CN112716986A - 白桦茸在制备抗心室重构的药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了白桦茸或白桦茸提取物在制备抗心室重构的药物中的应用。本发明采用两种与临床相关的心室重构疾病模型：异丙肾上腺素(ISO)皮下注射诱导小鼠心室重构和主动脉弓缩窄术(TAC)诱导小鼠心室重构。实验证明，将白桦茸口服灌胃，能明显抑制ISO皮下注射和TAC手术诱导的小鼠心室重构的发生发展，明确白桦茸三萜中的有效活性单体成份包括羊毛甾醇、桦褐孔菌醇、3β‑羟基羊毛甾‑8、24‑二烯‑21‑醛及3β‑羟基羊毛甾‑8、24‑二烯‑21‑酸，可能用于患者心室重构的防治。

Description

白桦茸在制备抗心室重构的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及白桦茸在制备抗心室重构的药物中的应用。

背景技术

我国是高血压与冠心病高发的国家。世界卫生组织数据库资料显示，中国人群高血压患病率呈逐年上升状态。高血压和冠心病等疾病造成的长期压力负荷是慢性心力衰竭最常见的诱发因素，且其发病率及病死率极高，五年存活率与恶性肿瘤相仿，是各种心血管疾病的终末阶段(Zhonghua Xin Xue Guan Bing Za Zhi.2015；43(12):1018–21)。心力衰竭病理基础是心室重构，包括心肌的肥大与心肌的纤维化。其中，心肌肥大除主要表现为心肌细胞体积增大，蛋白合成能力增加，还伴随心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞转化及其增值能力增强及心肌间质中胶原纤维异常沉积，胶原含量、胶原容积百分比改变即心脏纤维化(Go AS,Mozaffarian D,Roger VL,et al.Heart disease and strock statistic-2013update:a report from the American Heart Association[J].Circulation,2013,127(1):e6-e245)。心肌肥大与心脏纤维化是心衰前驱病变，阐明其病理进展，对防治心力衰竭有重要意义(Ogah O S,Oladapo O O,Adebiyi A A,et al.Electrocardiographic leftventricular hypertrophy with strain pattern:prevalence,mechanisms andprognostic implications[J].Cardiovasc J Afr.2008,19(1):39-45)。

目前临床上对于心力衰竭的治疗主要集中在改善患者临床症状。以贝塔受体阻滞剂(Mcmurray J J,Adamopoulos S,Anker S D,et al.ESC guidelines for thediagnosis and treatment of acute and chronic heart failure 2012:The TaskForce for the Diagnosis and Treatment of Acute and Chronic Heart Failure 2012of the European Society of Cardiology.Developed in collaboration with theHeart Failure Association(HFA)of the ESC[J].Eur J Heart Fail.2012,14(8):803-869)、利尿药、血管紧张素转化酶抑制剂、为代表的“金三角”疗法虽能显著改善心衰病人的临床症状，但存在诱发支气管哮喘、加重房室传导阻滞、引起刺激性干咳及电解质紊乱等毒副作用。并且此疗法主要针对中晚期心衰病人，且仅改善其临床症状，不缓解病程进展，更不能起预防心室重构及逆转已形成重构的心室，也不能延长中、重度心衰患者的寿命。因此，寻找新型、安全、有效的抗心肌肥大的药物对临床疾病的治疗有重要意义。

白桦茸，又称桦褐孔菌(Inonotus obliquus，IO)系多孔菌科药用真菌，主要分布于北纬45°～50°地区，在我国的黑龙江、吉林两省资源较丰富。民间广泛用于治疗一些恶性肿瘤。桦褐孔菌中的主要化学成分是羊毛甾烷型四环三萜类化合物，其中含量较高的成分有羊毛甾醇、桦褐孔菌醇、3β-羟基羊毛甾-8、24-二烯-21-醛、栓菌酸等。已有的研究表明白桦茸的药理作用包括：抗肿瘤、抗氧化、抗炎、降血糖、降血脂、免疫调节等。但目前尚无IO及其单体成分对心室重构作用的相关报道。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种白桦茸或白桦茸提取物的新用途。

本发明所提供的白桦茸或其提取物的新用途是其在下述至少一项中的应用：

(1)制备预防和/或治疗心室重构的产品；

(2)制备预防和/或治疗以心室重构为基础的疾病的产品；

(3)制备预防和/或治疗心肌肥大的产品；

(4)制备预防和/或治疗心肌纤维化的产品。

本发明中，所述的以心室重构为基础的疾病包括心力衰竭、心脏肥大、心脏纤维化等。

本发明中，所述的心室重构是心力衰竭的病理基础，包括心肌的肥大与心肌的纤维化。

所述预防和/或治疗心肌肥大具体体现在下述至少一方面：

a)抑制由于心肌肥大引起的机体心脏体重比和/或心脏胫骨比的升高；

b)抑制由于心肌肥大引起的机体心肌组织中心肌肥大相关胎儿基因表达水平(如mRNA表达水平)升高；

c)抑制心肌组织炎性因子表达水平(如mRNA表达水平)升高；

d)调控心肌组织中PGC-1α，AMPK，SOD2，PPAR-α的表达水平。

在本发明中，所述心肌肥大相关胎儿基因具体可为ANF基因、BNP基因、Myh6基因和Myh7基因。

在本发明中，所述炎症因子为白介素IL-6和/或F4/80。

所述预防和/或治疗心肌纤维化具体体现在下述至少一方面：

e)抑制由于心肌纤维化引起的心肌组织中心肌纤维化标志基因表达水平(如mRNA表达水平)升高；

f)抑制心肌组织纤维化通路中AP-1基因、TGF-β基因、Smad2/3基因表达水平(如mRNA表达水平)升高。

所述心肌纤维化标志基因具体为Col 1α基因或Col 3基因。

本发明中所述产品可为药物和/或保健品。

本发明中所述白桦茸提取物为白桦茸的乙醇提取物或白桦茸的乙醇水溶液提取物；所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为60％-100％(具体可为95％)。

本发明中所述的白桦茸可为白桦茸菌丝体或白桦茸子实体。

本发明中所述白桦茸的乙醇提取物或白桦茸的乙醇水溶液提取物均可按照现有公开的方法进行制备。

具体可参考下述方法进行制备：白桦茸菌丝体先使用粉碎机碎成粗粉，用10倍样品体积的乙醇或95％乙醇水(95：5，v/v)溶液进行加热回流提取，重复提取至少1-5次；合并回流提取液、减压浓缩、抽滤得到乙醇总取物。

本发明中所述白桦茸提取物中的活性成分为白桦茸三萜类化合物，包括下述四种成分：桦褐孔菌醇、羊毛甾醇、3β-羟基羊毛甾-8、24-二烯-21-醛和3β-羟基羊毛甾-8、24-二烯-21-酸。

进一步的，本发明还分别保护上述四种单体的应用。

本发明所述的四种单体的应用是桦褐孔菌醇、羊毛甾醇、3β-羟基羊毛甾-8、24-二烯-21-醛和3β-羟基羊毛甾-8、24-二烯-21-酸(栓菌酸)中的至少一种物质在下述至少一项中的应用：

(1)制备预防和/或治疗心室重构的产品；

(2)制备预防和/或治疗以心室重构为基础的疾病的产品；

(3)制备预防和/或治疗心肌肥大的产品；

(4)制备预防和/或治疗心肌纤维化的产品。

本发明中，所述的以心室重构为基础的疾病包括心力衰竭、心脏肥大、心脏纤维化等。

本发明中，所述的心室重构是心力衰竭的病理基础，包括心肌肥大与心肌纤维化。

所述预防和/或治疗心肌肥大具体体现在下述至少一方面：

a)抑制由于心肌肥大引起的机体心脏体重比和/或心脏胫骨比的升高；

b)抑制由于心肌肥大引起的机体心肌组织中心肌肥大相关胎儿基因表达水平(如mRNA表达水平)升高；

c)抑制心肌组织炎性因子表达水平(如mRNA表达水平)升高；

d)调控心肌组织中PGC-1α，AMPK，SOD2，PPAR-α的表达水平。

在本发明中，所述心肌肥大相关胎儿基因具体可为ANF基因、BNP基因、Myh6基因和Myh7基因。

在本发明中，所述炎症因子为白介素IL-6和/或F4/80。

所述预防和/或治疗心肌纤维化具体体现在下述至少一方面：

e)抑制由于心肌纤维化引起的心肌组织中心肌纤维化标志基因表达水平(如mRNA表达水平)升高；

f)抑制心肌组织纤维化通路中AP-1基因、TGF-β基因、Smad2/3基因表达水平(如mRNA表达水平)升高。

所述心肌纤维化标志基因具体为Col 1α基因或Col 3基因。

本发明中所述产品可为药物和/或保健品。

以白桦茸或白桦茸提取物或上述任一所述单体为活性成分制备的药物也属于本发明的保护范围。

所述药物可通过注射、口服、喷射、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

所述药物可以制成注射液、悬浮剂、粉剂、片剂、颗粒剂等多种形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

本发明采用两种与临床相关的腹主动脉瘤疾病模型：异丙肾上腺素(ISO)皮下注射诱导的小鼠心室重构和主动脉弓缩窄术(TAC)诱导的小鼠心室重构。实验证明，将白桦茸三萜提取物灌胃小鼠，能明显抑制ISO皮下注射和TAC手术诱导的小鼠心室重构的发生发展，明确其有效活性单体成份为羊毛甾醇、桦褐孔菌醇、3β-羟基羊毛甾-8、24-二烯-21-醛及3β-羟基羊毛甾-8、24-二烯-21-酸，可用于心室重构疾病的防治。

本发明提供的抗心室重构的药品安全低毒，药理作用较强；其原料来源丰富，也可由生物发酵方式制备获得，或者从含白桦茸的各种药材中提取得到，或者通过其他化学方法合成得到。本发明为预防、诊断、检测、保护、治疗和研究心室重构相关疾病提供了一种新的药物来源，且容易推广应用，能够在较短的时间内产生巨大的社会效益和经济效益。

附图说明

图1为白桦茸(IO)灌胃减少ISO诱导的小鼠心室重构结果；包括：白桦茸(IO)灌胃减少ISO诱导的小鼠心室重构的照片及白桦茸(IO)灌胃抑制ISO诱导的小鼠心体比和心胫比的结果。

图2白桦茸(IO)灌胃抑制ISO诱导的心室重构相关胎儿基因的结果。

图3白桦茸(IO)灌胃减少TAC诱导的小鼠心室重构的结果；包括：白桦茸(IO)灌胃减少TAC诱导的小鼠心室重构的照片及白桦茸(IO)灌胃抑制TAC诱导的小鼠心体比和心胫比及肥大相关胎儿基因BNP表达的结果。

图4白桦茸(IO)灌胃减少TAC诱导的小鼠心肌组织炎性细胞浸润的结果；包括：HE染色表明白桦茸(IO)灌胃减少TAC诱导的小鼠心肌组织炎性细胞浸润及抑制炎性因子IL-6和F4/80的表达。

图5白桦茸(IO)灌胃减少TAC诱导的小鼠心脏纤维化的结果；包括：天狼猩红染色表明白桦茸(IO)灌胃减少TAC诱导的小鼠心肌组织胶原沉积及抑制纤维化相关胎儿基因COL1α和COL3的表达。

图6白桦茸(IO)抑制AngII诱导H9C2细胞肥大的结果；包括：MTT检测IO最大有效安全剂量及IO抑制肥大相关胎儿基因表达的结果。

图7白桦茸(IO)抑制AngII诱导NIH-3T3细胞纤维化的结果；包括：MTT检测IO最大有效安全剂量及IO抑制纤维化相关胎儿基因表达的结果。

图8白桦茸单体成份抑制AngII诱导H9C2细胞肥大的结果；包括：MTT检测IO最大有效安全剂量及IO抑制肥大相关胎儿基因表达的结果。

图9白桦茸单体成份抑制AngII诱导NIH-3T3细胞纤维化的结果；包括：MTT检测IO最大有效安全剂量及IO抑制纤维化相关胎儿基因表达的结果。

图10白桦茸单体成份抑制AngII诱导H9C2细胞肥大及NIH-3T3细胞纤维化的结果。包括：MTT检测IO最大有效安全剂量及IO抑制肥大相关胎儿基因表达的结果。

图11白桦茸单体灌胃抑制TAC诱导的小鼠心体比和心胫比的结果。

图12白桦茸单体灌胃抑制TAC诱导的小鼠心肌组织肥大相关胎儿基因表达的结果。

图13白桦茸单体灌胃抑制TAC诱导的小鼠心肌组织纤维化相关胎儿基因表达的结果。

图14白桦茸及其单体灌胃抑制TAC诱导的小鼠心肌组织AP-1，TGF-β和Smad2/3表达的结果。

图15白桦茸单体灌胃调控TAC诱导的小鼠心肌组织PGC-1α，AMPK，SOD2和PPAR-α表达的结果。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，但本发明并不局限于此，凡在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。白桦茸药材购自药材市场。

下述实施例及附图中上涉及的中文名称及英文全称、英文缩写的如下表所示：

实施例1、白桦茸提取物的制备

将8kg所获得的白桦茸菌丝药材先使用粉碎机碎成粗粉，加入10倍样品质量体积的乙醇水溶液(乙醇：水＝95：5，v/v)加热回流提取，重复提取3次(提取的时间为2h)，纱布过滤合并3次的回流提取液。运用旋转蒸发仪浓缩提取液，共得到乙醇提取物(IO乙醇总取物)240g，将所有提取物密封保存在-20℃冰箱中备用。

实施例2、白桦茸提取物中单体的分离制备

将IO乙醇总取物(220g)加适量水混悬，依次应用等体积的氯仿进行萃取，萃取3次，得到氯仿层萃取物(45.5g)。氯仿层萃取物(40g)上硅胶柱层析(1500g)进行纯化，使用石油醚/乙酸乙酯洗脱，洗脱梯度为25：1、20：1、15：1、10：1、5：1、2：1、1：1，纯甲醇(v/v)，每个梯度洗脱1.5个柱床体积。通过薄层层析、硫酸乙醇显色剂显色，合并相同组分，共得到12个流分(1-12)。流分3、4分别室温重结晶得到羊毛甾醇(2.0g)、3β-羟基羊毛甾-8、24-二烯-21-醛(3.0g)；流分5-6在石油醚-乙酸乙酯混合液(10:1,5：1，v/v)室温下重结晶得到桦褐孔菌醇(7.8g)；流分8使用反相C18(300g)柱层析进一步纯化，洗脱剂为甲醇水，梯度洗脱(10％-100％甲醇)得到10个组分(8.1-10)，组分8.3-4使用反相C18制备柱进行制备分离，甲醇-水80：20(v/v)洗脱得到栓菌酸(3.2g)。高效液相色谱法(HPLC法)测定各单体的纯度，纯度≥95％。检测条件如下：

流动相：甲醇100％；流速：1ml/min；

色谱柱：COSMOSIL 5C₁₈-MS-II Column(250mm×4.6mm i.d.，5μm)；

温度：室温。

核磁共振谱、质谱鉴定各单体的结构，图谱数据如下：

羊毛甾醇

白色针状晶体；ESI-MS m/z:427[M+H]⁺,¹H-NMR(600MHz,CDCl₃):δ5.10(1H,t,J＝7.1Hz,H-24),3.23(1H,dd,J＝11.7Hz,J＝4.4Hz,H-3),1.68(3H,s,H-27),1.60(3H,s,H-26),1.00(3H,s,H-19),0.98(3H,s,H-28),0.91(3H,d,J＝6.2Hz,H-21),0.87(3H,s,H-30),0.81(3H,s,H-29),0.69(3H,s,H-18)；¹³C-NMR(151MHz,CDCl₃):δ134.5(C-8),134.4(C-9),131.0(C-25),125.3(C-24),79.0(C-3),50.5(C-5),50.4(C-17),49.9(C-14),44.5(C-13),39.0(C-4),37.1(C-20),36.4(C-10),36.3(C-1),35.6(C-22),31.0(C-16),30.9(C-15),28.3(C-12),28.0(C-29),27.9(C-7),26.6(C-28),25.8(C-27),25.0(C-23),24.3(C-2),21.1(C-11),19.2(C-19),18.7(C-21),18.3(C-6),17.7(C-26),15.8(C-18),15.5(C-30)。

3β-羟基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛

白色晶体；ESI-MS m/z:439[M-H]^-,¹H-NMR(600MHz,CDCl₃):δ9.46(1H,d,J＝5.7Hz,H-21),5.05(1H,t,J＝7.1Hz,H-24),3.22(1H,dd,J＝11.7Hz,J＝4.4Hz,H-3),1.67(3H,s,H-26),1.57(3H,s,H-27),1.00(3H,s,H-19),0.96(3H,s,H-29),0.90(3H,s,H-30),0.80(3H,s,H-28),0.69(3H,s,H-18)；¹³C-NMR(151MHz,CDCl₃):δ206.3(C-21),134.8(C-8),134.0(C-9),132.5(C-25),123.6(C-24),79.0(C-3),55.5(C-20),50.4(C-5),49.5(C-14),45.4(C-17),44.3(C-13),38.9(C-4),37.1(C-10),35.6(C-1),30.6(C-15),29.7(C-16),29.2(C-7),28.0(C-2),27.8(C-29),26.9(C-22),26.5(C-12),25.8(C-23),25.7(C-26),24.2(C-30),20.8(C-11),19.2(C-6),18.2(C-19),17.8(C-27),16.9(C-18),15.5(C-28)。

桦褐孔菌醇(3)

白色晶体；ESI-MS m/z:441[M-H]^-,¹H-NMR(600MHz,CDCl₃):δ5.18(1H,t,J＝6.7Hz,H-24),3.67(1H,m,J＝8.1Hz,J＝3.9Hz,H-22),3.24(1H,dd,J＝11.7Hz,J＝4.3Hz,H-5),1.75(3H,s,H-27),1.66(3H,s,H-26),1.00(3H,s,H-28),0.99(3H,s,H-19),0.95(3H,d,J＝6.6Hz,H-21),0.88(3H,s,H-30),0.81(3H,s,H-29),0.73(3H,s,H-18)；¹³C-NMR(151MHz,CDCl₃):δ134.9(C-25),134.3(C-9),134.0(C-8),121.1(C-24),78.7(C-3),73.1(C-22),50.2(C-5),49.2(C-14),47.0(C-17),44.6(C-13),41.5(C-20),38.7(C-4),37.8(C-10),35.3(C-1),30.7(C-15,C-16),28.9(C-7),27.7(C-29),27.6(C-2),27.0(C-23),26.3(C-12),25.8(C-20),24.1(C-30),20.8(C-11),19.0(C-6),18.0(C-19),17.7(C-27),15.4(C-18),15.2(C-28),12.4(C-21)。

栓菌酸(3β-羟基羊毛甾-8、24-二烯-21-酸)

白色晶体；ESI-MS m/z:455[M-H]^-,¹H-NMR(600MHz,C₅D₅N):δ5.31(1H,t,J＝7.2Hz,H-24),3.42(1H,dd,J＝7.2Hz,H-3),2.64(1H,dt,J＝3.3Hz,J＝11.1Hz,H-20),2.06(2H,br.d,J＝3.3Hz,H-7),1.90(1H,br.d,J＝5.1Hz,H-22),1.82(1H,br.d,J＝3.1Hz,H-2),1.65(3H,s,H-27),1.60(3H,s,H-26),1.23(3H,s,H-29),1.06(3H,s,H-19),1.05(3H,s,H-28),1.00(3H,s,H-30),0.99(3H,br.s,H-18)；¹³C-NMR(151MHz,C₅D₅N):δ178.4(C-21),134.9(C-9),134.0(C-8),131.5(C-25),124.6(C-24),77.8(C-3),50.7(C-5),49.6(C-14),48.8(C-20),47.5(C-17),44.7(C-13),39.3(C-4),37.1(C-10),35.9(C-1),33.1(C-22),30.6(C-15),29.2(C-12),28.5(C-2),28.4(C-28),27.3(C-16),26.6(C-23),26.5(C-7),25.6(C-26),24.3(C-30),21.0(C-11),19.2(C-19),18.5(C-6),17.5(C-27),16.1(C-29),16.1(C-18)。

实施例2、白桦茸提取物及其单体的药效学试验

1实验方法

1.1 ISO模型的建立

采用10周龄的雄性BALB/c小鼠(平均体重25-30g)，使用大小鼠普通繁殖饲料喂饲，同时给予小鼠背部皮下注射ISO(5mg/kg/d)，连续7天造模，同时每天每只小鼠给予0.5％(0.5g/100mL)羧甲基纤维素钠(CMC-Na)200μL灌胃，得到异丙肾上腺素(ISO)诱导的小鼠心肌肥大及心肌纤维化模型。

1.2 ISO模型组的试验分组及处理

给药实验组(ISO-IO)：采用1.1的方法制备ISO诱导的小鼠心肌肥大及心肌纤维化模型，并自造模开始时起，对造模小鼠同时给予含有IO(即IO乙醇总取物)的0.5％CMC-Na(IO浓度为40mg/mL)，每天给每只小鼠灌胃200μL(折合约200mg/kg/d)，连续给药7天。

给药对照组(ISO)：采用1.1的方法制备ISO诱导的小鼠心肌肥大及心肌纤维化模型，并自造模开始时起，对造模小鼠给予0.5％CMC-Na，每天给每只小鼠灌胃200μL，连续给予7天。

阴性对照组(Control)：正常未经任何处理的雄性BALB/c小鼠使用大小鼠普通繁殖饲料喂饲同时，每天每只小鼠灌胃0.5％CMC-Na 200μL，连续给予7天。

1.3 TAC模型(主动脉弓缩窄模型)的建立

选取8-10周龄、雄性CD1小鼠，随机分到假手术组(Sham)、造模组(TAC)。模型组小鼠戊巴比妥钠注射液腹腔注射麻醉，待刺激鼠尾，小鼠反应不明显后，以仰卧位将其固定于操作板上。用脱毛机去除颈部及胸部毛发，用静脉留置针改装的导管进行小鼠气管插管，并连接于小鼠呼吸机上。胸骨上切迹处纵行剪开皮肤，约1.2cm。用胸骨钳剪开胸骨至第二肋间，胸廓扩张器撑开切口，分离胸腺，暴露主动脉弓。钝性分离主动脉弓周围脂肪组织，于右无名动脉和左颈总动脉之间穿线(7-0丝线)，在丝线与主动脉弓之间垫上25-26G针头后结扎，结扎牢固后迅速撤除垫针。逐层关胸。假手术组小鼠分离主动脉弓后不进行结扎动脉，直接缝合关胸。

1.4 TAC模型组的试验分组及处理

将30只雄性8-10周龄CD1小鼠随机均分假手术组(Sham)、模型组(TAC)、白桦茸给药组(TAC-IO)及白桦茸单体给药组(TAC-IO单体)。

给药实验组(TAC-IO)：采用1.3的方法制备TAC模型，并在造模后即给予200μL含有IO的0.5％CMC-Na(IO浓度为40mg/mL，折合约200mg/kg/d)，连续给药21天。

给药实验组(TAC-IO单体)：采用1.3的方法制备TAC模型，并在造模同时给予200μL含有IO单体的0.5％CMC-Na(IO单体的浓度为20/40mg/mL，折合约100/200mg/kg/d)，连续给药21天。

给药对照组(TAC)：采用1.3的方法制备TAC模型，并对造模小鼠给予0.5％CMC-Na，每天给每只小鼠灌胃200μL，连续给予21天。

阴性对照组(Sham)：采用1.3的方法制备Sham组，并对该组小鼠给予0.5％CMC-Na，每天给每只小鼠灌胃200μL，连续给予21天。

1.5动物操作

TAC术后21天，小鼠称重，取材时沿腹中线切开小鼠皮肤及皮下薄膜，暴露出内脏各器官。心脏PBS灌流后完整分离小鼠心脏，称量心脏总重。留取同一部位心脏进行形态学检测，剩余部分心脏组织取材后立即冻于液氮，稍后，转冻存于-80℃保存，同时，留取小鼠两腿胫骨，使用游标卡尺进行长度测量。样品主要用于RNA提取，蛋白提取等。

另外，留取形态学观察的心肌组织使用4％多聚甲醛固定过夜，之后转入20％蔗糖。心肌组织经脱水、固定、石蜡包埋后制备石蜡切片，用于HE染色和天狼星红染色。

2体外实验材料

2.1乳大鼠心肌细胞系H9C2及小鼠胚胎成纤维细胞系NIH-3T3的培养与体外心肌细胞肥大与成纤维细胞纤维化模型的建立。

1)复苏后的细胞传代两次后接种12孔板。

2)加50mM 10％FBS的DMEM培养24h，实验组同时给予药物孵育(由DMSO溶解)，对照组及模型组给予同浓度DMSO。

3)细胞去除培养基，PBS洗涤细胞3次，每孔加入1mL Trizol用于提取RNA或进行细胞油红O染色。

2.2 MTT实验

1)H9C2/NIH-3T3细胞培养至融合度达80％-90％，消化一个中皿的细胞，进行细胞计数。

2)将细胞计数板在超净台里用大量的酒精洗刷，取胰酶消化后的细胞悬浮液20μL，用枪头抵住一侧中间部位打入计数板中。

3)在低倍镜下找到视野，数16个格内的细胞数，另数其他三个16格，求平均值。

4)16格内相当于0.1μL，计算细胞密度。

5)96孔板每个孔需要的细胞数目为1×10⁴个细胞，根据细胞密度计算实验所需悬浮细胞液的体积，体积不足的由培养基补充。

6)将96孔板区域按实验需求分组：不含H9C2/NIH-3T3细胞，仅用于校正培养基吸光度值的空白组；仅向H9C2/NIH-3T3细胞中加入DMEM完全培养基的对照组；将含有不同浓度的IO及其单体的培养液，每个孔各加入100μL新配细胞悬浮液，得到的实验组。每组设六个平行孔。

7)将H9C2/NIH-3T3细胞在37℃孵箱内(相对湿度90％，CO2浓度5％)分别培养24h或48h。

8)H9C2/NIH-3T3细胞与药物共孵育24h或48h后，终止培养，吸弃培养液。

9)向对照组和实验组每孔加入5.0g/L的四甲基偶氮唑盐(MTT)溶液20μL，继续于37℃细胞培养箱中培养。

10)4h后吸去上清(注意不要吸走生成的紫色结晶)。加入150μL的DMSO，并放入酶标仪，振板10min，使蓝色结晶甲臜完全溶解，10min后在540nm波长处读取吸光值，用空白孔校正，按以下公式计算出细胞存活率：

细胞存活率＝(药物组-空白对照组)/(DMEM组-空白对照组)

2.3 IO及其单体抗H9C2心肌细胞肥大的药效作用

H9C2细胞种植于六孔板，密度调整为2×10⁵个，用含10％FBS DMEM培养一天。待细胞融合度达80％，用含0.5％FBS饥饿细胞24h。之后用10％FBS DMEM配置的AngⅡ(血管紧张素II)及不同浓度IO及其单体共同孵育细胞48h。之后，提RNA检测心肌肥大相关胎儿基因表达。

2.4IO及其单体抗MIH-3T3心肌细胞纤维化的药效作用

六孔板培养NIH-3T3细胞，加入10％FBS DMEM培养一天。待细胞融合度达80％，用含0.5％FBS饥饿细胞24h。之后用10％FBS DMEM配置的AngⅡ及不同浓度IO及其单体孵育细胞24h。之后，提RNA检测心肌纤维化相关胎儿基因表达。

3检测指标

(1)小鼠心体比和心胫比

根据1.5中处死小鼠前所称体重、处死后所称心脏总重，以及使用游标卡尺所测量的胫骨长度，计算各组小鼠的心脏体重比(简称心体比，即心脏重与体重的质量比，单位为mg/g)和心脏胫骨比(简称心胫比，即心脏重量与胫骨长度的比值，单位为mg/mm)。

(2)小鼠心肌组织石蜡切片天狼星红染色及定量

用于形态学检测的心脏组织由北京大学心血管所形态学室进行标准天狼星红染色。

(3)小鼠心脏RNA提取及Realtime PCR检测心肌组织中ANF基因、BNP基因，COL1α基因、COL3基因以及心肌纤维化标志基因Col 1α和Col 3的表达水平

其中，所述ANF基因具体为GenBank为NM_008725所示的基因(Up date：2016-10-26)；BNP基因具体为GenBank为NM_001287348所示的基因(Up date：2017-09-24)；COL1α基因具体为GenBank为NM_007742所示的基因(Up date：2017-11-18)；COL3基因具体为GenBank为NM_009930所示的基因(Up date：2017-09-17)；AP-1基因具体为GenBank为NM_010592所示的基因(Up date：2016-06-13)；TGF-β基因具体为GenBank为NM_011577所示的基因(Up date：2017-03-11)；Smad 3基因具体为GenBank为NM_016769所示的基因(Update：2017-10-14)；PGC1α基因具体为GenBank为NM_008904所示的基因(Up date：2017-10-14)；AMPK基因具体为GenBank为NM_001013367所示的基因(Up date：2015-07-19)；PPARα基因具体为GenBank为NM_001113418所示的基因(Up date：2017-10-10)；SOD2基因具体为GenBank为NM_013672所示的基因(Up date：2017-07-04)；IL-6基因具体为GenBank为NM_001314054所示的基因(Up date：2017-10-15)；F4/80基因具体为GenBank为NM_001355722所示的基因(Up date：2017-10-04)。

小鼠心脏RNA提取及具体的Realtime PCR检测方法如下：取一小部分-80℃保存的小鼠心脏，用消毒无RNA酶的器械取出组织，迅速在预冷的PBS中冲洗干净，装入离心管置于液氮中。在匀浆管中加入Trizol，每50-100mg的组织所

需Trizol 1mL。组织从液氮中取出，立即倒入装有Trizol的匀浆管中，匀浆。把匀浆后的样品移入干净的离心管中，室温静置5分钟。4℃12000rpm离心10分钟，取上清至新的离心管中。每管加入200μL新鲜氯仿(提前放入冰箱)，用手剧烈震荡15秒，室温静置3分钟。4℃12000rpm离心15分钟。此时液体分为三层，小心吸取上层液体并转移至新的离心管中，注意不要吸到界面相的DNA和蛋白质。每管加入与上清等体积的新鲜异丙醇，反复颠倒混匀，室温静置10分钟。4℃12000rpm离心15分钟。此时可见管底有白色片状沉淀。弃掉上清，加入预冷的用DEPC水配置的75％乙醇1mL进行洗涤，涡旋使沉淀悬起。4℃7500rpm离心5-10分钟。小心倒掉上层液体(乙醇)。小心吸掉残余的乙醇，冰上静置直至乙醇完全挥发干净。加入适当体积(20-50μL)的DEPC水溶解RNA，难溶的RNA可置于55℃水浴5分钟。使用RNA电泳和紫外分光光度计分别检测RNA的质量和丰度。根据EvaGreen qPCR MasterMix(加拿大abm公司)提供的上样体系进行实时定量RT-PCR。

其中，用于检测心肌肥大标志物ANF的基因的引物序列如下：

Forward GCTTCCAGGCCATATTGGAG

Reverse GGGGGCATGACCTCATCTT

用于检测心肌肥大标志物BNP的基因的引物序列如下：

Forward GAGGTCACTCCTATCCTCTGG

Reverse GCCATTTCCTCCGACTTTTCTC

用于检测心肌肥大标志物Myh6的基因的引物序列如下：

Forward ACGGTGACCATAAAGGAGGA

Reverse ACGGTGACCATAAAGGAGGA

用于检测心肌肥大标志物Myh7的基因的引物序列如下：

Forward GCCCTTTGACCTCAAGAAAG

Reverse CTTCACAGTCACCGTCTTG

用于检测心肌纤维化标志基因Col 1α的引物序列如下：

Forward GGGTCTATGCCACGATTC

Reverse GTGTCCCATGTTGGATTTG

用于检测心肌纤维化标志基因Col 3的引物序列如下：

Forward GGGTCTATGCCACGATTC

Reverse GTGTCCCATGTTGGATTTG

以GAPDH为内参，用于检测内参的引物序列如下：

Forward TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG

Reverse TCCTTGGAGGCCATGTAGGCCAT

用于检测心肌纤维化通路标志基因AP-1的引物序列如下：

Forward TTCCTCCAGTCCGAGAGCG

Reverse TGAGAAGGTCCGAGTTCTTGG

用于检测心肌纤维化通路标志基因TGF-β的引物序列如下：

Forward CCACCTGCAAGACCATCGAC

Reverse CTGGCGAGCCTTAGTTTGGAC

用于检测心肌纤维化通路标志基因Smad3的引物序列如下：

Forward AGGGGCTCCCTCACGTTATC

Reverse CATGGCCCGTAATTCATGGTG

用于检测心肌能量代谢通路相关基因PGC-1α的引物序列如下：

Forward TATGGAGTGACATAGAGTGTGCT

Reverse GTCGCTACACCACTTCAATCC

用于检测心肌能量代谢通路相关基因AMPK的引物序列如下：

Forward GTCAAAGCCGACCCAATGATA

Reverse CGTACACGCAAATAATAGGGGTT

用于检测心肌能量代谢通路相关基因PPAR-α的引物序列如下：

Forward AACATCGAGTGTCGAATATGTGG

Reverse CCGAATAGTTCGCCGAAAGAA

用于检测抗氧化相关基因SOD2的引物序列如下：

Forward CAGACCTGCCTTACGACTATGG

Reverse CTCGGTGGCGTTGAGATTGTT

用于检测慢性炎症相关基因IL-6的引物序列如下：

Forward TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC

Reverse TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC

用于检测巨噬细胞标志基因F4/80的引物序列如下：

Forward CTGCACCTGTAAACGAGGCTT

Reverse GCAGACTGAGTTAGGACCACAA

4实验结果：

1.白桦茸(IO)灌胃抑制ISO诱导小鼠心肌肥大与心肌纤维化

1.1 IO对ISO诱导小鼠心体比、心胫比的作用

IO抗心肌肥大药效实验中，模型组小鼠进行ISO皮下注射，IO组小鼠在造模同时灌胃给予IO。7天后小鼠处死取材，结果表明：与Control组相比，模型组小鼠心体比和心胫比均显著增加，表明模型组小鼠出现了显著的心肌肥大。然而，ISO造模同时给予200mg/kg的IO能显著抑制小鼠心体比和心胫比(图1)。

1.2 IO对ISO诱导小鼠心肌肥大与纤维化相关胎儿基因表达的影响

心肌肥大的特征之一是胎儿基因的再激活。当致肥厚刺激存在时，受刺激的心房肌细胞和心室肌细胞分别分泌ANF和BNP。心肌肥大病理进展往往伴随细胞间质中胶原沉积，即伴随心肌纤维化。因此，我们对实验小鼠胎儿基因ANF，BNP，COL1α，COL3 mRNA表达水平进行了检测。如图2所示，ISO组小鼠心肌组织ANF，BNP，COL1α，COL3的mRNA表达量较Control组显著性上调，而IO给药显著抑制BNP的mRNA表达。

2.白桦茸(IO)灌胃抑制TAC诱导小鼠心肌肥大与心肌纤维化

2.1 IO对TAC诱导小鼠心体比、心胫比及肥大相关胎儿基因的作用

IO抗心肌肥大药效实验中，模型组小鼠进行TAC手术，IO组小鼠在造模同时灌胃给予IO。3周后小鼠处死取材，结果表明：与Sham组相比，模型组小鼠心体比和心胫比均显著增加，表明模型组小鼠出现了显著的心肌肥大。然而，TAC造模同时给予200mg/kg的IO能显著抑制小鼠心体比和心胫比。同时，IO显著抑制肥大相关胎儿基因BNP的表达(图3)。

2.2 IO对TAC诱导小鼠心肌组织炎性细胞浸润的影响

心肌肥大伴随炎性细胞浸润。图4，HE染色结果表明白桦茸(IO)灌胃减少TAC诱导小鼠心肌组织炎性细胞浸润及抑制炎性因子IL-6和F4/80的表达。

2.3 IO对TAC诱导小鼠心脏纤维化相关胎儿基因表达的影响

心肌肥大病理进展往往伴随细胞间质中胶原沉积，即伴随心肌纤维化。心肌纤维化主要发生在细胞间质和血管周围。图5所示，天狼星红染色结果表明，TAC显著引起小鼠心肌组织间质和血管周的纤维化。同时，与心肌纤维相关胎儿基因Col 1α和Col 3的mRNA表达水平在TAC组显著上调。然而，IO给药能显著抑制TAC诱导小鼠心肌纤维化。

3.在H9C2、NIH-3T3细胞上验证IO及其单体抑制心肌细胞肥大与纤维化的活性

3.1 IO及其单体对H9C2细胞存活率及其对肥大相关胎儿基因表达的影响

对H9C2进行IO及其4种单体(羊毛甾醇、桦褐孔菌醇、3β-羟基羊毛甾-8、24-二烯-21-醛及3β-羟基羊毛甾-8、24-二烯-21-酸)的MTT实验进行药物最大有效安全剂量筛选。并且，以此剂量孵育细胞，提RNA检测心肌肥大相关胎儿基因的表达。图6，8，10结果显示，IO及其单体(羊毛甾醇、桦褐孔菌醇、3β-羟基羊毛甾-8、24-二烯-21-醛及3β-羟基羊毛甾-8、24-二烯-21-酸)的最大有效安全剂量分别为3.125μM、1μM、12μM、0.5μM、25μM；IO及其单体在体外水平均能够抑制肥大相关胎儿基因的上调。

3.2 IO及其单体对NIH-3T3细胞存活率及其纤维化的影响实验

对NIH-3T3进行IO及其4种单体(羊毛甾醇、桦褐孔菌醇、3β-羟基羊毛甾-8、24-二烯-21-醛及3β-羟基羊毛甾-8、24-二烯-21-酸)的MTT实验进行药物最大有效安全剂量筛选。并且，以此剂量孵育细胞，提RNA检测心肌纤维化相关胎儿基因的表达。图7，9，10结果显示，IO及其单体(羊毛甾醇、桦褐孔菌醇、3β-羟基羊毛甾-8、24-二烯-21-醛及3β-羟基羊毛甾-8、24-二烯-21-酸)的最大有效安全剂量分别为2μM、12μM、8μM、4μM、16μM；IO及其单体在体外水平均能够抑制纤维化相关基因的上调。

4.白桦茸有效活性单体成份抑制TAC诱导的小鼠心肌肥大与心肌纤维化

4.1白桦茸有效活性单体成份对TAC诱导小鼠心体比和心胫比的作用

IO有效活性单体成份抗心肌肥大药效实验中，模型组小鼠进行TAC手术，IO有效活性单体成份给药组小鼠在造模同时灌胃给予IO有效活性单体成份。3周后小鼠处死取材，结果表明：与Sham组相比，模型组小鼠心体比和心胫比均显著增加，表明模型组小鼠出现了显著的心肌肥大。然而，TAC造模同时给予100mg/kg的IO有效活性单体成份的显著抑制小鼠心体比和心胫比(图11)。

4.2 IO有效活性成份对TAC诱导的小鼠心肌肥大与纤维化相关基因表达的影响

此部分，我们对实验小鼠胎儿基因ANF，BNP，COL1α，COL3 mRNA表达水平进行了检测。如图12,13所示，TAC组小鼠心肌组织ANF，BNP，COL1α，COL3的mRNA表达量较Sham组显著性上调，而IO有效活性成份给药显著抑制上述基因的mRNA表达。

5.白桦茸及其有效活性单体(桦褐孔菌醇)成份灌胃调控肥大与纤维化通路相关因子检测

在探索IO及其单体抑制心肌肥大与纤维化机制方面，我们分别检测了纤维化通路中AP-1，TGF-β，Smad2/3等基因表达以及肥大相关基因PGC-1α，AMPK，SOD2，PPAR-α的表达。图14，15显示，IO单体均能纠正TAC诱导的上述基因的不良调控。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

SEQUENCE LISTING

<110> 北京大学

<120> 白桦茸在制备抗心室重构的药物中的应用

<130> GNCZJ191966

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 1

gcttccaggc catattggag 20

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gggggcatga cctcatctt 19

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 3

gaggtcactc ctatcctctg g 21

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

gccatttcct ccgacttttc tc 22

<210> 5

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 5

acggtgacca taaaggagga 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

acggtgacca taaaggagga 20

Claims (10)

1.白桦茸或白桦茸提取物在下述至少一项中的应用：

(1)制备预防和/或治疗心室重构的产品；

(2)制备预防和/或治疗以心室重构为基础的疾病的产品；

(3)制备预防和/或治疗心肌肥大的产品；

(4)制备预防和/或治疗心肌纤维化的产品。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的心室重构是心力衰竭的病理基础，包括心肌的肥大与心肌的纤维化；

所述以心室重构为基础的疾病包括心力衰竭、心脏肥大、心脏纤维化；

所述预防和/或治疗心肌肥大体现在下述至少一方面：

a)抑制由于心肌肥大引起的机体心脏体重比和/或心脏胫骨比的升高；

b)抑制由于心肌肥大引起的机体心肌组织中心肌肥大相关胎儿基因表达水平升高；

c)抑制心肌组织炎性因子表达水平升高；

d)调控心肌组织中PGC-1α，AMPK，SOD2，PPAR-α的表达水平；

所述预防和/或治疗心肌纤维化具体体现在下述至少一方面：

e)抑制由于心肌纤维化引起的心肌组织中心肌纤维化标志基因表达水平升高；

f)抑制心肌组织纤维化通路中AP-1基因、TGF-β基因、Smad2/3基因表达水平升高。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述心肌肥大相关胎儿基因选自下述至少一种：ANF基因、BNP基因、Myh6基因和Myh7基因；

所述炎症因子为白介素IL-6和/或F4/80；

所述心肌纤维化标志基因具体为Col 1基因、Col 1α基因或Col 3基因。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于：所述白桦茸提取物为白桦茸的乙醇提取物或白桦茸的乙醇水溶液提取物；所述乙醇水溶液中乙醇的体积分数为60-100％。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述白桦茸为白桦茸菌丝体和/或白桦茸子实体；

所述白桦茸的乙醇提取物或白桦茸的乙醇水溶液提取物按照下述方法制备得到：将白桦茸菌丝体先碎成粗粉，用乙醇或体积分数95％乙醇水溶液进行加热回流提取，重复提取至少1-5次；合并回流提取液、抽滤、减压浓缩得到白桦茸提取物。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的应用，其特征在于：所述白桦茸或白桦茸提取物中的活性成分为白桦茸三萜类化合物，包括下述四种成分：桦褐孔菌醇、羊毛甾醇、3β-羟基羊毛甾-8、24-二烯-21-醛和3β-羟基羊毛甾-8、24-二烯-21-酸。

7.桦褐孔菌醇、羊毛甾醇、3β-羟基羊毛甾-8、24-二烯-21-醛和3β-羟基羊毛甾-8、24-二烯-21-酸中的至少一种物质在下述至少一项中的应用：

(1)制备预防和/或治疗心室重构的产品；

(2)制备预防和/或治疗以心室重构为基础的疾病的产品；

(3)制备预防和/或治疗心肌肥大的产品；

(4)制备预防和/或治疗心肌纤维化的产品。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述的心室重构是心力衰竭的病理基础，包括心肌的肥大与心肌的纤维化；

所述以心室重构为基础的疾病包括心力衰竭、心脏肥大、心脏纤维化；

所述预防和/或治疗心肌肥大体现在下述至少一方面：

a)抑制由于心肌肥大引起的机体心脏体重比和/或心脏胫骨比的升高；

b)抑制由于心肌肥大引起的机体心肌组织中心肌肥大相关胎儿基因表达水平升高；

c)抑制心肌组织炎性因子表达水平升高；

d)调控心肌组织中PGC-1α，AMPK，SOD2，PPAR-α的表达水平；

所述预防和/或治疗心肌纤维化具体体现在下述至少一方面：

e)抑制由于心肌纤维化引起的心肌组织中心肌纤维化标志基因表达水平升高；

f)抑制心肌组织纤维化通路中AP-1基因、TGF-β基因、Smad2/3基因表达水平升高。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：所述心肌肥大相关胎儿基因选自下述至少一种：ANF基因、BNP基因、Myh6基因和Myh7基因；

所述炎症因子为白介素IL-6和/或F4/80；

所述心肌纤维化标志基因具体为Col 1基因、Col 1α基因或Col 3基因。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的应用，其特征在于：所述产品为药物和/或保健品。

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