CN103665090A - 枸骨皂苷化合物、其制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物化学领域，特别涉及一种枸骨皂苷化合物、其制备方法及应用。该化合物19α,23-二羟基-乌苏酸-3β-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷具有抗氧化活性，对H₂O₂诱导的大鼠心肌细胞损伤或冠脉结扎所致大鼠急性心肌缺血损伤具有一定的保护作用。

Description

枸骨皂苷化合物、其制备方法及应用

技术领域

本发明涉及药物化学领域，特别涉及一种枸骨皂苷化合物、其制备方法及应用。

背景技术

枸骨(Ilex cornuta Lindl.et Paxt.)系冬青科(Aquifoliaceae)冬青属(Ilex)植物，常绿灌木或乔木，主要分布于我国长江中下游地区，其根、树皮、叶和果实均可入药，是中药功劳叶的基原植物，其叶既为常用中药，也为苦丁茶的主要来源之一【Trend in Food Science and Technology,17(6),313–323】。枸骨叶始载于《本草拾遗》，具有清热养阴，补肝益肾，祛风湿等功效，用于肺痨咳嗽，劳伤失血等【中国医药科技出版社,1996:1422】。枸骨叶味苦、微涩、性寒，有清热解毒、止渴生津、抗菌消炎和防治高血压等多种功效有散风热、清头目、解烦闷、活血脉的功能。现代药理学研究表明枸骨有降血脂、抗菌、抗生育等功效。

目前，国内外学者已从枸骨中分离得到三萜及其皂苷类、黄酮及其苷类、多酚类及其衍生物、脂肪酸类等化合物，其中三萜及其皂苷是枸骨中存在的主要类型化合物。枸骨的研究目前主要集中在叶，未见枸骨茎和枸骨根化学成分和现代药理作用的文献报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种枸骨皂苷化合物、其制备方法及应用。该化合物19α,23-二羟基-乌苏酸-3β-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷具有抗氧化活性，对H₂O₂诱导的大鼠心肌细胞损伤或冠脉结扎所致大鼠急性心肌缺血损伤具有一定的保护作用。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种结构如式Ⅰ所示化合物，

式Ⅰ。

本发明还提供了一种如式Ⅰ所示化合物的提取方法，包括如下步骤：

步骤1：取枸骨根或枸骨茎粉碎，与乙醇水溶液混合浸泡后，加热回流，过滤收集滤液经减压浓缩，获得流浸膏；

步骤2：取所述流浸膏离心，收集上清液经大孔树脂柱，分别用水、30%乙醇、60%乙醇和90%乙醇洗脱，收集90%乙醇的洗脱组分；

步骤3：取所述90%乙醇的洗脱组分经减压硅胶柱，采用氯仿-甲醇系统梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为80:20的洗脱组分，再经中压反相ODS柱，采用甲醇-水系统梯度洗脱，经高效液相分析，收集保留时间为25.1-26.9min的组分，再经半制备高效液相纯化，收集73.2～73.3min的组分，即得；

所述高效液相的流动相为甲醇:水→70:30(v/v)

所述半制备高效液相的流动相为甲醇:水→68:32(v/v)。

在本发明的一些实施例中，步骤2中所述大孔树脂柱为D101型大孔树脂柱。

在本发明的一些实施例中，步骤2中所述半制备高效液相的流动相的流速为2mL/min。

在本发明的一些实施例中，步骤2中所述高效液相的流动相的流速为1mL/min。

在本发明的一些实施例中，步骤1中所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分数为40～70%。

在本发明的一些实施例中，以g/mL计，步骤1中所述枸骨茎与所述乙醇水溶液的质量体积比为1:5～15。

在本发明的一些实施例中，步骤1中所述加热回流的温度为60～80℃，所述加热回流的时间为2.0～3.0h。

在本发明的另一些实施例中，所述步骤1具体为：

步骤1-1：取枸骨茎粉碎，与5～15倍质量的乙醇水溶液混合浸泡后，于60～80℃加热回流2h，过滤收集第一滤液和第一滤渣；

步骤1-2：取所述滤渣与5～15倍质量的乙醇水溶液混合浸泡后，于60～80℃加热回流2h，过滤收集第二滤液和第二滤渣；

步骤1-3：重复步骤1-2；重复次数至少为0次；

合并所述第一滤液、所述第二滤液及步骤1-3中的滤液，经减压浓缩，获得流浸膏。

在本发明的一些实施例中，所述中压反相ODS柱采用BAW系统，Rf值为0.40～0.60。

本发明还提供了结构如式Ⅰ所示化合物在制备抗氧化剂中的应用

式Ⅰ。

本发明还提供了结构如式Ⅰ所示化合物在制备治疗心肌细胞损伤的药物中的应用，

式Ⅰ。

在本发明的一些实施例中，所述心肌细胞损伤为H₂O₂诱导的心肌细胞缺氧或冠脉结扎所致大鼠急性心肌缺血损伤。

本发明首次对枸骨茎或枸骨根的化学成分进行了系统研究，从枸骨茎或枸骨根的乙醇提取物中，利用大孔树脂、中压制备液相色谱、开放硅胶柱色谱、葡聚糖凝胶柱色谱、动态轴向柱色谱、半制备高效液相色谱等现代分离技术分离得到一种皂苷化合物，通过波谱分析和化学方法鉴定了其结构，进一步的药理实验表明该化合物具有抗氧化活性。进一步的药理实验表明本发明提取得到的化合物19α,23-二羟基-乌苏酸-3β-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷对H₂O₂诱导的大鼠心肌细胞损伤具有一定的保护作用。

附图说明

图1示实施例1提取得到的化合物19α,23-二羟基-乌苏酸-3β-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的高分辨质谱；

图2示实施例1提取得到的化合物19α,23-二羟基-乌苏酸-3β-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的核磁共振氢谱图；

图3示实施例1提取得到的化合物19α,23-二羟基-乌苏酸-3β-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的核磁共振碳谱图；

图4示实施例1提取得到的化合物19α,23-二羟基-乌苏酸-3β-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的HSQC图；

图5示实施例1提取得到的化合物19α,23-二羟基-乌苏酸-3β-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的HMBC图；

图6示实施例1提取得到的化合物19α,23-二羟基-乌苏酸-3β-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的H-H COSY图；

图7示实施例1提取得到的化合物19α,23-二羟基-乌苏酸-3β-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的NOESY图。

具体实施方式

本发明公开了一种枸骨皂苷化合物、其制备方法及应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明提供的一种枸骨皂苷化合物、其制备方法及应用中所用原料及试剂均可由市场购得；其中核磁共振仪500Hz(Varian Inc.,Palo Alto,CA,美国)；旋光仪241(PerkinElmer Inc.,Waltham,MA,美国)；高分辨质谱Q-TOF2（英国Micromass公司）；电子天平（梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司）；大孔吸附树脂（D101，安徽辽源新材料有限公司）；中压制备液相色谱（Büchi色谱系统），C-650泵，中压柱(460mm×26mm i.d.,Büchi Corp.,Flawil,Swiss)；半制备高效液相色谱仪（LC—20AT，SPD—20A，日本岛津公司）；C18半制备色谱柱（250mm×10mm，5μm，美国Kromsil公司）；旋转蒸发仪（东京理化器械独资工厂）；化学试剂（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；薄层色谱硅胶板（HSGF254，烟台市芝罘黄务硅胶开发试验厂出品）；各种柱色谱用硅胶均为青岛海洋化工厂出品。枸骨根或茎于2011年4月采自安徽六安，由苏州大学药学院李笑然教授鉴定为枸骨(No.04-21-01-11)。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1化合物的提取分离

干燥的枸骨茎用粉碎机粉碎成木屑，经10倍量50%(V/V)乙醇冷浸过夜后，60℃加热回流1次，每次3.0h，滤过；合并提取液，所得滤液经减压浓缩,回收乙醇得流浸膏。

将流浸膏离心、过滤，上清液加样于D101型大孔树脂柱，分别用水、30%乙醇、60%乙醇和90%乙醇洗脱，分别浓缩，干燥。

将上述总皂苷先经过减压硅胶柱(氯仿-甲醇系统梯度洗脱，硅胶：60-100目)初分得到八个部分；经薄层板分析（BAW系统：Rf值：0.4-0.6），将其中的第2部分(CHCl3-MeOH80:20)，再经过中压反相ODS柱(甲醇-水系统50%-100%梯度洗脱，流速30mL/min,检测波长203nm)，得到是五个部分；经高效液相分析，将部分4（MeOH-H2O70%，峰位于26.9min）通过半制备高效液相(流速2mL/min,检测波长203nm)进一步以甲醇-水(68:32,v/v)，于73.23min得到化合物。

该化合物为白色无定形粉末，硫酸乙醇显紫红色斑点，醋酐-浓硫酸反应阳性，Molish反应阳性，提示该化合物可能为皂苷类化合物。HR-ESI-MS给出其[M+Na]⁺准分子离子峰m/z:863.4405.(计算值:863.4405.)，结合碳谱、氢谱，推测其分子式为C₄₃H₆₈O₁₆。

在¹H-NMR(500MHZ,C₅D₅N)谱中，在高场区出现6个角甲基信号δ_H1.03(3H,s,H-24),1.06(3H,s,H-25),1.28(3H,s,H-26),1.46(3H,s,H-29),1.72(3H,s,H-27),1.14(3H,d,J=5.0Hz,H-30)；1个烯氢信号δ_H5.62(H-12,m)。其¹³C-NMR谱显示43个碳信号(表2)，其中包含2个特征性的乌苏烷型双键信号δ_C128.6(C-12),139.4(C-13)；1个羰基信号δ_C177.1(C-28)；结合以上数据，推测该化合物是一个乌苏酸型的三萜皂苷。结构中共有6个角甲基及δ_H4.39,3.78(2H,m,H-23)证明化合物23位含有羟基。δ_H3.00(1H,s,H-18),1.14(3H,d,J=5.0Hz,H-30)和季碳δ_C72.8(C-19)是19-羟基乌苏酸的典型特征；由此推测苷元结构为19,23-二羟基乌苏酸。连氧碳δ_C82.4（C-3）是3β-O糖的典型特征：糖端基碳δ_C96.0(C-glc-1)是28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷的典型特征。另一个羰基碳δ_C170.9（C-glcA-6）是葡萄糖醛酸酯羰基的典型特征。这一点得到了总碳数43（除去苷元母核30个碳仍余13个碳，大于两个六碳糖12个碳）的支持。因此该化合物是含有一个葡萄糖醛酸甲酯的双糖皂苷。

化合物4的¹H-NMR谱的低场区可以观察到2个糖的端基氢信号δ:5.31(1H,d,J=10.0Hz,1-H of glcA)，6.39(1H,d,J=10.0Hz,1-H of glc)，¹³C-NMR谱中糖的端基碳信号为δ:106.5,96.0，提示化合物4含有2个单糖单元。1个连氧甲基信号δ_H3.78(H-glcA-Methyl-1),δC52.1(C-glcA-Methyl-1)进一步支持该化合物中存在1个糖醛酸酯。将其碳谱数据与文献【Carbohydrate Research,349,39-43.】中的19α-羟基乌苏酸-3β-O-葡萄糖醛酸甲酯基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷比较，除23位多了一个羟基信号外基本一致，提示该化合物结构可能为19α,23-二羟基-乌苏酸-3β-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。从各糖的端基质子出发，利用¹H-¹H COSY谱所反映的邻位质子偶合关系归属各糖的质子信号：δ_H5.31(H-glcA-1)与δ_H4.16(H-glcA-2)相关，δ_H4.16(H-glcA-2)与δ_H4.23(H-glcA-3)相关，δ_H4.23(H-glcA-3)与δ_H4.53(H-glcA-4)相关，δ_H4.53(H-glcA-4)与δ_H4.54(H-glcA-5)相关，从而确定3位葡萄糖醛酸甲酯所对应碳谱数据；利用HSQC谱归属该皂苷上连接的糖的端基碳、氢信号如下：δ_H5.31(H-glcA-1)与δ_C106.5(C-glcA-1)相关，δ_H6.39(C-glc-1)与δ_C96.0(C-glc-1)相关；依据各单糖单元的碳、氢化学位移和偶合常数值，归属化合物4的2个单糖单元(表2)，为一个葡萄糖醛酸甲酯、一个葡萄糖。

在化合物的HMBC谱中，δ5.31(H-glcA-1)与δ82.4(C-3)相关，δ4.36(H-3)与δ106.5(C-glcA-1)相关，说明葡萄糖醛酸甲酯取代在苷元的C-3位上；δ6.39(H-glc-1)与δ177.1(C-28)相关，说明吡喃葡萄糖取代在苷元的C-28位。

经酸水解和气相分析，检测到化合物4含有D-葡萄糖醛酸、D-葡萄糖。

NOESY谱中δH4.36(H-3)与δH4.39(H-23b)相关，确认了3-O-α-L-吡喃阿拉伯糖为β取代。δH1.46(H-29)与δH3.00(H-18),1.06(H-25),1.14(H-30)相关，确认了19-羟基为α取代。

综上所述，该化合物的结构被确定为19α,23-二羟基-乌苏酸-3β-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，结构如式Ⅰ所示。

表1本实施例提取得到的化合物的1H(500MHz，C5D5N)和13C(125MHz，C5D5N)NMR数据

表1中化学位移以ppm为单位，偶合常数（J）以Hz为单位。

实施例2化合物的提取分离

干燥的枸骨茎用粉碎机粉碎成木屑，经15倍量40%(V/V)乙醇冷浸过夜后，80℃加热回流2次，每次2.0h，滤过；合并提取液，所得滤液经减压浓缩,回收乙醇得流浸膏。

将流浸膏离心、过滤，上清液加样于D101型大孔树脂柱，分别用水、30%乙醇、60%乙醇和90%乙醇洗脱，分别浓缩，干燥。

将上述总皂苷先经过减压硅胶柱(氯仿-甲醇系统梯度洗脱，硅胶：60-100目)初分得到八个部分；经薄层板分析（BAW系统：Rf值：0.4-0.6），将其中的第2部分(CHCl3-MeOH80:20)，再经过中压反相ODS柱(甲醇-水系统50%-100%梯度洗脱，流速30mL/min,检测波长203nm)，得到是五个部分；经高效液相分析，将部分4（MeOH-H2O70%，峰位于26.3min）通过半制备高效液相(流速2mL/min,检测波长203nm)进一步以甲醇-水(68:32,v/v)，于73.2min得到化合物，经核磁共振检测，化合物的结构被确定为19α,23-二羟基-乌苏酸-3β-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，结构如式Ⅰ所示。

实施例3化合物的提取分离

干燥的枸骨茎用粉碎机粉碎成木屑，经5倍量70%(V/V)乙醇冷浸过夜后，70℃加热回流2次，每次2.5h，滤过；合并提取液，所得滤液经减压浓缩,回收乙醇得流浸膏。

将流浸膏离心、过滤，上清液加样于D101型大孔树脂柱，分别用水、30%乙醇、60%乙醇和90%乙醇洗脱，分别浓缩，干燥。

将上述总皂苷先经过减压硅胶柱(氯仿-甲醇系统梯度洗脱，硅胶：60-100目)初分得到八个部分；经薄层板分析（BAW系统：Rf值：0.4-0.6），将其中的第2部分(CHCl3-MeOH80:20)，再经过中压反相ODS柱(甲醇-水系统50%-100%梯度洗脱，流速30mL/min,检测波长203nm)，得到是五个部分；经高效液相分析，将部分4（MeOH-H2O70%，峰位于25.1min）通过半制备高效液相(流速2mL/min,检测波长203nm)进一步以甲醇-水(68:32,v/v)，于73.3min得到化合物，经核磁共振检测，化合物的结构被确定为19α,23-二羟基-乌苏酸-3β-O-β-D-吡喃葡萄糖醛酸甲酯基-28-O-β-D-吡喃葡萄糖苷，结构如式Ⅰ所示。

实施例4H₂O₂诱导的心肌细胞缺氧实验:

调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，接种于96孔板中，每孔100μl，37℃，5%CO₂培养箱中培养24h后，随机分组进行实验。实验分为正常细胞对照组，H₂O₂损伤组（终浓度为200μM，临用配置，需避光），受试药各组。阳性药用维生素E（终浓度为500μM）。加药12h后用H₂O₂造模，造模24h后，每孔加入5mg/ml的MTT10μl培养4h,倾去上清液，加入100μl的DMSO，振摇10min，用全自动酶标仪测定570nm处的吸光度值(OD_570nm)，用于定量细胞存活率。

实施例1提取得到的结构如式Ⅰ所示的化合物（12.5-200μM）与模型组相比有极显著性差异，在给药浓度为200μM时细胞存活率可达91.29±4.60（P<0.01）。结果见表2。

表2细胞存活率(%)

与模型组比，*P<0.05，**P<0.01.

按照上述试验方法，实施例2-3提取得到的结构如式Ⅰ所示的化合物的抗氧化活性与实施例2-3提取得到的结构如式Ⅰ所示的化合物的抗氧化活性相近，实施例2提取得到的结构如式Ⅰ所示的化合物（12.5-200μM）在给药浓度为200μM时细胞存活率可达92.58±4.15，实施例3提取得到的结构如式Ⅰ所示的化合物（12.5-200μM）在给药浓度为200μM时细胞存活率可达93.42±4.16，与墨香组相比具有极显著性差异（P<0.01）。

实施例5对冠脉结扎所致大鼠急性心肌缺血损伤的保护作用

取SD大鼠，随机分为3组，假手术组、模型组和实施例1提取得到的化合物（100mg/kg）组，每组8只。化合物4（100mg/kg）组腹腔注射给予实施例1提取的化合物，假手术组、模型组灌胃给予等量的蒸馏水，每天一次，连续7天。末次给药45min左右，腹腔注射戊巴比妥钠麻醉大鼠，仰卧位固定，测量手术前心电图，经胸骨做横切口剪开皮肤，分离肌肉，从肋间取出心脏，结扎冠状动脉左前降支，挤出胸腔内空气，迅速缝合闭胸。术后24h，戊巴比妥钠麻醉大鼠，取血，取心脏，测定心肌梗死面积，结果见表3。

表3化合物对冠脉结扎大鼠心肌梗死面积的影响

组别	剂量（mg/kg）	梗死面积(%)
			假手术组	—	1.39±2.79***
模型组	—	29.18±5.24

化合物4

100

20.08±4.32**

注：**P<0.01，***P<0.001与模型组比

由表3结果可见腹腔注射化合物（100mg/kg）实施例1制备的化合物可以明显降低冠脉结扎所致大鼠心肌梗死面积，提示化合物具有抗心肌缺血性疾病的药理作用。

实施例2-3提取得到的结构如式Ⅰ所示的化合物的抗氧化活性与实施例2-3提取得到的结构如式Ⅰ所示的化合物的抗氧化活性相近，能够显著降低冠脉结扎所致大鼠心肌梗死面积。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (12)

1.一种结构如式Ⅰ所示化合物，

式Ⅰ。

2.一种如式Ⅰ所示化合物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：取枸骨根或枸骨茎粉碎，与乙醇水溶液混合浸泡后，加热回流，过滤收集滤液经减压浓缩，获得流浸膏；

步骤2：取所述流浸膏离心，收集上清液经大孔树脂柱，分别用水、30%乙醇、60%乙醇和90%乙醇洗脱，收集90%乙醇的洗脱组分；

步骤3：取所述90%乙醇的洗脱组分经减压硅胶柱，采用氯仿-甲醇系统梯度洗脱，收集氯仿-甲醇体积比为80:20的洗脱组分，再经中压反相ODS柱，采用甲醇-水系统梯度洗脱，经高效液相分析，收集保留时间为25.1-26.9min的组分，再经半制备高效液相纯化，收集73.2～73.3min的组分，即得；

所述高效液相的流动相为甲醇:水→70:30(v/v)；

所述半制备高效液相的流动相为甲醇:水→68:32(v/v)。

3.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤2中所述大孔树脂柱为D101型大孔树脂柱。

4.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤2中所述半制备高效液相色谱的流动相的流速为2mL/min。

5.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤1中所述乙醇水溶液中乙醇的体积百分数为40～70%。

6.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，以g/mL计，步骤1中所述枸骨茎与所述乙醇水溶液的质量体积比为1:5～15。

7.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，步骤1中所述加热回流的温度为60～80℃，所述加热回流的时间为2.0～3.0h。

8.根据权利要求7所述的提取方法，其特征在于，所述步骤1具体为：

步骤1-1：取枸骨茎粉碎，与5～15倍质量的乙醇水溶液混合浸泡后，于60～80℃加热回流2h，过滤收集第一滤液和第一滤渣；

步骤1-2：取所述滤渣与5～15倍质量的乙醇水溶液混合浸泡后，于60～80℃加热回流2h，过滤收集第二滤液和第二滤渣；

步骤1-3：重复步骤1-2；重复次数至少为0次；

合并所述第一滤液、所述第二滤液及步骤1-3中的滤液，经减压浓缩，获得流浸膏。

9.根据权利要求2所述的提取方法，其特征在于，所述中压反相ODS柱采用BAW系统，Rf值为0.40～0.60。

10.结构如式Ⅰ所示化合物在制备抗氧化剂中的应用

式Ⅰ。

11.结构如式Ⅰ所示化合物在制备治疗心肌细胞损伤的药物中的应用，

式Ⅰ。

12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述心肌细胞损伤为H₂O₂诱导的心肌细胞缺氧或冠脉结扎所致急性心肌缺血损伤。

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