것이다.
도 11은 본 발명의 분획물 또는 대조군으로 처리된 마우스에서 대사표현형의 변화 즉, 체중변화(A) 및 글루코오스 수치변화(B~D)를 보여주는 것이다.
도 12는 본 발명의 분획물 또는 대조군에서 음식섭취(A, B), UCP1단백질의 변화(C) 및 IBAT에서 열발생 유전자들의 발현변화(D)를 보여주는 것이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 딱지꽃 추출물(Ptentilla Chinensis)을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명에서 사용된 용어, “딱지꽃 추출물(Ptentilla Chinensis )”은 식물의 모든 기관, 예를 들어, 뿌리, 가지, 줄기, 잎, 꽃을 모두 포함하여 의미하나, 구체적으로는 지상부 또는 뿌리부이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 ‘추출물’은 상술한 바와 같이 당업계에서 조추출물(crude extract)로 통용되는 의미를 갖지만, 광의적으로는 추출물을 추가적으로 분획(fractionation)한 분획물도 포함한다. 즉, 딱지꽃 추출물은 상술한 추출용매를 이용하여 얻은 것뿐만 아니라, 여기에 정제과정을 추가적으로 적용하여 얻은 것도 포함한다. 예컨대, 상기 추출물을 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 통과시켜 얻은 분획, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 딱지꽃 추출물에 포함되는 것이다.

상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 알코올 또는 이들의 혼합물인 용매로 추출되는 것일 수 있으며, 바람직하게는, 극성 용매 또는 비극성 용매를 이용할 수 있다. 극성 용매로서 적합한 것은, (i) 물, (ii) 알코올(메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올, 노말-프로판올, 이소-프로판올, 노말-부탄올, 1-펜탄올, 2-부톡시에탄올 또는 에틸렌글리콜), (iii) 아세트산, (iv) DMFO(dimethyl-formamide) 및 (v) DMSO(dimethyl sulfoxide)를 포함한다. 비극성 용매로서 적합한 것은, 아세톤, 아세토나이트릴, 에틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 플루오로알칸, 펜탄, 헥산, 2,2,4-트리메틸펜탄, 데칸, 사이클로헥산, 사이클로펜탄, 디이소부틸렌, 1-펜텐, 1-클로로부탄, 1-클로로펜탄, o-자일렌, 디이소프로필 에테르, 2-클로로프로판, 톨루엔, 1-클로로프로판, 클로로벤젠, 벤젠, 디에틸 에테르, 디에틸 설파이드, 클로로포름, 디클로로메탄, 1,2-디클로로에탄, 어닐린, 디에틸아민, 에테르, 사염화탄소 및 THF를 포함한다. 보다 더 바람직하게는 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것이다.

상기 딱지꽃식물의 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조되는 것 일 수 있으나 이에 한정하지 않는다:

1) 딱지꽃식물의 뿌리에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;

2) 단계 1)의 추출물을 식힌 후 여과하는 단계; 및

3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계.

상기 방법에 있어서, 단계 1)의 딱지꽃식물은 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한없이 사용할 수 있다. 상기 딱지꽃식물은 딱지꽃식물의 지상부 또는 지하부를 이용하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

상기 딱지꽃식물의 추출 방법으로는 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류냉각 추출 및 초음파추출 등 당업계의 통상적인 방법을 이용할 수 있으며, 열수 추출 방법으로 1회 내지 5회 추출하는 것일 수 있고, 보다 구체적으로 3회 반복 추출하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 상기 추출용매는 건조된 딱지꽃에 0.1 내지 10배 첨가할 수 있으며, 0.3 내지 5배 첨가하는 것이 바람직하다. 추출온도는 20 내지 40인 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 12 내지 48시간인 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

상기 방법에 있어서, 단계 3)의 감압농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조하는 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

상기 대사성 질환은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간(fatty liver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

또한, 본 발명은 딱지꽃 추출물을 유기용매를 이용하여 분획한 분획물을 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

상기 분획물은 딱지꽃 추출물을 헥산, 클로로포름, 부탄올 및 물 순으로 계통분획하여 얻은 헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 부탄올 분획물 또는 물 분획물인 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다. 상기 헥산은 n-헥산인 것이 바람직하다. 상기 분획물은 상기 딱지꽃 추출물로부터 분획 과정을 1 내지 5회, 바람직하게는 3회 반복하여 수득할 수 있고, 분획 후 감압 농축하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.

상기 대사성 질환은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간(fatty liver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1의 폴리페놀계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

<화학식 1>

상기 화학식 1의 화합물은 딱지꽃 추출물로부터 분리한 것일 수 있으나 이에 한정하지 않으며, 다른 물질로부터 유래한 것 또는 합성한 것 모두 사용가능하다.

상기 대사성 질환은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간(fatty liver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명자들은 딱지꽃 추출물 및 분획물을 제조하기 위해 딱지꽃을 분쇄하여 메탄올에 침지하여 추출하였다. 추출액을 여과하고, 감압 농축하여 메탄올 추출물을 얻었으며, 활성물질을 분리하기 위해 상기 딱지꽃 메탄올 추출물을 헥산, 클로로포름, 부탄올, 물로 용매 분획하여 각각의 분획물들을 얻었으며, 상기 분획들의 HepG2 세포주에서 AMPK 활성화 정도를 측정한 결과 부탄올 분획물에서 보다 우수한 활성을 확인하였다.

본 발명자들은 딱지꽃 추출물로부터 화합물을 분리하기 위하여, 상기 부탄올 분획물을 메탄올/물 혼합용매로 순차적으로 극성을 증가시키면서 역상 컬럼 크로마토그래피(reverse phase column chromatography)를 이용하여 분획으로 분리하였다. 이 분획물을 세파덱스 LH-20(Sephadex LH20)을 사용하여 용출용매로 메탄올/물 혼합용매를 5 ml/분으로 흘려주면서 고속액체크로마토그래피(YMC J'sphere ODS H-80 column, 250×20 mm)를 실시하여 최종적으로 순수한 화합물 (화학식 1)을 얻었다.

본 발명자들은 상기 화합물의 구조를 규명하기 위해, 상기 화합물의 성상, 분자량, 분자식, 질량분석, 1H-NMR 스펙트럼 및 13C-NMR 스펙트럼을 측정한 결과 [Anchana et al, Food Chemistry, 100(2007) 1044-1048; 2005]의 데이터와 일치하였으며, 3,4,5-trihydroxybenzoic acid(화학식 1)로 동정하였다. 딱지꽃으로부터 분리된 화합물의 이화학적 특성과 화학 구조는 실시예 1에 기재된 바와 같다.

본 발명의 조성물 총 중량에 대하여 본 발명의 딱지꽃 추출물 또는 이의 분획물을 0.1 내지 99.9 중량%를 유효성분으로 함유하고, 약제학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제 및 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 본 발명에 따른 조성물을 대사성 질환에 걸린 개체에 투여하는 단계를 포함하는 대사성 질환의 치료 방법을 제공한다.

상기 대사성 질환은 비만, 제 2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증 및 비알콜성 지방간으로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것일 수 있으나 이에 한정하지 않는다.

상기 약학적으로 유효한 양이란 0.0001 내지 100 mg/kg이고, 0.001 내지 10 mg/kg이며, 이에 한정되는 것은 아니다. 투여량은 특정 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여기간, 투여방법, 제거율, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

상기 조성물은 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 조성물은 단독으로, 또는 수술, 방사선 치료, 호르몬 치료, 화학 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

상기 개체는 척추동물이고, 구체적으로는 포유동물이고, 더 구체적으로는 쥐, 토끼, 기니아피그, 햄스터, 개, 고양이와 같은 실험동물이며, 보다 구체적으로는 침팬지, 고릴라와 같은 유인원류 동물일 수 있다.

본 발명에서, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며 물질의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 될 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 상기 약학적 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 딱지꽃 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 딱지꽃 추출물을 유기용매를 이용하여 분획한 분획물을 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 폴리페놀계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물을 제공한다.

상기 폴리페놀계 화합물은 상기 화학식 1일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

상기 대사성 질환은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간(fatty liver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명에서는 딱지꽃 추출물, 이의 분획물 및 상기 분획물로부터 분리한 폴리페놀계 화합물은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증 및 비알콜성 지방간 등의 대사성 질환의 예방 및 개선용 건강식품용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.

본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 건강식품 100 중량부당 0.01~0.04 중량부, 구체적으로는 약 0.02 ~ 0.03 중량부 범위에서 선택할 수 있다.

상기 외에 본 발명의 기능성 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 기능성 식품은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강식품 100 중량부당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 발명의 구체적인 실시예를 통해, 발명의 작용 및 효과를 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 이러한 실시예는 발명의 예시로 제시된 것에 불과하며, 이에 의해 발명의 권리범위가 정해지는 것은 아니다.

< 실시예 1>

딱지꽃 추출물 및 분획물의 제조

건조된 딱지꽃 1 kg을 분쇄하여 메탄올 10 ℓ에 침지하여 2회 추출하였다. 추출액을 여과하고, 감압 농축하여 메탄올 추출물 약 50 g을 얻었다. 활성물질을 분리하기 위해 상기 딱지꽃 메탄올 추출물 50 g을 증류수 1000 ㎖에 현탁시킨 후 헥산, 클로로포름, 부탄올, 물로 용매 분획하여 각각의 분획물인 들을 얻었다. n-핵산 분획물 2 g, 클로로포름 분획물 5 g, 에틸아세테이트 분획물 9.5 g, 부탄올 분획물 8 g을 수득하였다.

딱지꽃 분획물 유래 화합물의 분리

상기 부탄올 분획 (약 5 g)을 20%, 30%, 40%, 50% 메탄올/물 혼합용매로 순차적으로 극성을 증가시키면서 역상 컬럼 크로마토그래피(reverse phase column chromatography)를 이용하여 분리 한후 세파덱스 LH-20(Sephadex LH20)을 사용하여 용출용매로 90% 메탄올/물 혼합용매를 5 ml/분으로 흘려주면서 고속액체크로마토그래피(YMC J'sphere ODS H-80 column, 250×20 mm)를 실시하여 최종적으로 순수한 화합물 (화학식 1)을 얻었다.

화합물의 구조 규명

상기 화합물은 물질의 성상, 분자량, 분자식, 질량분석, 1H-NMR 스펙트럼 및 13C-NMR 스펙트럼을 측정한 결과 [Anchana et al , Food Chemistry , 100(2007) 1044-1048; 2005]의 데이터와 일치하였으며, 3,4,5-trihydroxybenzoic acid(화학식 1)로 동정하였다. 딱지꽃으로부터 분리된 화합물의 이화학적 특성과 화학 구조는 하기와 같다.

1) 성상 : 연한 노란색

2) 분자량 : 170

3) 분자식 : C7H6O5

4) ESI-질량분석 : m/z = 169 [M - H]

5) 1H-NMR :δ7.077. δ3.345, δ2.006, δ1.240 d H 7.20 (2H, s, H-3 and H-7)

6) 13C-NMR :d C 167.39 (C-1),145.84 (C-4 and C-6),138.765 (C-5), 121.72 (C-2), 109.14 (C-3 and C-7)

< 실시예 2>

딱지꽃 분획물의 AMPK 활성화 측정

상기 실시예 1에서 제조된 분획물의 AMPK활성화 정도를 측정하기 위하여 HepG2 세포주가 사용되었으며, 세포들은 10% fetal bovine serum 및 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin)을 포함하는 DMEM 배지에서 유지되었으며, 37℃에서 5% CO2 가습조건에서 배양되었다. HepG2 세포주에서는 부탄올 분획물은 AMPK와 아세틸-CoA carboxylase(ACC)의 인산화와 다운스트림 타겟단백질을 함량의존적 형태(dose-dependent manner)로 증가시켜 AMPK 시그널링을 강하게 활성화시켰다(도1A). AMPK 활성화에 대한 부탄올 분획물의 효과는 AMPK 저해제의 전처리에 특이적이었으며, AMPK와 ACC의 인산화를 유의적으로 약화시켰다(도 1A). AMPK 인산화에 대한 부탄올 분획물의 효과는 클로로포름 분획물(도 1A) 또는 에틸아세테이트 분획물(도 1B) 보다 더 강력하였다. 부탄올 분획물에 의한 AMPK 시그널링의 활성화는 6시간에 극대화되고 24시간까지 유지되었다(도 1C).

< 실시예 3>

딱지꽃 부탄올 분획물에 의한 오토파지(autophagy)의 유도

AMPK의 활성화는 mTOR 또는 ULK1의 직접적인 활성화를 통하여 오토파지(autophagy)을 유도한다. 따라서, 우리는 부탄올 분획물이 오토파지 조절하는지 규명하였다. 부탄올 분획물은 오토파지 수식자(modifier) 단백질인 LC3의 세포질 전구체 형태(cytosolic precursor form)인 LC31을 막 결합 처리된 형태(membrane bound processed form)인 LC3Ⅱ으로의 전환을 증가시킴으로써 자가포식소체 형성(autophagosome formation)을 증가시켰다(도 2 A, B 및 C). 자가포식소체 분해의 저해는 bafilomycin A1(BafA1)의 농도를 포화시킴으로써 LC3Ⅱ 수치의 증가를 초래하였다(도3 A, B 및 C). LC3Ⅱ 수치는 추가적으로 부탄올 분획물의 공통처리에 의하여 증가된다는 것은 자가포식소체 형성에 중요한 역할을 한다는 것을 제안하고 있는 것이다(도 3 A, B 및 C). 다음으로 우리는 세포들을 부탄올 분획물의 존재하에 오토파지 형성을 시각화 하기 위하여 Cherry-LC3 리포터 구조물(reporter construct)로 가지고 감염시켰다. Cherry-LC3-GFP로 안정적으로 감염된 HepG2세포들은 커버슬립(coverslipsdnl)에 도포되었고 12시간동안 50μM 딱지꽃 추출물로 처리되거나 혈청결핍(serum starved) 처리되었다. 그 세포들은 3.7% 파라포름알레히드에 15분 동안 고정되었고 상온에서 5분동안 4‘, 6’-디아미노-2-페닐인돌(4‘,6’-deamino-2-phenylindole)로 염색되었다. 커버슬립은 VECTASHIED 마운팅 배지(Vector Laboratories)를 사용하여 마운팅되고 레이저스캐닝 공초점 현미경(laser scanning confocal microscope(TCS, SPE: Leica Microsystems)를 사용하여 검사하였다. 세포당 반점수는 독립적으로 연구자들이 조사하였다.

세포들이 부탄올 분획물에 노출되었을 때 GFP-LC3 반점(puncta)의 수가 단식에 의하여 유도된 GFP-LC3 반점과 비교하였을 때 유의적으로 증가하였다. 추가적으로, 부탄올 분획물처리는 시간의존적(time-dependent manner)으로 p62 단백질 수치값이 감소하였으며, 이들 감소는 BafA1의 존재하여 확실해져서 이는 부탄올 분획물처리로 오토파직 변화(autophagic flux)에서 증가한다는 것을 시사하는 것이다(도 2 A 및 B).

< 실시예 4>

딱지꽃 부탄올 분획물에 의한 TG 함량 감소효과

최근의 연구들은 AMPK와 오토파지가 지방의 축적을 감소시키고 지방 대사에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. AMPK 활성화에 의한 ACC의 인산화는 지방산의 합성을 저해하고 지방산의 산화를 촉진시키는 반면, 오토파지는 오토파지 소체에서 지방적들을 소화시킴으로써 지방대사를 조절한다. 그러므로 우리는 부탄올 분획물이 올레산(oleic acid)에 의해 유도된 트리글리세라이드(TG) 축적을 감소시키는 능력이 있는 지 검사하였다. 세포들은 지방축적을 유도하기 위하여 12시간동안 10%BSA에서 제조된 올레이트(oleate)(Sigma)로 처리되었고 추가 12시간동안 20μM 또는 50μM 딱지꽃 추출물로 처리하였다. 세포들은 1XPBS로 한번 세척한 후 상온에서 1시간동안 PBS에서 3.7% 포름알데히드로 고정되었다. 고정된 세포들은 물로 세 번 세척한 후 Oil Red O 용액에서 40분 동안 염색하였다. 과도한 염색은 물로 세 번 세척하여 제거되었으며 한번은 60% 이소프로판올(isopropanol)으로 세척된 후 염색된 세포들은 완전히 건조되었다. 염색된 지방적(lipid droplets)은 이소프로판올에서 4% Nonidet P-40에서 용해되었으며 540 nm 흡광도를 측정하여 정량분석되었다. 도 4에서 보여준 것처럼 올레산의 처리는 세포에서 TG의 함량을 극적으로 증가시켰고 이러한 효과는 농도의존적 형태로 부탄올 분획물의 처리에 의하여 유의적으로 감소하였다. 추가적으로 세포 생존력은 세포 성장에 저해효과를 배제하면서 부탄올 분획물 처리에 의하여 영향을 받지 않았다(도4A, B).

이들을 종합하면, 이러한 결과는 부탄올 분획물이 오토파지의 유도와 AMPK의 활성화를 통하여 지방대사에 유익한 효과를 발휘한다는 것을 시사하는 것이다.

< 실시예 5>

딱지꽃 부탄올 분획물에 의한 미토콘드리아 유전자 발현에 대한 효과

AMPK 활성화 및 오토파지는 미토콘드리아 기능과 밀접하다. 우리는 그러므로 부탄올 분획물이 미토콘드리아 생합성과 기능을 조절하는지를 검사하였다. 우리는 우선 미토콘드리아 유전자들의 발현을 검사하였다. Q-PCR분석은 부탄올 분획물처리가 미토콘드리아 거의 모든 측면에서 생합성을 유도하는 master transcription factor인 PGC1α를 현저히 증가시켰다(도 5A). 추가적으로 부탄올 분획물은 mitochondrial transcription factor, nuclear respiratory factor-1 및 nuclear respiratory factor-2를 포함하는 미토콘드리아 생합성과 관련된 PGC1α 타겟 유전자들의 발현을 유의적으로 증가시켰다(도 5A). glutathione peroxidase 1 및 superoxide dismutase 1과 같은 항산화기능을 가지는 유전자들은 또한 부탄올 분획물 처리에 의하여 유의적으로 증가하였다(도 5A). 우리는 추가로 Sirt1 및 peroxisomal proliderator-activated receptor(PPAR)-γ이 지방산 대사에 관여한다는 것과 당대사(glucose metabolism)이 부탄올 분획물처리에 의하여 up-regulation된다는 것을 발견하였다(도 5A). 이들 결과는 부탄올 분획물 처리가 미토콘드리아 생합성 및 기능을 책임지고 있는 유전자들을 up-regulation함으로써 미토콘드리아 기능을 증가시킬 수 있다는 것을 함축하는 것이다. PGC1α의 전사기능(transcription activity)은 번역후 변경(postranslational modification)에 의하여 조절된다. 가역적 아세틸레이션(acetylation)은 PGC1α활성의 주요 조절자이다. 우리는 부탄올 분획물처리후 PGC1α의 아세틸레이션을 조사하였고 부탄올 분획물처리는 PGC1α의 아세틸레이션된 형태(acetylated form)를 감소시켰다(도 6A, B). Sirt1은 기능적으로 작용하고 PGC1α를 디아세틸레이트시켜 전사활성(transcriptional activity)을 증가시킨다. 더구나 Sirt1은 AMPK에 의하여 활성화되며 PGC1α의 디아세틸레이션을 통하여 미토콘드리아 기능에 유익한 효과를 발휘한다. 우리는 Sirt1이 PGC1α 활성화와 미토콘드리아 기능에 대하여 부탄올 분획물의 효과와 관련이 있다고 생각하였다. Sirt1이 최소한 부분적으로 PGC1α활성화를 통하여 미토콘드리아 기능에 대한 부탄올 분획물효과를 매개하는 것을 검사하기 위하여 우리는 shRNA를 사용하여 Sirt1를 녹다운(knockdown)시켰다. 다음의 서열을 가지는 short hairpin RNAs(shRNAs)는 스크램블, GT딱지꽃 추출물A 딱지꽃 추출물딱지꽃 추출물A AG딱지꽃 추출물G TC딱지꽃 추출물 ATCTT 딱지꽃 추출물TAT CCG딱지꽃 추출물 TTC딱지꽃 추출물 CTCCT TCTCT TCACT TTTTT CCAA; shRNA-Sirt1, AAGTT ACTGC AG딱지꽃 추출물G TeGTAA ATT딱지꽃 추출물 TATCC GTTTA CACTC CTGCA GTAAC TTTTT TTTCC AA는 BamHI and EcoRI 사이트를 통하여 RNAi-Ready pSIREN-DNR-DsRed-Express donor vector (CLONTECH)로 서브클론되었다. 이들 벡터는 Lipofectamine 2000 Reagent (Life

Technologies)를 사용하여 세포들로 일시적으로 감염되었다. 세포들은 1X PBS로 세척되었으며 배양되었다. 세포막은 포로테아제(protease)와 포스파타제 저해제(phosphatase inhibitors(Roche)를 포함하는 ice-cold byffer A(10 mM HEPES, pH8; 10 mM KCL; 0.1 mM EDTA, pH8; 0.1 mM EGTA, pH8; 1mM dithiothreitol; 100 mM NaF)에서 용해되었다. 세포질 상등액은 원심분리 후에 수집되었따. 핵 펠렛은 포로테아제(protease)와 포스파타제 저해제(phosphatase inhibitors(Roche)를 포함하는 ice-cold 버퍼 C(20mMHEPES, pH 8; 400mMNaCl; 1 mM EDTA, pH 8; 1 mM EGTA, pH 8; 1 mM dithiothreitol; 100 mM NaF)에 용해되었으며 상등부분의 핵추출물을 수집하기 위하여 원심분리하였다. 전체 핵추출물 중 단백질의 50 마이크로그램은 PGC1α 항체(Santa Cruz Biotechnology)로 면역침강되었고 그 이후 단백질-항체 복합체는 단백질 A/G-커플된 아가로스 비드들(Santa Cruz Biotechnology)을 사용하여 제조자의 프로토콜에 따라 침강되었다. 단백질들은 웨스톤블롯팅에 의하여 분석되었다. Sirt1 녹다운은 부탄올 분획물처리에 의하여 유도되었던 PGC1α의 디아세틸레이트 형태를 유의적으로 감소시켰다(도 6A, B). 추가로 부탄올 분획물은 in vivo에서 PGC1α아세틸레이션을 유의적으로 감소시켰다(도 7 A, B, C, 및 D). 더구나 Sirt1의 넉다운은 PGC1α와 관련유전자들의 발현에 대한 부탄올 분획물의 효과를 유의적으로 블록(block)하였다(도 7 E). 이들 결과들은 미토콘드리아 유전자 발현에 대한 부탄올 분획물효과가 AMPK 활성화에 의존적일뿐 아니라 Sirt1-PGC1α pathway에 의해서도 조절된다는 것을 시사한다.

< 실시예 6>

딱지꽃 부탄올 분획물에 의한 in vivo 효과

모든 동물실험은 연세대 원주 의대 International Animal Care and Use Committee(국제 동물 보호 및 이용 위원회)에 승인을 받았다. C57BL/6 마우스는 RanonBio(요닌, Yonin)에서 구입하였으며, 12시간(오전 6시) 빛을 주고, 12시간을 암흑 상태의 주기로 22~24℃의 상온에서 유지되었다. 10 내지 12주령의 새끼(littermate)들을 두 개의 그룹(그룹당 n=5~7)으로 분류하였다. 마우스들은 9주 실험하는 동안 개별적으로 사육되었다. 마우스들은 saline에 용해된 딱지꽃 추출물을 체중에 대하여 10mg/kg 또는 정상 saline으로 IP 경로로 투여되었다. 체중과 음식섭취는 주입 후 매일 모니터링되었다. 정상적인 음식물을 1주일동안 시행한 후 고지방 음식(high-fat diet, Research Diet D12492)으로 전환되었다. 공급된 혈당수치는 표시된데로 측정되었다. 실험기간 후 마우스들을 죽인후 기관들은 추가 분석을 위하여 수거되었다.

상기 동물인 마우스모델을 사용하여 AMPK의 활성화에 대한 부탄올 분획물의 in vivo 효과들을 알아보려고 하였다. 우리는 대조군(control mouse)에서 AMPK 활성화의 최소 수준을 관찰하였다. 세포들은 1XPBS로 세척되고 단백질분해효소(protease) 및 인산효소 저해제(phosphatase inhibitors, Roche)를 포함하는 방사선면역침강(radioprecipitation)법 버퍼(150mM NaCL; 50mM Tris, pH8; 1% Triton X-100; 0.5% sodium deoxycholate; 및 0.1% sodium dodecyl sulfate)에 의하여 용해되었다. in vivo 샘플을 위하여 조직들은 균질화되고(homogenized) 단백질분해효소(protease) 및 인산효소 저해제(phosphatase inhibitors, Roche)를 포함하는 방사선면역침강(radioprecipitation)법 버퍼에 의하여 용해되었다. 단백질 농도는 Bio-Rad protein assay reagent(Bio-Rad Laboratories)를 사용하여 측정되었다. 표준 웨스턴블롯팅이 수행되고 블롯들은 chemiluminescence UVP Bio-Spectrum 600 imaging system을 사용하여 시각화되었다.

RNA 분리 및 real-time PCR에서 전체 RNA는 Ambion Trizol reagent(Life Technologies)를 사용하여 분리되었고 전체 RNA의 1μg은 high-capacity cDNA reverse transcription kit(Applied Biosystems)를 사용하여 제조자의 안내에 따라 cDNA를 합성하는데 사용되었다. real-time PCR을 위하여, cDNA와 프라이머들은 제조자의 안내에 따라 Power SYBR Green PCR master mix (Applied Biosystems)으로 제조되었다.

Prism 5.0 소프트웨어가 모든 통계분석에 사용되었다. GTT 및 ITT에서의 다른 시간 포인트의 효과를 평가하기 위하여 ANOVA분석이 사용되었으며, 트리글리세라이드 농도, LC3-GFP puncta, Sirt1 넉다운(knockdown) 실험의 qauntitative PCR(Q-PCR)로부터 데이터들이 사용되었다. 다른 데이터분석을 위하여는 Student't test가 사용되었으며 P<0.05가 통계적 유의성을 보이는 것으로 평가되었다.

그러나 부탄올 분획물 처리된 마우스들은 간, 근육 및 견갑골부 갈색지방조직(interscapular brown adipose tissue, iBAT)에서 현저한 AMPK활성화를 보여주었다(도8 A-C). 흥미롭게도 부탄올 분획물처리된 마우스는 간, iBAT 및 근육(근육에서는 Sirt1과 PGC1α만이 보여주었다)에서 Sirt1, PGC1α 및 PPARγ는 대조군과 비교하였을 때 현저하게 증가하였다(도8B, 도9A, B, C 및 D). 이들 결과들은 세포배양시스템에서의 결과들과 상응한 것이었으며, 유전자 발현에서의 차이들은 부탄올 분획물처리된 마우스들에서 보여준 대사변화(metabolic changes)들을 야기시켰을 수 있다. 추가로 부탄올 분획물 처리된 마우스들의 간 분석은 미토콘드리아 생합성, 항산화기능, 당섭취 및 지방산 산화와 관련된 유전자 발현에 현저한 증가 및 콜레스테롤 생합성, 간에서 당생성에 관련된 유전자들의 발현에서 감소를 보여주었다(도10A 및 B).

< 실시예 7>

딱지꽃 부탄올 분획물에 의한 음식유도된 비만 마우스에서의 효과

몇 개의 연구들은 AMPK를 활성화시키는 생화학적 식물 화합물질(phytochemicals)가 체중 및 인슐린 민감도에 유익한 효과를 가진다는 것을 제안하였다. 부탄올 분획물처리된 마우스들에 있어서, 대사조절(metabolic regulation)에 밀접하게 관련된 몇 개의 유전자들에서 관찰된 변화들은 부탄올 분획물이 몸 전체의 물질대사에 대한 유익한 효과가 있다는 것을 보여주는 것이다. 그러므로 우리는 다음 음식유도 비만모델을 사용하여 부탄올 분획물의 대사효과(metabolic effects)를 조사하였다. 먼저, 우리는 일주일동안 통상의 음식을 마우스에게 공급하였고 그 다음 고지방음식(high fat diet, HFD)으로 바꾸었다. 통상의 음식을 공급한 첫주에 우리는 부탄올 분획물처리된 마우스에서 체중의 변화없이 음식물 혈당수치에서 유의적인 감소를 관찰하였다(도 11A, B). 흥미롭게도 당 대사에 대한 부탄올 분획물의 효과는 4주 동안 HFD를 공급한 마우스에서 더욱 확연하였다(도 11B). 추가로 HFD의 4주 후 단식한 당수치는 부탄올 분획물처리된 마우스들에서 유의적으로 더 낮았다(도 11C). 당 항상성(glucose homeostasis)와 인슐린작용에 대한 부탄올 분획물의 효과를 조사하기 위하여, 우리는 체중이 두 개의 그룹사이에서 비교되었을 때 HFD의 4주 후 GTTs와 ITTs를 시행하였다. GTT는 기술된 바에 따라 수행되었고 간단히 마우스들은 18시간동안 절식하고 물과 리비텀(libitum)을 제공하였다. 절식된 당 레벨을 측정한 후 당(체중 1.2g/kg)을 IP 경로로 주입하였다. 혈액샘플은 꼬리 상처부분에서 주입 후 15, 30, 60, 90, 120 및 150분 후에 수집되었다.

ITT 실험에서는 마우스들은 2시간 절식 후 물과 리비텀(libitum)을 공급하였다. 기저당수치(basal glucose level)를 측정한 후, 통상 인슐린(regular insulin)을 체중에 대하여 0.9U/kg로 IP투여되었다. 혈당수치는 주입 후 주어진 시간에 따라 모니터링되었다. 혈당수치는 판매되고 있는 glucometer(Ascen Contour; Bayer HealthCare)를 사용하며 glucose oxidase method에 의하여 측정되었다.

화이트지방조직(White adipose tissues, WATs)는 4% 중성 버퍼포르말린에서 고정되었고 그 이후 파라핀으로 매립되었다. 파라핀으로 매립된 부위는 4μm 슬라이스들로 절제되었으며 헤마톡실린(hematoxylin) 및 에오신(eosin)으로 염색되었다. 염색된 슬라이스들은 Nikon Digital Camera DXM1200 마이크로스코프 시스템(Nikon Corp)에 의하여 이미지화되었다.부탄올 분획물처리된 마우스들은 대조군인 새끼들(littermates)과 비교하였을 때 향상된 당내성(glucose tolerance)와 인슐린 작용(insluin action)을 보여주었다(도 11 D, E). HFD의 7주까지 대조군 새끼들의 체중과 부탄올 분획물 처리된 마우스들의 체중을 비교하였다. 놀랍게도 체중은 이후 분산되었으며(diverged), 부탄올 분획물처리된 마우스들에서 선형으로 되었다(도 11A). 이 선형의 표현형(phenotype)은 부탄올 분획물처리된 마우스들에서 WAT의 더 작은 지방세포 크기와 관련되었다(도 12A). 대조군과 부탄올 분획물 처리된 그룹들간의 비슷한 음식물 소비가 있었다는 것은 에너지 소비에서의 차이가 부탄올 분획물처리된 마우스들에서 관찰된 선형 표현형의 주요한 원인이 아니라는 것을 시사하는 것이다(도 12B). 이들 결과들은 부탄올 분획물처리가 음식물의 섭취없이 체중, 당 항상성, 인슐린 민감도에 유익한 효과를 유도한다는 것을 시사한다. 흥미롭게도 iBAT에서 열생성(thermogenesis)의 주요 조절인자인 UCP1는 대조군과 비교하였을 때 부탄올 분획물처리된 마우스들에서 유의적으로 증가하였다(도 12 C). iBAT 샘플을 사용한 Q-PCR은 부탄올 분획물처리된 마우스들에서 에너지 소비와 관련된 유전자들의 발현에서 유의적 증가를 보여주었다(도 12D). 종합하면 이들 결과들은 향상된 당과 인슐린의 민감도(sensitivity) 및 저항성(resistance)과 같은 부탄올 분획물로 인한 유익한 대사작용이 음식섭취로부터 초래된다라기 보다는 증가된 인슐린 민감도 및 에너지 소비로부터 초래된다는 것을 시사하는 것이다.

상기 실시예들의 결과들은 딱지꽃 추출물이 AMPK/Sirt1/PGC1α pathway에 중요한 역할을 하는 것을 보여주는 것이다. 딱지꽃 추출물로 처리한 비만쥐는 글루코오스와 인슐린 항상성(homeostasis)을 향상시켰다. 추가로 딱지꽃 추출물의 투여는 음식섭취의 변화없이도 음식으로 유도되는 체중증가를 보호하였다. 생화학적 분석에서 딱지꽃 추출물처리한 쥐에서의 간, 근육, 견갑골 갈색지방조직(interscapular brown adipose)에서의 현저한 AMPK 활성화를 보여주었다. 더구나 에너지 소비와 관련된 다른 유전자들과 함께 uncoupling protein 1은 견갑골 갈색지방조직에서 현저히 증가하였다. 이러한 결과는 딱지꽃 추출물이 AMPK/Sirt1/PGC1α pathway를 활성화함으로써 열발생에 중요한 견갑골 갈색지방조직 유전자들을 변화시킴으로써 유익한 대사작용에 역할을 하는 것을 시사하는 것이다. 우리의 연구는 딱지꽃 추출물 또는 그들의 유도체에 의한 AMPK/Sirt1/PGC1α pathway를 활성화를 타겟팅하는 것은 대사질환에서 인슐린 저항성을 위한 치료적 치료의 가능성을 보여주는 것이다.

딱지꽃 추출물 처리된 HFD-유도된 비만 마우스들은 iBAT에서 열생성된 관련된 유전자들의 증가된 발현과 함께 향상된 체중 항상성(body weight homeostasis)을 보여주었다. 추가로, 딱지꽃 추출물은 인슐린 민감도를 증가시킴으로써 음식공급을 줄이거나 단식한 동물들의 당수치는 낮추게 함으로써 음식유도 마우스들에서 당과 인슐린 민감도에 대한 긍정적 효과를 보여주었다. AMPK/Sirt1/PGC1α pathway는 딱지꽃 추출물의 유익한 대사효과에 매우 중요한 역할을 하는 것 같다. Sirt1의 녹다운은 미토콘드리아 기능에 관련된 유전자들의 발현을 현저히 약화시켰고 PGC1α의 디아세틸레이트 형태를 감소시켰다. 더구나 이 pathway는 만성 딱지꽃 추출물 처리된 마우스들의 기관들에서 강하게 활성화되었다. 이들 결과들은 딱지꽃 추출물이 AMPK/Sirt1/PGC1α pathway의 활성화 및 autophagy와 미토콘드리아 기능의 활성화를 통하여 유익한 대사작용을 발휘한다는 것을 시사하는 것이다.

<제조예 1>

산제의 제조

[실시예 1]의 딱지꽃 추출물 0.1 g

유당 1.5 g

탈크 0.5 g

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<제조예 2>

정제의 제조

[실시예 1]의 딱지꽃 분획물 0.1 g

락토오스 7.9 g

결정성 셀룰로오스 1.5 g

마그네슘 스테아레이트 0.5 g

상기의 성분들을 혼합한 후 직타법(direct tableting method)으로 정제를 제조하였다.

<제조예 3>

캡슐제의 제조

[실시예 1]의 화학식 1의 화합물 0.1 g

옥수수전분 5 g

카르복시 셀룰로오스 4.9 g

상기의 성분들을 혼합하여 분말을 제조한 후, 상기 분말을 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라 경질 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고, 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합하였다. 그 다음 정제수를 가하여 전체 100 ㎖로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조하였다.

<제조예 4>

건강식품의 제조

화학식 1의 화합물 100 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 0.13 ㎎

비타민 B2 0.15 ㎎

비타민 B6 0.5 ㎎

비타민 B12 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎎

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

<제조예 5>

건강 음료의 제조

[실시예 1]의 딱지꽃 추출물 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강 음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간 동안 85에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 건강 음료 조성물 제조에 사용하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (13)

1. 딱지꽃 추출물(Ptentilla Chinensis )을 유효성분으로 하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 추출물은 물, C1 내지 C4의 알코올 또는 이들의 혼합물인 용매로 추출되는 것을 특징으로 하는 조성물.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 알코올은 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 조성물.
4. 딱지꽃 추출물을 유기용매를 이용하여 분획한 분획물을 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물.
5. 제 4항에 있어서,
   상기 유기용매는 헥산, 클로로포름 및 부탄올로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
6. 제 4항에 있어서,
   상기 분획물은 딱지꽃 추출물을 헥산, 클로로포름, 부탄올 및 물 순으로 계통분획하여 얻은 헥산 분획물, 클로로포름 분획물, 부탄올 분획물 또는 물 분획물인 것을 특징으로 하는 조성물.
7. 하기 화학식의 폴리페놀계 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 치료용 약학적 조성물:
   

   

   .
8. 제 7항에 있어서,
   상기 화학식 1의 화합물은 딱지꽃 추출물로부터 분리한 것을 특징으로 하는 조성물.
9. 제 7항에 있어서,
   상기 대사성 질환은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간(fatty liver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
10. 제 7항에 있어서,
    상기 조성물은 AMP-활성 단백질키나제(AMPK) 효소의 활성을 증가시키기는 것임을 특징으로 하는 조성물.
11. 딱지꽃 추출물 또는 이로부터 분리된 폴리페놀계 화합물을 유효성분으로 함유하는 대사성 질환 예방 및 개선용 건강식품용 조성물.
12. 제11항에 있어서,
    상기 대사성 질환은 비만, 제2형 당뇨, 이상지질혈증, 인슐린저항성, 간지방증(hepatic steatosis) 및 비알콜성 지방간(fatty liver)으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
13. 제 11항에 있어서,
    상기 조성물은 AMP-활성 단백질키나제(AMPK) 효소의 활성을 증가시키기는 것임을 특징으로 하는 조성물.

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