CN101717384B - 丹参注射液中的化合物及其在心血管疾病治疗中的应用 - Google Patents

丹参注射液中的化合物及其在心血管疾病治疗中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从丹参中提取的新的酚酸类化合物丹酚酸M，该新化合物也可以从丹参注射液中提取，发明同时公开了分别从丹参和丹参注射液中该新化合物的提取方法。药理研究表明丹酚酸M具有心肌保护和抗氧化活性，因而具有进一步研制开发成有效的治疗心血管疾病药物的前景，且可以用于丹参注射液质量控制标准中。

Description

丹参注射液中的化合物及其在心血管疾病治疗中的应用
技术领域
本发明涉及一种从丹参或丹参注射液中提取的新的酚酸类化合物，本发明还涉及这一新化合物的制备方法及其在制备治疗心血管疾病药物和丹参注射液质量控制中的用途。
背景技术
丹参注射液是中药材丹参经过现代工艺提取加工而成，用于心脑血管疾病预防和治疗，主要应用于活血化瘀，通脉养心，冠心病胸闷和心绞痛，临床应用已有20余年，其中的活性成分主要为以丹参素、丹酚酸B为主的酚酸类化合物，目前尚有大量有效成分未被发现。
国内已有66个厂家拥有丹参注射液的药品批准文号，制备方法均参照部颁标准WS3-B-3766-98-2004，其含测指标和鉴别指标均只有原儿茶醛一种有效成分，显然不能满足提高中药注射液治疗标准的要求。
发明内容
为了全面提高丹参注射剂的安全性、有效性和质量可控性，深入研究其活性物质基础，经过大量的实验研究，利用现代分离提取技术和结构确定手段，在丹参制剂中发现了一种新的丹酚酸类化合物，药理研究表明化合物有很好的心肌保护活性和明显的抗氧化活性。由于该新化合物与已发现的丹酚酸A、丹酚酸B等酚酸类结构相近，故将该化合物命名为丹酚酸M，其结构式为式A所示：
Figure G2009101548417D00011
式A
丹酚酸M化学名称为：
3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2-(3-(3-(3，4-dihydroxyphenyl)-2，7-dihydroxy-2，3-dihydrobenzofuran-4-yl)acryloyloxy)propanoic acid；
(3-(3，4-二羟基苯基)-2-(3-(3-(3，4-二羟基苯基(-2，7-二羟基-2，3-二氢苯并呋喃-4-)丙烯酰氧基)-丙酸。
丹酚酸M：淡黄色粉末，高分辨质谱HR-ESI-MS给出分子量为510.1053，分子式为C26H22O11
UV吸收光谱λmax(MeOH)nm(logε)：324(3.2)，290(3.16)，旋光[α]25 D＝8(MeOH，1mg/ml)；
红外光谱IR(KBr)，Vmax/cm-1：3387，1696，1612，1518，1448，1265，1172，1072。
ESI-MS显示准分子离子峰为m/z 509[M-H]-，表明该化合物分子量为510，多级质谱碎片离子峰主要有m/z 311[M-H-198]-，表明该化合物含有(3，4-二羟基)乳酸(丹参素)结构片段；
核磁共振氢谱显示共有10个不饱和质子信号和5个饱和质子信号，其中δ7.53和δ6.20(J＝16.0Hz)为一对双键质子信号。三个芳香质子δ6.45(bs)、δ6.87(d，J＝8.0Hz)、δ6.50(m，J＝8.0Hz)和另三个芳香质子δ6.70(bs)、δ6.73(d，J＝8.0Hz)以及δ6.49(dd，J＝8.0，1.5Hz)分别属于两个ABX耦合系统，两个芳香质子信号δ7.15和δ6.82(J＝8.0Hz)属于AB偶合系统。信号δ3.05(dd，J＝14.5，4.0Hz)、δ2.94(dd，J＝14.5，4.0Hz)以及δ5.09(dd，J＝4.0Hz)构成OCHCH2片段。信号δ4.38(bs)和δ5.65(bs)构成OCHCH片段，其中，信号δ5.65对应的碳信号为δ108.3，推测该碳信号为半缩醛或缩醛。利用DMSO-d6作为核磁共振溶剂，观察到羟基质子信号δ7.47(bs)与该碳上质子信号δ5.65的1H-1H COSY相关，证实了为半缩醛结构。
利用2D-NMR(1H-1H COSY、HMQC、HMBC)，鉴定了该化合物的平面结构，并归属了所有碳氢信号。查阅了国内外相关文献后确定该化合物为未见文献报道的新骨架化合物。
氢谱和碳谱数据归属如下：
丹酚酸M氢谱和碳谱数据(CD3OD)，单位δ：ppm
本发明提供的该化合物的制备方法为：
丹参药材加水煎煮，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩。乙醇沉淀，滤过，滤液回收乙醇，蒸馏水稀释，过制备液相分离、纯化，冷冻干燥后得到淡黄色粉末，即为该化合物。
制备液相分离条件：流动相由0.05％甲酸-水(A)和乙腈(B)组成，梯度洗脱程序为：0～28min，A-B(82∶18，v/v)；28～60min，A-B(82∶18～65∶35，v/v)，流速4mL/min，分离用半制备色谱柱为Zorbax SB-C18(9.4mm×25cm，5μm)，保留时间tR＝22.1min。
丹酚酸M也可以直接在根据部颁标准制备的丹参注射液中分离得到，分离条件可参考上述条件。
ZORBAX StableBond(SB)反相HPLC系列色谱柱在低pH下具有超常稳定性和重现性。其独特的单官能团硅烷空间保护键合相在低pH下不被水解，还可以耐受很高的温度，最高900C。其中的SB-C18半制备柱(9.4mm×25cm)适用于低毫克级物质的制备，根据待分离物质的量，可是选择合适的C18半制备型和制备型色谱柱。
发明效果：
本发明提供了一种新的酚酸类化合物丹酚酸M，由于其化学结构是新的且具有心肌保护和抗氧化活性，因而具有进一步研制开发成有效的治疗心血管疾病药物的前景，且可以用于丹参注射液质量控制标准中。
说明书附图：
丹参注射液的LC-MS指纹图谱
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但不以此限制本发明。
实施例1.丹酚酸M的制备方法
以丹参药材为原料：取丹参1500g，加水8倍量煎煮三次，第一次2小时，第二、三次各1.5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至750ml。加乙醇沉淀二次，第一次使含醇量为75％，第二次使含醇量为85％，每次均冷藏放置后滤过，滤液回收乙醇，并浓缩至约250ml，加蒸馏水至400ml，混匀，静置，滤过。使用半制备色谱柱为Zorbax SB-C18(9.4mm×25cm，5μm)分离、纯化，冷冻干燥后得到淡黄色粉末，即获得该化合物50.1mg。
流动相由0.05％甲酸-水(A)和乙腈(B)组成，梯度洗脱程序为：0～28min，A-B(82∶18，v/v)；28～60min，A-B(82∶18～65∶35，v/v)，流速4ml/min，分离用，保留时间tR＝22.1min。
实施例2.丹酚酸M的制备方法
以丹参药材为原料：取丹参1500g，加6倍量水煎煮三次，每次1.5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至750ml。加乙醇沉淀二次，各使含醇量为75％，静置后滤过，滤液回收乙醇，并浓缩至约250ml浸膏。浸膏蒸馏水稀释，静置，滤过。使用半制备色谱柱分离、纯化，冷冻干燥后得到淡黄色粉末，即获得该化合物48.0mg。半制备色谱柱分离、纯化同实施例1。
实施例3.丹酚酸M的制备方法
以丹参药材为原料：取丹参1500g，加10倍量水煎煮三次，每次2.0小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至750ml。加乙醇沉淀二次，各使含醇量为85％，静置后滤过，滤液回收乙醇，并浓缩至约250ml浸膏。浸膏蒸馏水稀释，静置，滤过。使用半制备色谱柱分离、纯化，冷冻干燥后得到淡黄色粉末，即获得该化合物44.1mg。半制备色谱柱分离、纯化同实施例1。
实施例4.丹酚酸M的制备方法
以丹参药材为原料：取丹参1500g，加12倍量水煎煮二次，每次2.0小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至700ml。加乙醇沉淀二次，各使含醇量为85％，静置后滤过，滤液回收乙醇，并浓缩至约250ml浸膏。浸膏蒸馏水稀释，静置，滤过。使用半制备色谱柱分离、纯化，冷冻干燥后得到淡黄色粉末，即获得该化合物37.0mg。半制备色谱柱分离、纯化同实施例1。
实施例5.丹酚酸M的制备方法
以1200ml丹参注射液制剂为原料：通过半制备ODS-HPLC分离、纯化，获得该化合物。分离条件同实施例1，即获得该化合物50.1mg
实施例6.丹酚酸M的制备方法
以1200ml丹参注射液制剂为原料：通过半制备ODS-HPLC分离、纯化，获得该化合物。使用半制备色谱柱为Zorbax SB-C18(9.4mm×15cm，5μm)，流速2ml/min，其他分离条件同实施例1，仅获得该化合物15.3mg。
实施例7.丹酚酸M的制备方法
以1200ml丹参注射液制剂为原料：通过半制备ODS-HPLC分离、纯化，获得该化合物。使用半制备色谱柱为SB-C18(21.2mm×250mm，10μm)，流速10ml/min，流动相为0.1％甲酸-水(A)和甲醇(B)，洗脱程序为0，55％B；45min，65％B；tR＝24.1min，仅获得该化合物6.3mg。
实施例5至7的丹参注射液由正大青春宝制药有限公司提供，属于按照部颁标准WS3-B-3766-98-2004制备的上市产品。
实施例8.活性测定
MTT法：体外培养H9C2心肌细胞种于96孔板上。种板24h后，加入该化合物，给药浓度为100、40、16、6.4、2.56、1.28uM。每个浓度设定三复孔，平行两板，阳性药为100uM的维生素C。加药12h后，洗去培养液，PBS洗涤后加入600uM双氧水损伤3h。损伤结束后，吸去培养液，PBS洗涤后加入MTT试剂，孵育4小时，吸去上清，加入DMSO溶解，分光光度法(550nm)测定细胞存活率。根据模型组计算药物的保护率，采用SPSS软件计算得到该化合物保护双氧水损伤心肌细胞的半数有效剂量(EC50)为23uM。
另外DPPH法(1，1-二苯基苦基苯肼法)测试该化合物的抗氧化作用，结果显示其EC50为52uM。
实施例9丹参注射液的指纹图谱构建方法
仪器与试剂：Agilent1100型高效液相色谱仪(德国Agilent公司)，配四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱、DAD检测器、ChemStation工作站控制系统；Agilent1100型质谱检测器与HPLC联用。分离用色谱柱为Agilent Zorbax SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)。流动相为乙腈(德国Meck公司，色谱纯)和Milli-Q超纯水(Millipore公司，美国)；甲酸(色谱纯，美国TEDIA公司)。各批次丹参注射液由正大青春宝制药有限公司提供，均为市售产品。
样品预处理。丹参注射液50μL，重蒸水稀释至200μl，HPLC进样量20μl。
色谱条件。色谱柱Agilent Zorbax SB-C18(4.6mm×250mm，5μm)，流速0.5mL/min，柱温30℃；流动相为0.05％甲酸水(A相)和0.05％甲酸乙腈(B相)，采用梯度洗脱：0～10min，10％B～20％B，10min～30min，20％B～47％B，30min～50min，47％B～100％B，即：0→10min→30min→50min，B：10％→20％→47％→100％；DAD检测器(190～400nm)。质谱检测器，ESI电离源，负离子，采用全扫描模式(TIC mode)，扫描范围m/z 100～1000，电力电压150V，干燥氮气流速9.5L/min，干燥气体温度350℃，毛细管电压3000V。
根据上述条件获得丹参注射液的LC-MS指纹图谱，其特征峰包括了目前已发现的丹参注射液中的大部分有效成分，包括丹参素、原儿茶酸、原儿茶醛、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸A、丹酚酸B等，还包括了本发明中在丹参注射液中新发现的丹酚酸M，使丹参注射液质量控制技术有上了一个新的台阶。该指纹图谱中各特征峰表示如下：
峰号   保留时间tR(min) [M-H]m/z 有效成分
  1   10.2   197   丹参素
  2   12.3   153   原儿茶酸
  3   13.2   181   4-羟基苯基乳酸
  4   16.3   137   原儿茶醛
  5   17.0   509   丹酚酸M
  6   18.2   179   咖啡酸
  7   19.5   357   原紫草酸
  8   21.6   537   丹酚酸H/I
  9   22.1   537   丹酚酸H/I
  10   23.3   417   丹酚酸D
  11   24.3   717   丹酚酸E
  12   25.5   359   迷迭香酸
  13   26.7   717   丹酚酸B
  14   27.4   717   iso-丹酚酸B
  15   28.4   493   丹酚酸A
  16   30.0   491   iso-丹酚酸C
  18   31.4   537   iso-紫草酸
  19   31.8   491   丹酚酸C
  23   41.5   313   15，16-二氢丹参二醇B/C

Claims (6)

1.一种酚酸类化合物丹酚酸M，其结构式为：
Figure FSB00000565128500011
。
2.一种制备权利要求1所述的丹酚酸M的方法，其特征在于：取丹参注射液，过半制备色谱柱分离、纯化，冷冻干燥后得到淡黄色粉末，即获得该化合物；
制备液相分离条件为：流动相由0.05％甲酸-水和乙腈组成，梯度洗脱程序为：0→28min→60min：乙腈：18％→18％→35％，流速4ml/min，分离用半制备色谱柱为Zorbax SB-C189.4mm×25cm 5μm，保留时间tR＝22.1min。
3.一种制备权利要求1所述的丹酚酸M的方法，其特征在于：丹参药材加6-8倍量水煎煮二～三次，每次1.5～2小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩，乙醇沉淀二次，每次含醇量在75％～85％，滤过，滤液回收乙醇，蒸馏水稀释，静置过滤，过制备液相分离、纯化，冷冻干燥后得到淡黄色粉末，即为该化合物；
制备液相分离条件为：流动相由0.05％甲酸-水和乙腈组成，梯度洗脱程序为：0→28min→60min，乙腈：18％→18％→35％，流速4ml/min，分离用半制备色谱柱为Zorbax SB-C189.4mm×25cm 5μm，保留时间tR＝22.1min。
4.权利要求3所述的一种制备丹酚酸M的方法，其特征在于：取丹参1500g，加水8倍量煎煮三次，第一次2小时，第二、三次各1.5小时，合并煎液，滤过，滤液减压浓缩至750ml；加乙醇沉淀二次，第一次使含醇量为75％，第二次使含醇量为85％，每次均冷藏放置后滤过，滤液回收乙醇，并浓缩至约250ml， 加蒸馏水稀释至400ml，混匀，静置，滤过；使用半制备色谱柱分离、纯化，冷冻干燥后得到淡黄色粉末，即获得该化合物；
制备液相分离条件为：流动相由0.05％甲酸-水和乙腈组成，梯度洗脱程序为：0→28min→60min：乙腈：18％→18％→35％，流速4mL/min，分离用半制备色谱柱为Zorbax SB-C189.4mm×25cm 5μm，保留时间tR＝22.1min。
5.权利要求1所述的丹酚酸M在制备治疗心血管疾病药物中的应用。
6.一种丹参注射液指纹图谱构建方法，其特征是：
指纹图谱中包含权利要求1所述的丹酚酸M的特征峰，丹酚酸M的保留时间为17.0min；
丹参注射液50μL，重蒸水稀释至200μL，HPLC进样量20μL；
色谱条件：色谱柱Agilent Zorbax SB-C18 4.6mm×250mm 5μm，流速0.5ml/min，柱温30℃；
流动相为0.05％甲酸-水和0.05％甲酸-乙腈，采用梯度洗脱：0→10min→30min→50min，0.05％甲酸-乙腈：10％→20％→47％→100％；DAD检测器，检测波长190～400nm；
质谱检测器，ESI电离源，负离子，采用全扫描模式，扫描范围m/z 100～1000，电力电压150V，干燥氮气流速9.5L/min，干燥气体温度350℃，毛细管电压3000V。 
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