CN116549548A - 黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物用于预防和/或治疗心肌纤维化的用途 - Google Patents

Abstract

本发明提供了黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物在制备预防和/或治疗心肌纤维化的药物中的用途，其中，甾体总皂苷以甾体总皂苷元计，含量按重量计不少于35％。经过实验研究发现，黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物具有显著的预防和/或治疗心肌纤维化，改善患者临床症状的作用，为心肌纤维化患者的临床治疗提供了一种新的、安全的、疗效突出的用药选择，具有良好的经济效益和社会效益。

Description

黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物用于预防和/或治疗 心肌纤维化的用途

技术领域

本发明属于药物化学技术领域。具体涉及黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物在制备用于预防和/或治疗心肌纤维化的药物中的用途。

背景技术

心肌纤维化(myocardial fibrosis，MF)是由于各种原因引起心肌中正常心肌细胞减少，心肌成纤维细胞(CFs)增生，α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(COL1A1)和Ⅲ型胶原蛋白(COL3A1)比例升高，排列紊乱，细胞外基质成分在心脏过度生成和沉积，导致心脏发生严重瘢痕化、组织僵硬和功能受损的一种病理现象。心肌组织中胶原蛋白浓度显著升高是心肌纤维化的标志，α-SMA、COL1A1和COL3A1是心肌组织胶原蛋白的主要组成部分。在细胞外基质中，纤维胶原蛋白是主要结构蛋白，COL1A1和COL3A3是构成心肌胶原网络的主要成分，分别约占85％和10％。I型胶原具有张力，决定心肌的硬度；III型胶原的张力较I型胶原弱，但可形成良好的网状系统，决定心肌的弹性，其主要功能是为心脏提供骨架支撑、传递信号以及促进心脏有序收缩。不同病因使胶原纤维的数量、分布及排列发生改变，均可导致纤维化的形成。心肌发生纤维化改变时，α-SMA是肌成纤维细胞骨架中主要标志蛋白之一，且α-SMA常作为心肌纤维化检测的标志性蛋白(宋晶.基于TGF-β1/LIMK1信号通路研究解毒通络方对大鼠心肌纤维化的抑制作用[D].长春中医药大学,2020.)。

心肌纤维化是多种心脏疾病发展至一定阶段具有的共同病理改变，引起心肌舒缩、传导功能及代谢异常，并在心室重构中发挥重要作用，甚至可引起心律失常、心力衰竭和猝死等(昝树杰,赵娜娜,王凯.中医药治疗心肌纤维化的研究进展[J].中西医结合心脑血管病杂志,2021,19(20):3500-3503.)。作为一种进展性的疾病，早期预防具有重要意义，但是目前心肌纤维化无可靠的预防方法。因此，发现抗心肌纤维化药物作用靶点，并寻找有效的治疗药物十分必要。

甾体皂苷(steroidal saponins)是植物中一类重要的生物活性物质，甾体皂苷的苷元是含有27个碳原子的螺甾烷醇或呋甾烷醇，大多数存在于单叶子植物的百合科，石蒜科和薯蓣科植物中。黄山药又名姜黄、姜黄草、老虎姜、猴节莲，为薯蓣科薯蓣属植物黄山药Dioscoreapanthaica Prain et Burkill的根茎，分布于西南及湖北、湖南等地。穿山龙又名穿山骨、穿地龙等，为薯蓣科薯蓣属植物穿龙薯蓣Dioscorea nipponica Makino的根茎，分布于东北、华北、西北及河南等地。

地奥心血康及其胶囊制剂主要有效成分是从黄山药和/或穿龙薯蓣中提取的甾体总皂苷，具有活血化瘀、行气止痛，扩张冠脉血管、改善心肌缺血的作用，适用于预防和治疗冠心病、心绞痛及瘀血内阻之胸痹、眩晕、气短、心悸、胸闷或痛等症。但现有技术中，针对黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物预防和/或治疗心肌纤维化尚无相关研究报道。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物用于预防和/或治疗心肌纤维化的应用。

本发明提供了黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物在制备用于预防和/或治疗心肌纤维化的药物中的用途。

本发明用途的一种实施方式是，其中，本发明的黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物含甾体总皂苷以甾体总皂苷元计，含量按重量计不少于所述黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物的35％，和/或含伪原薯蓣皂苷(C₅₁H₈₂O₂₁)，含量按重量计不少于所述黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物的15.0％。

本发明用途的一种实施方式是，其中，本发明的黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物为地奥心血康。地奥心血康是已有国家标准的中药提取物，其质量标准记载于《中国药典》2015年第一部第820页至821页：地奥心血康按干燥品计算，含甾体总皂苷以甾体总皂苷元计，含量按重量计不少于35.0％；含伪原薯蓣皂苷，含量按重量计不少于15.0％。

本发明用途的一种实施方式是，其中，本发明的黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物含有通式A和/或通式B的呋甾烷醇类甾体皂苷，和通式C的螺甾烷醇类甾体皂苷或皂苷元，重量配比为：呋甾烷醇类甾体皂苷5～25份、螺甾烷醇类甾体皂苷或皂苷元1～10份，

其中，R₁，R₂，R₃独立地为H、单糖或多糖；所述单糖任选地为葡萄糖或鼠李糖；所述多糖任选为直链或支链的二糖至五糖，所述二糖至五糖任选地由葡萄糖和/或鼠李糖组成；

优选的，R₁，R₂，R₃独立地选自：

H、-gIc、/>

进一步优选的，在本发明的黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物中，以重量比计，所述呋甾烷醇类甾体皂苷和螺甾烷醇类甾体皂苷的含量之和不少于所述黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物的50％。

根据本发明的用途，其中，所述黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物抑制纤维化标志物α-SMA、COL1A1和COL3A1的表达。

根据本发明的用途，其中，本发明的黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物为口服制剂，所述口服制剂可选自片剂、胶囊、颗粒剂、滴丸等。

本发明用途的一种实施方式是，其中，本发明的黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物可由黄山药和/或穿龙薯蓣经水提醇沉后由大孔树脂洗脱得到。

本发明用途的一种实施方式是，其中，本发明的黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物通过以下方法(即，中国专利ZL200580033335.2中所要求保护的提取物的制备方法)制备得到，该方法包括：

a、以中药黄山药、穿山龙或新鲜采集的黄山药、穿龙薯蓣为原料，经切片或粉碎后，加水、甲醇、乙醇、正丁醇或其它低脂肪醇中的一种或任意两种或者多种溶剂以任意比例组成的混合溶液为溶媒提取，溶媒量为原料的15～25倍(V/W，L/Kg)；

b、将a步骤制备的提取液冷却过滤、滤液通过吸附树脂柱、弃去流出液，用水洗至流出液至无色，弃去水洗液；

c、将b步骤的水洗后的吸附树脂柱用乙醇、甲醇、丙酮、50％～90％乙醇、30～80％含水甲醇或60～95％含水丙酮中的一种或多种溶剂洗脱，收集洗脱液，浓缩；

d、将c步骤的浓缩液加60～95％醇醇沉，过滤，收集滤液，浓缩，干燥，即得。

优选的，上述制备方法中的a步骤中以黄山药、穿龙薯蓣的根茎为原料；

优选的，d步骤中使用的醇为低级脂肪醇；如乙醇、甲醇、丙醇或异丙醇；

上述方法中使用的溶剂以体积浓度计，如50％～90％乙醇指：体积浓度为50％～90％的乙醇水溶液。

有益效果

经过实验研究发现，黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物具有显著的预防和/或治疗心肌纤维化，为心肌纤维化患者的临床治疗提供了一种新的、安全的、疗效突出的用药选择，具有良好的经济效益和社会效益。

附图说明

图1示出地奥心血康对正常生长的MCF细胞的影响。

图2示出地奥心血康对ISO诱导的成纤维细胞异常增殖的影响。

图3示出地奥心血康对ISO诱导的MCF细胞中纤维化标志物α-SMA、COL1A1和COL3A1的基因表达水平的影响。

图4示出地奥心血康对ISO诱导的MCF细胞中纤维化标志物α-SMA、COL1A1和COL3A1的蛋白水平的影响。

图5示出地奥心血康对心肌纤维化小鼠模型的心重指数的影响。

图6示出地奥心血康对心肌纤维化小鼠模型的心肌羟脯氨酸含量的影响。

图7示出小鼠心肌组织HE染色结果。

图8示出根据小鼠心肌组织Masson染色结果测定的胶原容积分数CVF。

图9示出根据小鼠心肌组织天狼星红染色结果测定的胶原容积分数CVF。

图10示出地奥心血康对心肌纤维化小鼠模型心肌组织中纤维化标志物α-SMA、COL1A1和COL3A1的基因表达水平的影响。

图11示出地奥心血康对心肌纤维化小鼠模型心肌组织中纤维化标志物α-SMA、COL1A1和COL3A1蛋白水平的影响。

具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围内。

在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。

实施例1地奥心血康对ISO诱导的成纤维细胞异常增殖的影响

本实验采用异丙肾上腺素(ISO；MCE，HY-B0468))诱导小鼠心肌成纤维细胞(MCF细胞)异常增殖。首先通过测试不同浓度的ISO及不同的作用时间，发现：10μmol/L ISO作用MCF细胞48h后，细胞增殖率显著上升。然后在该造模实验条件下，考察了不同浓度的地奥心血康对ISO诱导的MCF细胞增殖的影响。另外还考察了地奥心血康对正常生长的MCF细胞的影响。

1.1、试验方法

称取地奥心血康原料药(DAXXK，批号：170206)溶于DMSO(北京索莱宝，D8371)中配置成10mg/mL储液，加样时用RPMI 1640培养基稀释至相应浓度。MCF细胞以RPMI 1640培养基培养。将处于对数生长期的MCF细胞按1×10个/mL的细胞浓度接种于96孔板中，每孔100μL。分别进行如下操作：

(1)检测地奥心血康对MCF细胞的细胞毒性：接种至96孔板中的MCF细胞培养24h待细胞贴壁后，换液加入含不同浓度地奥心血康(1，10，20，40，80，100，200μg/mL)的培养基分别孵育3、6、9和12h后，用CCK8法检测细胞活力。同时设地奥心血康200μg/mL时相应的DMSO浓度做溶剂对照，以消除DMSO对细胞生长的影响。不加样品及溶剂的孔为空白对照。相对细胞活性＝OD_样品/OD_空白对照，空白对照的相对细胞活性＝1。

(2)检测地奥心血康对ISO诱导的成纤维细胞异常增殖的影响：接种至96孔板中的MCF细胞培养24h待细胞贴壁后，换液加入含不同浓度地奥心血康(20,40,80μg/mL)的培养基分别孵育3、6、9和12h，吸弃培养液，更换为含10μmol/L ISO的培养基，培养48h后，用CCK8法检测细胞活力。同时设地奥心血康80μg/ml时相应的DMSO浓度做溶剂对照，以消除DMSO对细胞生长的影响。相对细胞活性＝OD_样品/OD_溶剂对照，溶剂对照的相对细胞活性＝1。

1.2、结果

如图1所示，地奥心血康作用于MCF细胞3、6、9和12h后，对MCF无细胞毒作用。如图2所示，ISO刺激导致MCF细胞数量明显增加(与Control组相比，^##p＜0.01)，与ISO模型组比较，地奥心血康给药组细胞活力显著下降(与ISO组相比，*p<0.05，**p<0.01)，且在作用6h时效果最为明显。实验结果表明，地奥心血康能显著抑制ISO诱发的MCF的异常增殖，且对正常生长的MCF没有细胞毒性。

实施例2地奥心血康对ISO诱导的成纤维细胞纤维化的影响

胶原蛋白浓度显著升高是心肌纤维化的标志，其中α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、Ⅰ型胶原蛋白(COL1A1)和Ⅲ型胶原蛋白(COL3A1)是心肌胶原蛋白的主要组成部分。为体外研究地奥心血康对心肌纤维化的作用，本实验采用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-timePCR，qRT-PCR)和Western Blot等方法检测地奥心血康对ISO诱导的MCF细胞中纤维化标志物(α-SMA、COL1A1和COL3A1)的影响。

2.1、试验方法

MCF细胞接种于12孔板中，培养24h待细胞贴壁后，更换为含地奥心血康的培养基(20、40和80μg/mL)，孵育6h后更换为含10μmol/L ISO的培养基，继续作用48h。同时设地奥心血康80μg/ml时相应的DMSO浓度做溶剂对照，以消除DMSO对细胞生长的影响。

实时荧光定量PCR分析：将上述细胞样本提取总RNA，分析纯度后，逆转录制备cDNA文库，获得的cDNA保存于-20℃。按照SYBRPremix Ex Taq^TM II(Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书，进行实时荧光定量PCR实验，并分析不同样本间目的基因mRNA表达水平的变化(应用△△Ct法计算)。所用引物序列见表1。

表1 qRT-PCR序列

Western Blot：将细胞样本提取总蛋白。用BCA试剂盒测定蛋白浓度，-80℃分装保存。按照标准的Western Blot实验流程进行电泳、转膜、封闭、孵育抗体、照胶等步骤。采用Gel-ProAnalyzer专业图像分析软件进行图像分析。以GAPDH为基准，计算蛋白的相对表达量。

2.2、结论

实时荧光定量PCR分析了纤维化标志物(α-SMA、COL1A1和COL3A1)的mRNA表达水平。如图3所示，ISO诱导显著升高了MCF细胞中α-SMA、COL1A1和COL3A1的表达水平(与溶剂对照组相比，^##p＜0.01)，地奥心血康处理显著降低了心肌胶原蛋白基因的表达水平(与ISO模型对照组相比，*p<0.05,**p<0.01)。

Western Blot实验结果也印证了地奥心血康对心肌胶原蛋白的调控作用。胶原蛋白Western Blot结果见图4，ISO模型对照组胶原蛋白α-SMA、COL1A1和COL3A1显著升高；地奥心血康给药组胶原蛋白的水平显著下降，说明地奥心血康能减轻MCF的纤维化程度。

实施例3心肌纤维化小鼠模型的抗纤维化试验

3.1试验方法

称取适量地奥心血康原料药(批号：170206)粉末，加入少量0.5％CMC-Na溶液(溶媒)，研磨均匀后，再加入适量CMC-Na配置成所需浓度，4℃保存，用前取出至室温。

雄性C57BL/6小鼠(由大连医科大学SPF实验动物中心提供，实验动物合格证号：SCXK(辽)2013-0006)60只，随机分为：溶媒对照组、ISO模型对照组、地奥心血康高剂量(1.6g/kg)、中剂量(0.8g/kg)、低剂量(0.4g/kg)给药组和地奥心血康正常小鼠给药组(1.6g/kg)，每组10只。(注：地奥心血康给药组是指ISO模型组给予地奥心血康相应剂量治疗；地奥心血康正常小鼠给药组是指对正常小鼠给药)。

地奥心血康给药组和地奥心血康正常小鼠给药组小鼠灌胃给予相应剂量的地奥心血康溶液，每天一次，连续37天；溶媒对照组和ISO模型对照组小鼠灌胃给予0.5％CMC-Na溶液，每天一次，连续37天。灌胃结束后第8天起，ISO模型对照组、地奥心血康给药组小鼠每日皮下注射ISO(2.5mg/kg)诱发心肌纤维化模型，连续注射1个月；溶媒对照组和地奥心血康正常小鼠给药组小鼠则每日皮下注射等量(2.5mg/kg)的生理盐水，连续注射1个月。末次注射ISO和生理盐水后，禁食禁水。于次日处死小鼠取心脏组织称重并进行如下指标的检测。

1)心肌中羟脯氨酸(HYP)的检测

取小鼠心组织适量，用预冷的生理盐水冲洗，滤纸拭干，按照1:9(W/V)比例加入生理盐水，冰浴剪碎后，充分匀浆。将匀浆液于4℃以3000r/min离心15min，收集上清液即为心组织匀浆液。用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定样品的蛋白浓度，分装后于-20℃备用。按羟脯氨酸(HYP)试剂盒说明操作，测定心肌组织中HYP含量。

2)心肌组织病理学考察

固定后的心肌组织以石蜡包埋制成蜡块，切5μm薄片，制成空白切片，然后依照组织病理学常规方法进行伊红染色(H&E染色)、Masson染色和天狼星红染色(普通光和偏振光)，置于正置荧光显微镜200倍下观察拍照，并计算胶原容积分数CVF(胶原阳性的面积与组织总面积的百分比)。

3)实时荧光定量PCR分析及WesternBlot实验方法见实施例2。

3.2结果

1)对小鼠心重指数的影响

根据心脏重量(mg)与体重(g)之比计算心重指数(CWI)，结果见图5，ISO模型对照组小鼠的心脏重量明显增加，心重指数比溶媒对照组明显增高(^##p<0.01)，地奥心血康给药组小鼠心重指数降低(与ISO模型对照组相比，*p<0.05，**p＜0.01)。

2)对小鼠心肌羟脯氨酸含量的影响

羟脯氨酸是胶原组织的主要成分之一，可作为胶原代谢指标，评价心肌纤维化的程度。图6表明，ISO模型对照组小鼠组织羟脯氨酸(HYP)的水平显著升高，从499.4±263.0μg/g上升到1184±367.2μg/g，说明ISO模型对照组小鼠心肌胶原蛋白含量升高(^##p<0.01)。与ISO模型对照组相比，地奥心血康中、高剂量给药组小鼠HYP的含量显著下降(^**p＜0.01)，表明地奥心血康能够减轻小鼠的心肌纤维化。

3)对小鼠心肌组织病理学的改变

小鼠心肌组织HE染色结果如图7所示，溶媒对照组小鼠心肌纤维排列整齐，无出血、水肿等异常现象。ISO模型对照组小鼠出现明显的心肌组织纹理不清，肌浆固缩和心肌间隙增加等现象。地奥心血康给药组，与ISO模型对照组相比，心肌组织受损程度明显降低，上述情况得到明显改善。

胶原纤维是细胞外基质成分之一，检测胶原纤维，可以来判断纤维化的程度。Masson染色和天狼星红染色都具有显示心肌组织胶原纤维的效果。图8是根据Masson染色结果计算的胶原容积分数CVF。结果表明ISO模型对照组小鼠心肌胶原纤维明显增多(与溶媒对照组相比，^##p＜0.01)，地奥心血康给药组情况得到明显改善(与ISO模型对照组相比，**p<0.01)。

图9是根据天狼星红染色结果计算的胶原容积分数CVF。结果显示，ISO模型对照组中Ⅰ型、Ⅲ型胶原纤维明显增多，呈波浪形，有分支交织成网(与溶媒对照组相比，^##p＜0.01)，地奥心血康中、高剂量给药组纤维化情况明显得到改善(与ISO模型对照组相比，**p<0.01)。

4)对纤维化标志物的影响

如图10所示，纤维化标志物心肌胶原蛋白α-SMA、COL1A1和COL3A1的mRNA水平在ISO模型对照组中显著升高(与溶媒对照组相比，^##p＜0.01)，地奥心血康给药组则显著降低了它们的mRNA水平(与ISO模型对照组相比，*p<0.05,**p<0.01)。

Western Blot实验结果见图11，ISO模型对照组胶原蛋白α-SMA、COL1A1和COL3A1显著升高(与溶媒对照组相比，^##p＜0.01)；地奥心血康给药组胶原蛋白的水平显著下降(与ISO模型对照组相比，*p<0.05,**p<0.01)，说明地奥心血康能减轻ISO导致的心肌组织纤维化的程度。

Claims (9)

1.黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物在制备用于预防和/或治疗心肌纤维化的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物含甾体总皂苷以甾体总皂苷元计，含量按重量计不少于所述黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物的35％，和/或含伪原薯蓣皂苷，含量按重量计不少于所述黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物的15.0％。

3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物为地奥心血康。

4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物含有通式A和/或通式B的呋甾烷醇类甾体皂苷，和通式C的螺甾烷醇类甾体皂苷或皂苷元，重量配比为：呋甾烷醇类甾体皂苷5～25份、螺甾烷醇类甾体皂苷或皂苷元1～10份，

其中，R₁，R₂，R₃独立地为H、单糖或多糖；所述单糖任选地为葡萄糖或鼠李糖；所述多糖任选为直链或支链的二糖至五糖，所述二糖至五糖任选地由葡萄糖和/或鼠李糖组成。

5.根据权利要求4所述的用途，其中，R₁，R₂，R₃独立地选自：

6.根据权利要求4所述的用途，其中，在所述黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物中，以重量比计，所述呋甾烷醇类甾体皂苷和螺甾烷醇类甾体皂苷的含量之和不少于所述黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物的50％。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的用途，其中，所述黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物抑制纤维化标志物α-SMA、COL1A1和COL3A1的表达。

8.根据权利要求1-6中任一项所述的用途，其中，所述黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物为口服制剂，所述口服制剂选自片剂、胶囊、颗粒剂或滴丸。

9.根据权利要求1-6中任一项所述的用途，其中，所述黄山药和/或穿龙薯蓣甾体总皂苷提取物通过以下方法制备得到，所述方法包括：

a、以中药黄山药、穿山龙或新鲜采集的黄山药、穿龙薯蓣为原料，经切片或粉碎后，加水、甲醇、乙醇、正丁醇或其它低脂肪醇中的一种或任意两种或者多种溶剂以任意比例组成的混合溶液为溶媒提取，溶媒量为原料的15～25倍；

b、将a步骤制备的提取液冷却过滤、滤液通过吸附树脂柱、弃去流出液，用水洗至流出液至无色，弃去水洗液；

c、将b步骤的水洗后的吸附树脂柱用乙醇、甲醇、丙酮、50％～90％乙醇、30～80％含水甲醇或60～95％含水丙酮中的一种或多种溶剂洗脱，收集洗脱液，浓缩；

d、将c步骤的浓缩液加60～95％醇醇沉，过滤，收集滤液，浓缩，干燥，即得。