CN117327041B - 一种从枳椇子中一次性分离杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素和二氢槲皮素的方法 - Google Patents

一种从枳椇子中一次性分离杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素和二氢槲皮素的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于分离纯化技术领域，具体涉及一种从枳椇子中分离杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素、二氢槲皮素的方法，包括以下步骤：将枳椇子粉利用乙醇水溶液提取，所得提取液浓缩，得到粗提物；将所述粗提物以氯仿‑甲醇‑水体系的上相溶解，得到样品溶液；将所述样品溶液进行高速逆流色谱分离，收集得到杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素和二氢槲皮素各流分。本发明利用高速逆流色谱，能够从枳椇子中一次性分离杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素、二氢槲皮素，相对现有技术，具有操作简便，效率高，分离量大，样品损失小的优势。另外，本发明实施例的数据表明：本发明提供的方法重现性好，分离的成分纯度高。

Description

一种从枳椇子中一次性分离杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素和二 氢槲皮素的方法
技术领域
本发明属于天然产物分离技术领域，具体涉及一种从枳椇子中一次性分离杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素和二氢槲皮素的方法。
背景技术
枳椇子是鼠李科枳属植物枳棋、北枳棋和毛果枳的成熟种子或具有花序轴的果实。枳棋子性甘，味平、无毒，具有清热利尿，止渴除烦，保肝解酒之功效，民间常作为保肝、酒精毒、治呃逆和小便不利等症。药理学研究表明，黄酮类和三萜类化合物为该属植物的活性成分，具有抗甜味、抑制组胺释放和保肝解酒等作用。
沙美，丁林生，“枳椇子的化学成分研究”、徐芳芳，暨南大学硕士论文“枳椇子的化学成分研究”、吴龙火，张剑，“枳椇子的化学成分研究”等均公开了枳椇子化学成分的分离方法，但是上述方法均反复经过柱层析分离，步骤复杂，分离所需时间长，效率低，且样品损失也大。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于一种从枳椇子中一次性分离杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素和二氢槲皮素的方法，本发明提供的分离方法步骤简单，分离时间短，效率高，且样品损失小。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种从枳椇子中分离杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素和二氢槲皮素的方法，包括以下步骤：
将枳椇子粉利用乙醇水溶液提取，所得提取液浓缩，得到粗提物；
将所述粗提物以氯仿-甲醇-水体系的上相溶解，得到样品溶液；
将所述样品溶液进行高速逆流色谱分离，分别得到杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素和二氢槲皮素；
所述高速逆流色谱分离的固定相为氯仿-甲醇-水体系的上相；
所述高速逆流色谱分离的流动相为氯仿-甲醇-水体系的下相；
所述氯仿-甲醇-水体系中氯仿、甲醇和水的体积比为7:6:3；
所述氯仿-甲醇-水体系的pH值＜7。
优选地，所述乙醇水溶液的体积浓度为50%~95%。
优选地，所述枳椇子粉和乙醇水溶液的用量比为1g：4mL。
优选地，所述枳椇子粉的粒径为80~100目。
优选地，所述提取的温度为50~80℃，提取的次数为2~4次，每次提取的时间为1~4h。
优选地，所述流动相的流速为5~20mL/min。
优选地，所述高速逆流色谱分离的检测器为紫外检测器；检测波长为254nm。
优选地，所述粗提物和固定相用量比为1g：100mL。
本发明提供了一种从枳椇子中一次性分离杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素和二氢槲皮素的方法，包括以下步骤：将枳椇子粉利用乙醇水溶液提取，所得提取液浓缩，得到粗提物；将所述粗提物以氯仿-甲醇-水体系的上相溶解，得到样品溶液；将所述样品溶液进行高速逆流色谱分离，分别得到杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素和二氢槲皮素；所述高速逆流色谱分离的固定相为氯仿-甲醇-水体系的上相；所述高速逆流色谱分离的流动相为氯仿-甲醇-水体系的下相；所述氯仿-甲醇-水体系中氯仿、甲醇和水的体积比为7:6:3；所述氯仿-甲醇-水体系的pH值＜7。本发明利用高速逆流色谱，能够从枳椇子中一次性分离杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素、二氢槲皮素，相对现有技术，具有操作简便，效率高，分离量大，样品损失小的优势。
另外，本发明实施例的数据表明：本发明提供的方法重现性好，分离的成分纯度高。
附图说明
图1为实施例2粗提物高效液相色谱图；
图2为实施例2的高速逆流色谱（HSCCC）图；
图3为实施例2制备的杨梅素高效液相色谱图；
图4为实施例2制备的二氢杨梅素高效液相色谱图；
图5为实施例2制备的槲皮素高效液相色谱图；
图6为实施例2制备的二氢槲皮素高效液相色谱图；
图7为实施例2制备的杨梅素的质谱；
图8为实施例2制备的二氢杨梅素的质谱；
图9为实施例2制备的槲皮素的质谱；
图10为实施例2制备的二氢槲皮素的质谱；
图11为实施例2制备的杨梅素的1H谱；
图12为实施例2制备的二氢杨梅素的1H谱；
图13为实施例2制备的槲皮素的1H谱；
图14为实施例2制备的二氢槲皮素的1H谱；
图15为实施例2制备的杨梅素的13C谱；
图16为实施例2制备的二氢杨梅素的13C谱；
图17为实施例2制备的槲皮素的13C谱；
图18为实施例2制备的二氢槲皮素的13C谱；
图19为对比例1的分离色谱图。
具体实施方式
本发明提供了一种从枳椇子中分离杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素和二氢槲皮素的方法，包括以下步骤：
将枳椇子粉利用乙醇水溶液提取，所得提取液浓缩，得到粗提物；
将所述粗提物以氯仿-甲醇-水体系的上相溶解，得到样品溶液；
将所述样品溶液进行高速逆流色谱分离，分别得到杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素和二氢槲皮素；
所述高速逆流色谱分离的固定相为氯仿-甲醇-水体系的上相；
所述高速逆流色谱分离的流动相为氯仿-甲醇-水体系的下相；
所述氯仿-甲醇-水体系中氯仿、甲醇和水的体积比为7:6:3；
所述氯仿-甲醇-水体系的pH值＜7。
本发明将枳椇子粉利用乙醇水溶液提取，所得提取液浓缩，得到粗提物。
在本发明中，所述枳椇子粉的粒径优选为80~100目，若不在上述范围内，则将枳椇子粉干燥后碎至上述粒径。
在本发明中，所述乙醇水溶液的体积浓度优选为50%~95%，更优选为70%。所述枳椇子粉和乙醇水溶液的用量比优选为1g：4mL。
在本发明中，所述提取优选为减压回流提取；所述提取的温度优选为50~80℃，更优选70℃；所述提取的次数优选为2~4次，每次提取的时间优选为1~4h，更优选为2~3h。
得到粗提物后，本发明将粗提物以氯仿-甲醇-水体系的上相溶解，得到样品溶液。
在本发明中，所述粗提物和氯仿-甲醇-水体系的上相的用量比优选为200mg：20mL。
得到样品溶液后，本发明将所述样品溶液进行高速逆流色谱分离和检测，根据检测结果，收集得到杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素和二氢槲皮素各流分。
在本发明中，所述高速逆流色谱分离的固定相为氯仿-甲醇-水体系的上相；所述高速逆流色谱分离的流动相为氯仿-甲醇-水体系的下相；所述氯仿-甲醇-水体系中氯仿、甲醇和水的体积比为7:6:3；所述氯仿-甲醇-水体系的pH值＜7，优选为3；所述氯仿-甲醇-水体系的pH值优选由盐酸调节得到。
在本发明中，所述氯仿-甲醇-水体系的上相、下相的获取，优选包括以下步骤：
将氯仿、甲醇和水混合，用盐酸调节pH值至＜7后，超声，得到氯仿-甲醇-水体系的上相、下相。
在本发明中，所述高速逆流色谱分离的步骤优选为：将氯仿-甲醇-水体系的上相通过恒流泵泵入高速逆流色谱主机的多层螺旋柱内作为固定相，调节螺旋管转速为500~1000r/min，然后将下相以流速5~20mL/min在水浴温度为25℃条件下泵入，待溶剂体系平衡后，将样品溶液注入主机进样，并进行UV检测，根据对应的色谱峰位置收集馏出液。
在本发明中，所述高速逆流色谱分离的检测器优选为紫外检测器；检测波长优选为254nm。本发明中，产物的收集时间段优选具体为35~140min。在本发明中，所述高速逆流色谱分离时，检测器在线检测，根据检测结果，分别收集杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素和二氢槲皮素各流分即可。
下面将结合本发明中的实施例，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明对不同比例下的氯仿-甲-水体系的K值进行了测定，计算方法为K=As/Am(As为溶质在固定相中的峰面积，Am为溶质在流动相中的峰面积)，结果如表1所示，由表1可知：当氯仿：甲醇：水（5:6:5 v/v/v）时，K1值可达26.80，K4为2.30，当氯仿：甲醇：水（6:6:4v/v/v）时，K值有所降低，K1为13.70，K4为2.02，而0.5<K<2.0时，可以在合适的时间内，得到分离度较好的峰形，同时兼顾分离因子和溶剂体系的保留率，因此选取氯仿：甲醇：水（7:6:3 v/v/v，盐酸调PH为酸性）作为分离杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素、二氢槲皮素的最佳HSCCC溶剂体系。
表1 氯仿-甲-水体系的K值
氯仿-甲醇-水体系 体积比 K1 K2 K3 K4 分离因子（K3/K2） 保留率（%）
氯仿：甲醇：水 5:6:5 26.80 6.21 11.48 2.30 1.85 67.00
氯仿：甲醇：水 6:6:4 13.70 4.29 6.91 2.02 1.61 65.67
氯仿：甲醇：水 7:6:3 6.45 2.60 3.99 1.57 1.53 61.30
氯仿：丁醇：甲醇：水 7:1:6:3 2.83 1.29 1.59 0.75 1.23 14.67
氯仿：丁醇：甲醇：水 7:2:6:3 1.75 0.92 1.04 0.52 1.12 0.00
实施例2
将枳椇子干燥、粉碎至粒径为100目，得到枳椇子粉末。
将氯仿、甲醇和水混合，用盐酸调节pH至3后，超声，得到氯仿-甲醇-水体系的上相、下相；氯仿、甲醇和水的体积比为7:6:3。
将1000 g枳椇子粉末用4000mL体积浓度为70%的乙醇水溶液在70℃减压回流提取3次，每次2h，将3次所得提取液合并后用旋转蒸发仪进行浓缩，得到粗提物。将所得0.2g粗提物用20mL氯仿-甲醇-水体系的上相（固定相）溶解后进行高速逆流色谱分离。
高速逆流色谱分离条件如下：先将氯仿-甲醇-水体系的上相通过恒流泵入高速逆流色谱主机的多层螺旋柱内作为固定相，然后调节转速为800r/min，将下相（流动相）泵入，待溶剂体系平衡后，将样品溶液注入主机，并进行UV检测（检测波长254nm），收集35~140min的馏出液。
本发明对实施例2提取得到的粗提物进行了HPLC检测，高效液相色谱图如图1所示，其部分峰数据如表2所示，从图1和表2可知：二氢杨梅素（6.052min）、二氢槲皮素（6.743min）、杨梅素（7.090min）、槲皮素（7.843min）。
表2 枳椇子粗提物的高效液相色谱的部分峰的数据
N 时间 峰面积 峰高 峰宽 对称因子 峰面积 %
3 3.914 36.1 6.9 0.0852 0.929 0.686
4 4.214 51.5 8.8 0.0822 1.98 0.979
5 4.329 8.2 2.2 0.0572 1.782 0.155
6 4.51 45.9 6.1 0.1041 2.048 0.873
7 4.728 23.8 4.2 0.0848 1.281 0.452
8 4.988 145.3 15.2 0.1331 1.417 2.759
9 5.177 33.6 8.6 0.0618 1.118 0.639
10 5.308 15.1 4.8 0.051 1.05 0.286
11 5.492 30.5 6.1 0.0724 1.62 0.579
12 5.584 28.2 5.3 0.076 0.61 0.535
13 5.741 51.6 14.1 0.0587 0.778 0.980
14 5.843 69.4 18.1 0.0607 1.104 1.319
15 6.052 2243 478.7 0.0707 0.771 42.603
16 6.279 226 44.6 0.0731 0.564 4.293
17 6.487 191 22 0.1174 0.505 3.628
18 6.743 359.5 78 0.0697 0.683 6.828
19 7.09 1193.4 293.5 0.0614 0.811 22.666
20 7.336 28.1 4 0.1009 0.736 0.533
21 7.55 11.7 2.4 0.077 0.76 0.222
22 7.843 243.9 54.9 0.0679 0.754 4.633
23 8.599 19.1 3.9 0.0746 0.913 0.363
24 8.693 15.9 2.4 0.1041 0.366 0.303
本发明对实施例2分离得到的化合物进行了HPLC纯度检测，检测条件为：色谱柱：Agilent1260 ZORBAX SB-C18柱（5um，4.6mm*150，I.D.），DAD检测器254nm，流速1.0mL/min，流动相采用乙腈（B）-0.1%甲酸水（A）,梯度为0~18min：0%B-100%B。杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素、二氢槲皮素的高效液相色谱图如图3~6所示，其峰数据如表3~6所示。
表3 杨梅素的高效液相色谱图的峰数据
N 时间 峰面积 峰高 峰宽 对称因子 峰面积 %
1 5.18 24.9 2.9 0.1167 2.762 1.546
2 5.323 7.8 1.6 0.0722 0.477 0.485
3 5.725 6.6 1.1 0.09 1.414 0.409
4 5.959 32.8 7.1 0.068 0.611 2.042
5 6.394 22.6 4.4 0.0745 2.03 1.405
6 6.559 18.6 3.8 0.0728 0.807 1.159
7 6.933 1495.2 303.5 0.0735 0.956 92.953
表4 二氢杨梅素的高效液相色谱图的峰数据
N 时间 峰面积 峰高 峰宽 对称因子 峰面积 %
1 5.197 8.9 1.1 0.1144 1.333 0.150
2 5.907 5918.5 932.3 0.0881 1.519 99.850
表5 槲皮素的高效液相色谱图的峰数据
N 时间 峰面积 峰高 峰宽 对称因子 峰面积 %
1 4.766 31.3 5.7 0.0825 2.247 0.517
2 5.007 182.6 19.4 0.1256 0.917 3.017
3 5.381 12.2 1.6 0.1184 0.898 0.201
4 5.793 43.5 8.2 0.0882 1.365 0.718
5 6.096 14 2.9 0.0747 1.229 0.231
6 6.389 90 17.4 0.0763 1.364 1.487
7 6.541 11.5 2.5 0.0733 0.612 0.190
8 7.203 12.7 2.6 0.0754 1.066 0.210
9 7.698 5655.7 1311.3 0.0663 0.89 93.429
表6 二氢槲皮素的高效液相色谱图的峰数据
N 时间 峰面积 峰高 峰宽 对称因子 峰面积 %
1 4.294 7 1.2 0.08 2.217 0.086
2 4.828 8.4 1.4 0.0957 1.097 0.103
3 5.893 9.3 1.6 0.08 0.296 0.114
4 6.575 8113.4 1414.2 0.0969 1.292 99.612
5 7.699 7 1.5 0.0691 0.676 0.086
从表3和图3可知：杨梅素的纯度为92.953%，其保留时间为6.933min。
从表4和图4可知：二氢杨梅素的纯度为99.850%，其保留时间为5.907min。
从表5和图5可知：槲皮素的纯度为93.429%，其保留时间为7.698min。
从表6和图6可知：二氢槲皮素的纯度为99.612%，其保留时间为6.575min。
图7为实施例2制备的杨梅素的质谱，从图7可知： [M-H]-=317.0。
图8为实施例2制备的二氢杨梅素的质谱，从图8可知：[M-H]-=319.0
图9为实施例2制备的槲皮素的质谱，从图9可知：[M-H]-=301.0。
图10为实施例2制备的二氢槲皮素的质谱，从图10可知：[M-H]-=303.0。
图11为实施例2制备的杨梅素的1H谱，从图11可知：杨梅素的氢谱信息为：1H-NMR(CD3OD) δ: 7.33 (2H, s, H-2' and H-6'), 6.37 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-8), 6.17(1H, d, J = 1.8 Hz, H-6)。
图12为实施例2制备的二氢杨梅素的1H谱；从图12可知：二氢杨梅素的氢谱信息为：1H-NMR (CD3OD) δ: 6.52 (2H, s, H-2' and H-6'), 5. 91 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-8), 5. 88 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-6), 4. 83 (1H, d, J = 11.5 Hz, H-2), 4.45(1H, d, J = 11.5 Hz, H-3)。
图13为实施例2制备的槲皮素的1H谱；从图13可知：槲皮素的氢谱信息为：1H-NMR(CD3OD) δ: 7.73 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-2'), 7.62 (1H, dd, J = 8.4, 1.8 Hz, H-6'), 6.89 (1H, d, J = 8.4 Hz, H-5'), 6.38 (1H, d, J = 1.8 Hz, H-8), 6.18 (1H,d, J = 1.8 Hz, H-6)。
图14为实施例2制备的二氢槲皮素的1H谱，从图14可知二氢槲皮素的氢谱信息为：1H-NMR (CD3OD) δ: 6.96 ( 1H, d, J = 1.9 Hz, H-2'), 6.84 (1H, dd, J = 8.1, 1.9Hz, H-6'), 6. 79 (1H, d, J = 8.1 Hz, H-5'), 5. 91 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-8),5. 87 (1H, d, J = 2.1 Hz, H-6), 4. 90 (1H, d, J = 11.5 Hz, H-2), 4. 50 (1H,d, J = 11.5 Hz, H-3)。
图15为实施例2制备的杨梅素的13C谱，从图15可知：13C-NMR (CD3OD) δ: 177.3(C-4), 165.6 (C-7), 162.5 (C-5), 158.2 (C-9), 148.0 (C-2), 146.7 (C-4'),137.4 (C-3' and C-5'), 136.9 (C-3), 123.1 (C-1'), 108.5 (C-2' and C-6'),104.5 (C-10), 99.2 (C-6), 94.3 (C-8)。
图16为实施例2制备的二氢杨梅素的13C谱，从图16可知：二氢杨梅素的碳谱信息为：13C-NMR (CD3OD) δ: 198.4 (C-4), 168.6 (C-7), 165.2 (C-5), 164.4 (C-9),146.8 (C-3' and C-5'), 134.9 (C-4'), 128.9 (C-1'), 108.0 (C-2' and C-6'),101.8 (C-10), 97.3 (C-6), 96.2 (C-8), 85.3 (C-2), 73.7 (C-3)。
图17为实施例2制备的槲皮素的13C谱，从图17可知：槲皮素的碳谱信息为13C-NMR(CD3OD) δ: 177.3 (C-4), 165.6 (C-7), 162.5 (C-5), 158.2 (C-9), 148.8 (C-4′),148.0 (C-3′), 146.2 (C-2), 137.2 (C-3), 124.1 (C-1′), 121.7 (C-2′), 116.2 (C-5′), 116.0 (C-6′), 104.5 (C-10), 99.2 (C-6), 94.4 (C-8)。
图18为实施例2制备的二氢槲皮素的13C谱，从图18可知：二氢槲皮素的碳谱信息为：13C-NMR (CD3OD) δ: 198.4 (C-4), 168.6 (C-7), 165.2 (C-5), 164.4 (C-9),147.1 (C-4′), 146.3 (C-3′), 129.8 (C-1′), 120.9 (C-6′), 116.1 (C-5′), 115.9(C-2′), 101.8 (C-10), 85.1 (C-2), 73.6 (C-3)。
对比例1
与实施例1的区别仅仅在于：氯仿-甲醇-水体系不加盐酸，分离结果见图19。
从对比例的实验数据可知，当替换氯仿-甲醇-水体系的pH后，并不能一次性分离杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素和二氢槲皮素。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (3)

1.一种从枳椇子中一次性分离杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素和二氢槲皮素的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将枳椇子粉利用乙醇水溶液提取，所得提取液浓缩，得到粗提物；
将所述粗提物以氯仿-甲醇-水体系的上相溶解，得到样品溶液；
将所述样品溶液进行高速逆流色谱分离，分别得到杨梅素、二氢杨梅素、槲皮素和二氢槲皮素；
所述高速逆流色谱分离的固定相为氯仿-甲醇-水体系的上相；
所述高速逆流色谱分离的流动相为氯仿-甲醇-水体系的下相；
所述氯仿-甲醇-水体系中氯仿、甲醇和水的体积比为 7:6:3；
所述氯仿-甲醇-水体系的 pH 值＜7；
所述乙醇水溶液的体积浓度为50%~95%；所述枳椇子粉和乙醇水溶液的用量比为 1g：4mL；
所述提取的温度为50~80℃，提取的次数为 2~4 次，每次提取的时间为 1~4h；
所述流动相的流速为5~20mL/min；
所述粗提物和固定相用量比为 1g：100mL。
2.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，所述枳椇子粉的粒径为80~100 目。
3.根据权利要求 1 所述的方法，其特征在于，所述高速逆流色谱分离的检测器为紫外检测器；检测波长为 254nm。
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