KR101995220B1 - 벼메뚜기 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부주름의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 - Google Patents
벼메뚜기 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부주름의 예방, 개선 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 화학식 2의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 화학식 3의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 또는 화학식 1~3의 화합물 중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 벼메뚜기(Oxya chinensis sinuosa) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 자외선 조사에 의한 세포 손상을 억제하며, MMP-1의 발현을 현저하게 억제하므로 피부주름의 예방, 개선 또는 치료용 건강기능식품 또는 의약품으로 활용할 수 있다.
Description
본 발명은 벼메뚜기(Oxya chinensis sinuosa) 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부주름의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.
피부는 외부환경의 자극으로부터 체내의 기관들을 보호해주며, 체온조절 등의 생체 항상성 유지에 중요한 역할을 한다. 이러한 피부는 여러 가지 내외적 요인에 의해서 노화가 발생되며, 크게 유전적 원인에 의한 내인성 노화와 환경적 원인에 의한 외인성 노화로 구분된다. 이 중, 광노화는 자외선(ultraviolet; UV)에 의한 노화를 의미한다. 최근 환경오염으로 인한 오존층 파괴는 자외선의 양을 증가시켰고 이에 따라 광노화에 대한 연구가 주목되고 있다. 광노화 된 피부에서는 거칠어짐, 탄력 손실, 주름 발생 및 불규칙한 색소 침착 등과 같은 외관상의 특징이 관찰되며, 이 중 광노화의 주된 연구 분야는 피부 주름의 변화에 대한 것이다. 상기 광노화에 의한 피부 주름 형성에 관해 피부의 주요 구성성분인 콜라겐(collagen)의 합성, 분해 및 수분 함유량 등의 기초적인 생리 대사 변화에 대한 연구 결과가 다수 보고되고있다. 특히 자외선에 의해 활성 산소종(reactive oxygen species) 생성이 증가되고 피부의 효소적, 비효소적 항산화 방어체계가 붕괴되어 콜라겐의 분해 증가 및 생합성을 감소시켜 진피층 내의 콜라겐이 현저하게 감소된다. 상기 콜라겐 감소에 중요한 영향을 미치는 것은 콜라겐 분해 효소(MMPs; matrix metalloproteinases)로, 이는 세포외기질(extracellular matrix)과 기저막(basement membrane)의 분해에 관여한다. 상기 효소는 자외선에 의해 활성이 증가되며 이를 억제함으로써 자외선에 의해 유도되는 피부 두께 증가 및 주름 형성이 감소된다는 연구 결과들이 보고되어 있다. 따라서 광노화의 예방 및 치료를 위해서는 MMPs를 조절하는 것이 효과적인 방법으로 알려져 있다.
한편, 벼메뚜기는 몸길이 30~38cm으로, 몸빛깔은 황록색이나 머리와 가슴은 황갈색이다. 겹눈은 달걀 모양이고 광택이 있는 회갈색이다. 앞가슴등판에 가느다란 3개의 가로홈이 있고 양쪽에 갈색의 세로줄이 있다. 날개는 황갈색이고 배끝보다 길지만 별로 날아다니지 않는다. 논이나 경작지 근처의 풀밭에 서식한다. 연 1회 발생하며, 땅 속에서 알무더기로 월동한다. 알무더기는 아교질의 엷은 막으로 싸여 있다. 다 자란 약충은 날개딱지가 제4배마디에 이르며 몸길이는 약 30mm이다. 벼의 주요 해충으로 농약을 사용하면서 그 수가 줄어들었으나 차차 늘어나고 있다. 1930년 황해도에서 발생해 알덩어리를 정부에서 사들인 일도 있다. 한국·일본·중국 등지에 분포한다.
한국등록특허 제1648812호에 벼메뚜기 성분을 포함하는 다이어트 식품 조성물 제조 방법에 관하여 개시되어 있고, 한국공개특허 제2010-0002661호에 히알루론산을 포함하는 기능성 복합체 및 그 제조방법에 관하여 개시되어 있으나, 본 발명의 벼메뚜기 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 함유하는 피부주름의 예방, 개선 또는 치료 관련 기술은 개시된 바 없다.
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 화학식 2의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 화학식 3의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 또는 화학식 1~3의 화합물 중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 벼메뚜기(Oxya chinensis sinuosa) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 화학식 1~3의 화합물 및 벼메뚜기 추출물이 세포 독성이 없으며, UV 조사에 의해 증가된 MMP-1의 발현량을 현저하게 감소시킨다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 화학식 2의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 화학식 3의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 또는 화학식 1~3의 화합물 중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 벼메뚜기(Oxya chinensis sinuosa) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 화학식 2의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 화학식 3의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 또는 화학식 1~3의 화합물 중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 벼메뚜기(Oxya chinensis sinuosa) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 화학식 2의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 화학식 3의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 또는 화학식 1~3의 화합물 중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 벼메뚜기(Oxya chinensis sinuosa) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것으로, 상기 유효성분은 세포독성이 없고, MMP-1의 발현을 억제하는 효과가 현저하므로, 피부주름의 예방, 개선 또는 치료용 건강기능성식품 또는 의약품에 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 벼메뚜기 추출물을 농도별로 처리한 후 세포 생존률(%)을 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 벼메뚜기 추출물 유래의 화합물(화합물 A(화학식 1), 화합물 B(화학식 2) 및 화합물 C(화학식 3))을 농도별로 처리한 후 세포 생존률(%)을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 벼메뚜기 추출물을 농도별로 처리한 후 MMP-1의 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 벼메뚜기 추출물 유래의 화합물(화합물 A(화학식 1), 화합물 B(화학식 2) 및 화합물 C(화학식 3))을 농도별로 처리한 후 MMP-1의 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 UV 조사에 의해 증가한 표피 두께가 본 발명의 벼메뚜기 추출물을 투여하여 감소한 것을 확인한 결과이다. ####은 정상군에 비해 자외선 조사군의 표피 두께가 증가하였다는 것이고, p<0.0001이다. ****는 자외선 조사군에 비해 본 발명의 벼메뚜기 추출물을 처리한 군의 표피 두께가 감소하였다는 것으로 p<0.0001이다.
도 6은 UV 조사에 의해 증가한 표피 두께와 감소한 콜라겐의 함량을 확인한 후, 본 발명의 벼메뚜기 추출물을 투여하여 표피 두께의 감소 및 콜라겐 함량의 증가를 확인한 결과이다. A는 H&E 염색 결과이고, B는 Masson's trichome 염색 결과이다.
도 7은 본 발명의 벼메뚜기 추출물의 투여에 따른 피부의 주름에 관여하는 MMP-1과 MMP-9의 발현량의 변화를 분석한 결과이다. ###, ####은 정상군에 비해 자외선 조사군의 MMP-1과 MMP-9의 발현량이 유의미하게 증가하였다는 것이고, ###은 p<0.001이고, ####은 p<0.0001이다. **, ***는 자외선 조사군에 비해 본 발명의 벼메뚜기 추출물을 처리한 군의 MMP-1과 MMP-9의 발현량이 유의하게 감소하였다는 것으로 **는 p<0.01이고, ***는p<0.001이다.
도 2는 본 발명의 벼메뚜기 추출물 유래의 화합물(화합물 A(화학식 1), 화합물 B(화학식 2) 및 화합물 C(화학식 3))을 농도별로 처리한 후 세포 생존률(%)을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명의 벼메뚜기 추출물을 농도별로 처리한 후 MMP-1의 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명의 벼메뚜기 추출물 유래의 화합물(화합물 A(화학식 1), 화합물 B(화학식 2) 및 화합물 C(화학식 3))을 농도별로 처리한 후 MMP-1의 발현량 변화를 확인한 결과이다.
도 5는 UV 조사에 의해 증가한 표피 두께가 본 발명의 벼메뚜기 추출물을 투여하여 감소한 것을 확인한 결과이다. ####은 정상군에 비해 자외선 조사군의 표피 두께가 증가하였다는 것이고, p<0.0001이다. ****는 자외선 조사군에 비해 본 발명의 벼메뚜기 추출물을 처리한 군의 표피 두께가 감소하였다는 것으로 p<0.0001이다.
도 6은 UV 조사에 의해 증가한 표피 두께와 감소한 콜라겐의 함량을 확인한 후, 본 발명의 벼메뚜기 추출물을 투여하여 표피 두께의 감소 및 콜라겐 함량의 증가를 확인한 결과이다. A는 H&E 염색 결과이고, B는 Masson's trichome 염색 결과이다.
도 7은 본 발명의 벼메뚜기 추출물의 투여에 따른 피부의 주름에 관여하는 MMP-1과 MMP-9의 발현량의 변화를 분석한 결과이다. ###, ####은 정상군에 비해 자외선 조사군의 MMP-1과 MMP-9의 발현량이 유의미하게 증가하였다는 것이고, ###은 p<0.001이고, ####은 p<0.0001이다. **, ***는 자외선 조사군에 비해 본 발명의 벼메뚜기 추출물을 처리한 군의 MMP-1과 MMP-9의 발현량이 유의하게 감소하였다는 것으로 **는 p<0.01이고, ***는p<0.001이다.
본 발명은 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 하기 화학식 2의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 하기 화학식 3의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 또는 하기 화학식 1~3의 화합물 중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 벼메뚜기(Oxya chinensis sinuosa) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.
상기 화학식 1~3의 화합물은 벼메뚜기로부터 추출한 것이 바람직하지만 이에 제한하는 것은 아니며, 다른 천연물로부터 추출하거나 합성하는 것이 얼마든지 가능하다.
상기 벼메뚜기 추출물은 하기의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조되는 것일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다:
(1) 벼메뚜기에 추출용매를 가하여 추출하는 단계;
(2) 단계 (1)의 추출물을 여과하는 단계; 및
(3) 단계 (2)의 여과한 추출물을 감압 농축하고 건조하여 추출물을 제조하는 단계.
상기 단계 (1)에서 추출용매는 물, C1~C4의 저급 알코올 또는 이들의 혼합물 중에서 선택하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 에탄올이고, 더욱더 바람직하게는 70%(v/v) 에탄올이지만 이에 한정하지 않는다.
상기 제조방법에 있어서, 추출방법은 여과법, 열수 추출, 침지 추출, 환류 냉각 추출 및 초음파 추출 등의 당 업계에 공지된 모든 통상적인 방법을 이용할 수 있다. 상기 추출용매는 건조된 벼메뚜기 중량의 1~20배 첨가하여 추출하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 5~15배 첨가하는 것이다. 추출온도는 4 내지 50℃인 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 0.5~10시간인 것이 바람직하며, 0.5~5시간이 더욱 바람직하고, 1 시간이 가장 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 상기 방법에 있어서, 단계 (3)의 감압농축은 진공 감압 농축기 또는 진공회전증발기를 이용하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무 건조 또는 동결 건조하는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 건강기능식품 조성물은 MMP-1 또는 MMP-9의 발현을 저해하는 것이 특징이다.
상기 건강기능식품 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조될 수 있으나, 이에 한정하는 것은 아니다.
본 발명의 건강기능식품 조성물은 벼메뚜기 추출물 또는 벼메뚜기 추출물 유래의 화학식 1~3의 화합물 중에서 선택된 하나 이상을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 혼합하여 제조될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 제조될 수 있다. 상기 벼메뚜기 추출물 유래의 화학식 1~3의 화합물 중에서 선택된 하나 이상을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 카라멜, 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 수프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 중에서 선택된 어느 하나의 형태일 수 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다. 즉, 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 및 천연 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알킨산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 또한, 천연 과일 주스 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 상기의 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있으며, 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 단당류, 말토스, 슈크로스와 같은 이당류, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 다당류, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 크게 중요하지 않지만, 본 발명의 조성물 100g에 대하여, 0.01~0.04g 인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 0.02 내지 0.03g을 포함하는 것이지만 이에 한정하지 않는다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 화학식 1의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 화학식 2의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 화학식 3의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 또는 화학식 1~3의 화합물 중에서 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 벼메뚜기(Oxya chinensis sinuosa) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
본 발명의 약학 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물에 포함되는 약학적으로 허용되는 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 성분들 이외에 항산화제, 완충액, 정균제, 희석제, 계면활성제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제 또는 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 주사 또는 피부에 도포하는 방법으로 투여할 수 있는 것이다. 본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.
이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.
[재료 및 방법]
1. 벼메뚜기 추출물의 제조
벼메뚜기(4.87kg)를 1%(v/v) 아세트산이 포함된 에탄올로 추출한 후, 감압증류하여 갈색을 띠는 벼메뚜기 에탄올 추출물 421.8g을 획득하였다.
2. 화학식 1~3의 화합물의 분리 및 구조 결정
에탄올 추출물(421.8g)을 VLC(vacuum liquid chromatography)를 이용하여 헥산/에틸아세테이트 100:0(6ℓ), 80:20(6ℓ), 60:40(6ℓ), 40:60(6ℓ) 및 20:80(6ℓ)(v:v); 클로로포름/메탄올 100:0(6ℓ), 80:20(6ℓ), 60:40(6ℓ), 40:60(6ℓ) 및 20:80(6ℓ)(v:v)의 농도구배 용리 조건 및 메탄올 세척조건을 통해 6개의 소분획물을 얻었다(A~F).
D 분획물(35.7g)을 VLC(vacuum liquid chromatography)를 이용하여 헥산/에틸아세테이트 100:0(6ℓ), 85:15(6ℓ), 75:25(6ℓ) 및 50:50(6ℓ)(v:v); 클로로포름/메탄올 85:15(6ℓ), 80:20(6ℓ), 67:33(6ℓ) 및 50:50(6ℓ)(v:v)의 농도구배 용리 조건 및 메탄올 세척조건을 통해 7개의 소분획물을 얻었다(D-1~D-7).
D-5 분획물(18.3g)을 MPLC(medium pressure liquid chromatography)를 이용하여 아세토나이트릴/물(10:90~60:40, 8160㎖)의 농도구배 용리 조건 및 아세토나이트릴 세척 조건을 통해 6개의 소분획물을 얻었다(D-5-1~D-5-6).
D-5-2 분획물(1.9g)에 대하여 prep HPLC(Phenomenex Kinetex C18 250×21mm, 5μm, Kinetex Biphenyl 250×21mm, 5μm)를 진행하여 화합물 A(t R 52분: 331.2mg), 화합물 B(t R, 47분: 389.2mg), 화합물 C(t R 64분: 37.2mg)를 획득하였다.
3. 세포배양
세포 생존율 및 MMP-1의 발현량 분석은 HaCaT 세포를 이용하였으며, HaCaT 세포는 Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM, Gibco)에 10% 소태아 혈청(Fetal bovine serum;FBS, Gibco)과 1% 페니실린-스트렙토마이신(penicillin-streptomycin;PS, Gibco)이 함유된 배지에서 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
4. 실험동물 및 시료투여
무모생쥐는 6주령의 수컷 무모쥐(male HR-1, hairless mice, Japan SLC, Inc.)를 중앙실험동물로부터 구입하여 1주 동안 적응시킨 후 사용하였다. 적응기간 중 일반 상태를 관찰하여 건강한 상태의 동물을 시험에 사용하였다. 사육환경은 온도 23±3℃, 습도 50±5%, 명암주기 12시간 (07:00-19:00/조명시간)으로 유지하였다. 시험기간 중 실험동물은 polycarbonate 케이지 (200×320×145 mm, Three-shine Co., Daejeon, Korea)에 군당 6마리로 사육하였고 사료는 마우스 전용사료 5L79 (Charles river, USA)를 자유급이 하였으며, 음수는 자외선으로 소독한 상수도수를 자유 급이하였다.
시료투여는 대조군(control), 자외선 처리군(UV-vehicle), 벼메뚜기 추출물(BMG) 투여군으로 총 3개 군으로 나누어 실험을 하였다. 시료투여는 마우스 존대를 이용하여 경구투여를 실시하였다. 투여기간은 총 12주로 주 5일 동안 투여하였다.
5. 자외선조사
자외선조사는 대조군을 제외한 실험군에 12주 동안 주 3회 실시하였고, 자외선은 UVB 램프 (Mineralight UV Display lamp, UVP, USA)를 사용하였다. 자외선 조사량은 1-4주간은 60 mJ/cm2, 5-8주는 90 mJ/cm2, 9-12주는 120 mJ/cm2로 12주 동안 조사하였다. 자외선 조사량은 광측정기(Delta OHM, Italy)를 이용하여 광량을 측정한 후 조사시간으로 조절하였다.
6. 피부의 조직학적 분석
주름억제 효능을 확인하기 위하여, 각 실험군의 피부조직을 적출하여 10% 중성 포르말린 용액에 고정한 후 수세, 탈수, 투명, 침투 과정을 거친 다음 파라핀으로 포매하고 4μM 두께로 절편을 만든 후 Hematoxylin & Eosin (H&E) 염색 및 Masson's trichome 염색을 실시하였다. H&E 염색을 실시한 조직의 케라틴층에서 표피세포 기저막(epidermal basement membrane)까지의 두께를 현미경에 장착된 자를 이용하여 측정하였다.
실시예
1.
세포생존률
분석
상기 배양한 HaCaT 세포에 24시간 동안 각각의 시료를 농도별로 희석하여 처리하고, MTS 어세이(CellTiter Aqueous One Solution Cell proliferation assay kit, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophynyl)-2H-tetrazolium, inner salt; MTS, Promega Co. Madison, WI, USA) 기법으로 세포 생존률을 490nm에서 마이크로플레이트 리더(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)로 측정하였다.
그 결과, 아무것도 처리하지 않은 Control군 대비 UVB 조사군에서의 세포생존률이 낮아졌으며, UVB 조사 후, 본 발명의 시료(벼메뚜기 추출물 및 화학식 1~3의 화합물)를 처리하였을 때의 상대적 세포생존률(%)이 다소 증가하였거나 유지했다는 것을 도 1 및 2에 나타내었다. 따라서, 본 발명의 벼메뚜기 추출물 및 화학식 1~3의 화합물은 세포 독성이 거의 없다는 것을 알 수 있었다.
실시예
2.
MMP
-1의 발현량 분석
HaCaT 세포에 24시간 동안 각각의 시료를 처리하고 자외선(UV Crosslinker, Ultra Lum)을 20mJ/cm2로 조사한 후, MMP-1 ELISA kit(R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA)를 이용하여 MMP-1의 발현량을 측정하였다.
상세하게는 96웰 플레이트에 HaCaT 세포를 도말한 후, 본 발명의 벼메뚜기 추출물 및 화학식 1~3의 화합물을 각각 농도별로 처리하였다. 이후, 자외선(UV) 조사하고, 배양물의 상등액을 수집하고 13,000rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 이후 상등액을 취해 ELISA 키트를 이용한 형광 어세이를 수행하여 MMP-1의 발현량을 정량분석하였다.
그 결과, 도 3 및 4에 개시한 바와 같이 자외선을 조사하지 않은 음성대조군에 비해, 자외선을 조사한 군에서 현저하게 MMP-1의 발현량이 증가한다는 것을 확인하였고, 본 발명의 시료(벼메뚜기 추출물 및 화학식 1~3의 화합물)의 MMP-1의 발현량이 자외선 조사군에 비해 현저하게 감소한다는 것을 확인하였다.
실시예
3. 동물 모델의 표피두께 변화에 의한 효능평가
주름억제 효능을 표피두께 변화측정을 통해서도 확인하였다. 표피두께는 H&E염색을 실시한 조직의 케라틴층에서 표피세포 기저막까지의 두께를 현미경에 장착된 자를 이용하여 두께를 측정하였다.
그 결과 도 5에 개시한 바와 같이, 자외선 조사 시 표피두께가 증가되었다는 것을 확인할 수 있었고, 벼메뚜기 추출물(BMG) 투여군에 의해서 표피두께가 감소하였다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예
4. 동물모델의 조직염색에 의한 효능평가 (H&E 염색)
자외선으로 유발된 주름억제 효능을 확인하기 위해 무모생쥐의 피부조직을 떼어낸 후 조직염색을 통해서도 확인하였다.
그 결과 도 6(A)에 개시한 바와 같이, 자외선 조사군은 대조군에 비해서 각질층이 일어났으며, 표피두께 또한 증가된 것을 확인할 수 있었으나, 벼메뚜기 추출물(BMG) 투여군은 자외선 조사군에 비해서 각질층이 완화되었고, 표피두께 또한 감소함을 확인할 수 있었다.
실시예
5. 조직염색에 의한 효능평가 (
Masson's
trichome
염색)
자외선으로 유발된 주름억제 효능을 확인하기 위해 무모생쥐의 피부조직을 떼어낸 후 콜라겐 조직염색을 통해서도 확인하였다.
그 결과 도 6(B)에 개시한 바와 같이, 자외선에 의해서 콜라겐이 감소하였고 본 발명의 벼메뚜기 추출물 처리군에서는 콜라겐의 양이 회복되었다는 것을 확인하였다.
실시예
6.
MMP
-1 및
MMP
-9의 발현량 분석
콜라겐 분해 효소(MMP; matrix metalloproteinases)는 세포외 기질과 기저막의 분해에 관여함으로써, 콜라겐 감소에 영향을 미치는 효소이다. 피부의 주름에 관여하는 MMP-1과 MMP-9의 발현량의 변화를 분석하여 시료가 주름개선 효과가 있는지 여부를 확인하였다.
그 결과 도 7에 개시한 바와 같이, 자외선 조사에 의해 MMP-1과 MMP-9의 발현량 모두 자외선을 조사하지 않은 세포에 비해 증가하였으며 본 발명의 벼메뚜기 추출물을 처리한 경우 발현량이 감소하는 것을 확인하였다.
Claims (8)
- 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 하기 화학식 2의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 또는 하기 화학식 3의 화합물 또는 이의 허용가능한 염;을 유효성분으로 함유하는 피부주름의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
- 벼메뚜기(Oxya chinensis sinuosa) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 벼메뚜기 추출물은 물, C1~C4의 저급 알코올 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 하나 이상의 용매를 이용하여 추출한 것을 특징으로 하는 피부주름의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 MMP-1 또는 MMP-9의 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는 피부주름의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물은 분말, 과립, 환, 정제, 캡슐, 캔디, 시럽 및 음료 중에서 선택된 어느 하나의 제형으로 제조되는 것을 특징으로 하는 피부주름의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물.
- 하기 화학식 1의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 하기 화학식 2의 화합물 또는 이의 허용가능한 염; 또는 하기 화학식 3의 화합물 또는 이의 허용가능한 염;을 유효성분으로 함유하는 피부주름의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
[화학식 1]
[화학식 2]
[화학식 3]
- 벼메뚜기(Oxya chinensis sinuosa) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부주름의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
- 제6항 또는 제7항에 있어서, 상기 유효성분 이외에 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 피부주름의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
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-
2018
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|---|
| Bioorganic & Medicinal Chemistry, Vol.14, pp.7826-7834, 2006* |
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