CN112851742B - 利用华中枸骨根提取的五环三萜皂苷类化合物、提取分离方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于皂苷类化合物提取加工技术领域，公开了一种利用华中枸骨根提取的五环三萜皂苷类化合物、提取分离方法及用途，化合物为：3β‑O‑[α‑L‑吡喃鼠李糖(1→2)‑α‑L‑吡喃阿拉伯糖]‑泰国树脂酸、3β‑O‑[α‑L‑吡喃鼠李糖(1→2)‑α‑L‑吡喃阿拉伯糖]‑23‑羟基‑坡模酸、3β‑O‑[β‑D‑吡喃木糖(1→2)‑β‑D‑吡喃葡萄糖(1→3)‑2‑O‑乙酰基‑α‑L吡喃阿拉伯糖]‑23‑羟基‑坡模酸等。本发明具有较好的抗炎作用，可用作抗类风湿性关节炎的候选先导化合物；以天然药物华中枸骨的根为原料，来源广泛，无毒，无污染，制备过程简单，成本低廉，适合大规模推广应用。
Description
技术领域
本发明属于化合物技术领域，尤其涉及一种利用华中枸骨根提取的五环三萜皂苷类化合物、提取分离方法及用途。
背景技术
目前，皂苷类化合物广泛分布于如人参、麦冬、田七、柴胡、甘草等植物中和海参、软珊瑚等海洋生物中，根据苷元结构的不同可分为三萜皂苷和甾体皂苷。其中，以三萜皂苷分布最为广泛，可分为四环三萜皂苷和五环三萜皂苷，后者最为常见。三萜皂苷在体内和体外均具有良好的抗肿瘤作用，其抗肿瘤机制多样，不仅可直接抑制肿瘤细胞生长，而且可通过增强机体免疫，抑制肿瘤侵袭转移，诱导肿瘤细胞分化等机制抗肿瘤，有良好的开发应用前景。
华中枸骨(Ilex centrochinensis)是冬青科(Aquifoliaceae)冬青属(Ilexgenus centrochinensis)植物，主要分布在湖北西部、四川和安徽。它的叶和根分别做药用。我国部分地区将其叶作为苦丁茶的原料。根具有清热解毒、祛风祛湿的作用，是常用于治疗风湿性关节炎的土家族药物。目前，对其叶的研究较多。林立冬等人从冬青叶片中分离鉴定了部分三萜和黄酮类化合物。在前期研究中证实其叶子具有较强的抗炎和清除自由基的作用，并从其中分离出许多个新的黄酮类化合物。然而，对其根的研究至今尚无报道。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)现有技术没有从天然药物华中枸骨根中分离得到个新的五环三萜皂苷类化合物，对于抑制脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症介质NO生成，不能提供一种抗类风湿性关节炎的候选先导化合物，同时也不能为提供一种抗类风湿性关节炎抗炎的药物提供理论依据。
(2)现有技术中关于从华中枸骨中进行五环三萜皂苷类化合物的提取分离的方法复杂，成本高。
(3)华中枸骨根作为土家族药物用于治疗类风湿性关节炎，用药历史悠久，疗效显著，现有的技术对华中枸骨根化学成分和药效物质基础几乎没有任何研究，未见任何文献报道。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新五环三萜皂苷类化合物、提取分离方法、用途。
本发明是这样实现的，一种利用华中枸骨根提取的五环三萜皂苷类化合物。
进一步，所述五环三萜皂苷类化合物包括的第一种化合物为3β-O-[α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖]-泰国树脂酸，分子式为：
进一步，所述新五环三萜皂苷类化合物包括的第二种化合物为3β-O-[α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖]-23-羟基-坡模酸，分子式为：
进一步，所述新五环三萜皂苷类化合物包括的第三种化合物为3β-O-[β-D-吡喃木糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖(1→3)-2-O-乙酰基-α-L吡喃阿拉伯糖]-23-羟基-坡模酸，分子式为：
进一步，所述新五环三萜皂苷类化合物包含的第四种化合物为3β-O-[β-D-吡喃葡萄糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖]-23-羟基-坡模酸，分子式为：
本发明的另一目的在于提供一种如上述新五环三萜皂苷类化合物的提取分离方法，其特征在于，所述新五环三萜皂苷类化合物的提取分离方法包括：
步骤一，将5kg干燥华中枸骨根，适当粉碎后用95％乙醇20L在室温下浸渍提取3次，经旋转蒸发仪减压浓缩后得总浸膏；
步骤二，向得到的总浸膏中加入水形成水混悬液，分别用石油醚PE、乙酸乙酯EtOAc和正丁醇n-BuOH依次萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位；
步骤三，取乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱层析，用(100：0)-(5：1)的PE-EtOAc和(100：0)-(1：1)的CH2Cl2-MeOH依次梯度洗脱，得到11个流分B1～B11；
步骤四，上步所述流分B10先采用反相硅胶柱层析，经甲醇-水梯度洗脱，然后采用半制备高效液相色谱甲醇/水等度洗脱得第一种化合物；所述流分B11经反相硅胶柱层析，利用甲醇-水梯度洗脱和半制备高效液相色谱制备得到第二种化合物。
进一步，步骤三进行中，并列进行以下步骤：
取正丁醇萃取部位采用D101大孔吸附树脂柱层析分离，分别用水、30％乙醇、50％乙醇、90％乙醇洗脱；取50％乙醇洗脱流分20g经硅胶柱层析，(10：1)-(0：1)的CH2Cl2-MeOH梯度洗脱，得到6个次级流分C1-C6。
进一步，步骤四进行中，并列进行以下步骤：
所述流分C4先采用反相硅胶柱层析，经甲醇-水梯度洗脱，然后采用半制备高效液相色谱经甲醇/水等度洗脱得第三种化合物；所述流分C6直接采用半制备高效液相色谱经甲醇/水等度洗脱得到第四种化合物。
进一步，步骤四制备第一种化合物中，甲醇-水梯度洗脱为10％MeOH-90％MeOH；所述半制备高效液相色谱为等度洗脱色谱条件为MeOH/H2O，69：31，v：v，3.5mL/min，tR＝26.3min；
步骤四制备第二种化合物中，甲醇-水梯度洗脱为10％MeOH-90％MeOH；所述半制备高效液相色谱为等度洗脱色谱条件为MeOH/H2O，68：32，v：v，3.5mL/min，tR＝20.4min；
步骤四制备第三种化合物中，反相硅胶柱层析采用甲醇-水17：83；v：v，15mL/min洗脱；所述半制备高效液相色谱为等度洗脱色谱条件为MeOH/H2O，68：32，v：v，3.5mL/min，tR＝19.1min；
所述步骤四制备第四种化合物，次级流分C6直接采用半制备高效液相色谱的色谱条件为甲醇/水，65：35，v：v3.5mL/min，tR＝29.8min。
本发明的另一目的在于提供一种上述的五环三萜皂苷类化合物在制备炎症相关疾病药物中的应用。
结合上述的所有技术方案，本发明所具备的优点及积极效果为：
本发明为了进一步研究该植物的药用资源，促进其根部药用物质的开发利用。本研究对其根的化学成分进行了研究，从95％乙醇提取物中鉴定出4个新的三萜皂苷，它们的结构经高分辨质谱、一维、二维核磁共振波谱以及化学分析等方法鉴定。并采用LPS诱导的RAW264.7产生炎症介质NO作为体外炎症模型，结果表明:四种化合物对NO的产生均有明显的抑制作用，显示较好的抗炎活性，可作为抗类风湿性关节炎药物先导化合物。
本发明提供的新五环三萜皂苷类化合物，从天然药物华中枸骨根中分离得到4个新的五环三萜皂苷类化合物，能够明显的抑制脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症介质NO生成，具有较好的抗炎作用，可用作抗类风湿性关节炎的候选先导化合物。本发明提供的三萜皂苷类化合物的提取分离方法，以天然华中枸骨根为原料，来源广泛，无毒，无污染，制备过程简单，成本低廉，适合大规模推广应用。
本发明4个新的五环三萜皂苷对RAW146.7细胞存活率影响实验结果如图7所示，结果表明4个新的五环三萜皂苷类化合物在给药剂量不高于100μM时，给药组细胞存活率无显著差异。表明4个新的五环三萜皂苷类化合物在浓度不大于100μM时，对RAW146.7细胞均无明显细胞毒性作用，因此抗炎活性评价实验选定给药浓度分别为25、50、100μM。
本发明制备的4个新的五环三萜皂苷抑制LPS诱导的RAW146.7细胞NO生成结果如图8所示，结果表明：与空白组想比，模型组NO释放量均显著增加，表明LPS诱导的RAW146.7细胞炎症介质NO显著增加，炎症模型建模成功。4个新的五环三萜皂苷类化合物高剂量组(100μM)给药后NO释放量均显著下降，抑制率分别为35.8％(*p<0.05)、29.2％(*p<0.05)、19.8％(*p<0.05)、34.4％(*p<0.05)。表明4个新的五环三萜皂苷类化合物均具有较好抗炎活性，且第一种化合物、第二种化合物、第四种化合物呈剂量依赖性抑制NO的释放。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例中所需要使用的附图做简单的介绍，显而易见地，下面所描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的新五环三萜皂苷类化合物的提取分离方法流程图。
图2是本发明实施例提供的4个新五环三萜皂苷类化合物的结构式示意图。
图3(a)-图3(c)是本发明实施例提供的第一种化合物高分辨质谱(HR-MS)、核磁共振氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)谱图。
图4(a)-图4(c)是本发明实施例提供的第二种化合物高分辨质谱(HR-MS)、核磁共振氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)谱图。
图5(a)-图5(c)是本发明实施例提供的第三种化合物高分辨质谱(HR-MS)、核磁共振氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)谱图。
图6(a)-图6(c)是本发明实施例提供的第四种化合物高分辨质谱(HR-MS)、核磁共振氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)谱图。
图7是本发明实施例提供的4个新的五环三萜皂苷MTT实验结果示意图。
图8是本发明实施例提供的4个新的五环三萜皂苷抑制LPS诱导的RAW146.7细胞NO生成示意图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种新五环三萜皂苷类化合物、提取分离方法、用途，下面结合附图对本发明作详细的描述。
本发明提供一种新五环三萜皂苷类化合物，所述新五环三萜皂苷类化合物为3β-O-[α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖]-泰国树脂酸(1)、3β-O-[α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖]-23-羟基-坡模酸(2)、3β-O-[β-D-吡喃木糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖(1→3)-2-O-乙酰基-α-L吡喃阿拉伯糖]-23-羟基-坡模酸(3)、3β-O-[β-D-吡喃葡萄糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖]-23-羟基-坡模酸(4)中的任意一种。
本发明还提供一种所述新五环三萜皂苷类化合物作为候选先导化合物在制备抗类风湿性关节炎药物中的用途。
如图1所示，本发明的另一目的在于提供一种所述新五环三萜皂苷类化合物的提取分离方法，包括：
S101，将5kg干燥华中枸骨根，适当粉碎后用95％乙醇20L在室温下浸渍提取3次，经旋转蒸发仪减压浓缩后得总浸膏；
S102，向得到的总浸膏中加入水形成水混悬液，分别用石油醚PE、乙酸乙酯EtOAc和正丁醇n-BuOH依次萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位；
S103，取乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱层析，用(100：0)-(5：1)的PE-EtOAc和(100：0)-(1：1)的CH2Cl2-MeOH依次梯度洗脱，得到11个流分B1～B11；
S104，上步所述流分B10先采用反相硅胶柱层析，经甲醇-水梯度洗脱，然后采用半制备高效液相色谱甲醇/水等度洗脱得第一种化合物；所述流分B11经反相硅胶柱层析，利用甲醇-水梯度洗脱和半制备高效液相色谱制备得到第二种化合物。
在本发明实施例中，步骤三S103进行中，并列进行以下步骤：
取正丁醇萃取部位采用D101大孔吸附树脂柱层析分离，分别用水、30％乙醇、50％乙醇、90％乙醇洗脱；取50％乙醇洗脱流分20g经硅胶柱层析，(10：1)-(0：1)的CH2Cl2-MeOH梯度洗脱，得到6个次级流分C1-C6。
在本发明实施例中，步骤四S104进行中，并列进行以下步骤：
所述流分C4先采用反相硅胶柱层析，经甲醇-水梯度洗脱，然后采用半制备高效液相色谱经甲醇/水等度洗脱得第三种化合物；所述流分C6直接采用半制备高效液相色谱经甲醇/水等度洗脱得到第四种化合物。
在本发明实施例中，步骤四制备第一种化合物中，甲醇-水梯度洗脱为10％MeOH-90％MeOH；所述半制备高效液相色谱为等度洗脱色谱条件为MeOH/H2O，69：31，v：v，3.5mL/min，tR＝26.3min；
步骤四制备第二种化合物中，甲醇-水梯度洗脱为10％MeOH-90％MeOH；所述半制备高效液相色谱为等度洗脱色谱条件为MeOH/H2O，68：32，v：v，3.5mL/min，tR＝20.4min；
步骤四制备第三种化合物中，反相硅胶柱层析采用甲醇-水17：83；v：v，15mL/min洗脱；所述半制备高效液相色谱为等度洗脱色谱条件为MeOH/H2O，68：32，v：v，3.5mL/min，tR＝19.1min；
所述步骤四制备第四种化合物，次级流分C6直接采用半制备高效液相色谱的色谱条件为甲醇/水，65：35，v：v3.5mL/min，tR＝29.8min。
下面结合实施例对本发明作进一步描述。
本发明提供的从天然药物华中枸骨根中分离得到4个新的五环三萜皂苷类化合物，他们明显的抑制脂多糖诱导RAW264.7细胞炎症介质NO生成，具有较好的抗炎作用，可用作抗类风湿性关节炎的候选先导化合物。本发明提供的三萜皂苷类化合物的提取分离方法，以天然药物华中枸骨的根为原料，来源广泛，无毒，无污染，制备过程简单，成本低廉，适合大规模推广应用。
四个三萜皂苷化合物分别为3β-O-[α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖]-泰国树脂酸(1)、3β-O-[α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖]-23-羟基-坡模酸(2)、3β-O-[β-D-吡喃木糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖(1→3)-2-O-乙酰基-α-L吡喃阿拉伯糖]-23-羟基-坡模酸(3)、3β-O-[β-D-吡喃葡萄糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖]-23-羟基-坡模酸(4)。结构式如图2所示。
1、提取分离及结构表征
1.1提取与分离方法
将5kg华中枸骨干燥且粉碎后的根用95％乙醇20L在室温下提取3次。经旋转蒸发仪减压浓缩后得到255.5g的棕色浸膏，加入2.5L水形成水混悬液，分别用石油醚(PE,2.5L×3)、乙酸乙酯(EtOAc,2.5L×3)和正丁醇(n-BuOH,2.5L×3)依次萃取。乙酸乙酯萃取部位减压浓缩后得总浸膏23.594g，取乙酸乙酯部位总浸膏经硅胶柱层析，用PE-EtOAc(100：0-5：1)和CH2Cl2-MeOH(100：0-1：1)依次洗脱，得到11个流分(B1～B11)。流分B10经反相硅胶柱层析，甲醇-水(10％MeOH-90％MeOH)梯度洗脱和半制备高效液相色谱(MeOH/H2O，69：31，v：v，3.5mL/min)制备得第一种化合物(14.9mg,tR＝25.5min)。流分B11经反相硅胶柱层析，甲醇-水(10％MeOH-90％MeOH)梯度洗脱和半制备高效液相色谱(MeOH/H2O，68：32，v：v,3.5mL/min)制备得到第二种化合物(53.6mg，tR＝19.0min)。正丁醇部位(138.794g)采用D101大孔树脂进行柱层析，分别用水、30％乙醇、50％乙醇、90％乙醇洗脱。50％乙醇洗脱组分(20g)经硅胶柱层析，CH2Cl2-MeOH(10：1-0：1)洗脱，得到6个次级流分(C1-C6)。次级流分C4经反相硅胶柱层析，用甲醇-水(17：83；v：v,15mL/min)洗脱后用半制备高效液相色谱(MeOH/H2O，68：32，v：v,3.5mL/min)制备得到第三种化合物(30.6mg，tR＝18.0min)。次级流分C6直接用半制备高效液相色谱(甲醇/水，65：35，v：v,3.5mL/min)制备得到第四种化合物(22.1mg，tR＝29.0min)。
1.2化合物各项性能表征结果
第一种化合物：白色无定形粉末，比旋光度
-12.289(c 0.175,MeOH)，紫外光谱(MeOH)λmax 206nm，红外光谱(KBr)νmax＝3444.87,2939.52,2873.94,2360.87,1693.50,1458.18,1388.75,1138.00,1053.13,983.70，高分辨质谱(HR-ESI-MS):m/z 773.44470[M+Na]+(理论计算值C41H66O12Na+,773.45543)。1H-NMR(500MHz,CD3OD)δ3.12(1H,dd,J＝11.7Hz,4.3Hz,H-3),5.31(1H,brs,H-12),3.25(1H,d,J＝1.33Hz,H-19),4.55(1H,d,J＝4.5Hz,Ara-H-1),5.10(1H,d,J＝0.97Hz,Rha-H-1)；13C-NMR(125MHz,CD3OD)δ39.7(C-1),27.0(C-2),90.2(C-3),40.3(C-4),57.1(C-5),19.5(C-6),34.2(C-7),40.7(C-8),49.6(C-9),38.1(C-10),24.8(C-11),124.7(C-12),144.8(C-13),42.6(C-14),29.5(C-15),27.4(C-16),47.0(C-17),45.4(C-18),82.7(C-19),36.0(C-20),29.7(C-21),34.0(C-22),28.6(C-23),17.0(C-24),15.9(C-25),17.9(C-26),25.2(C-27),183.1(C-28),28.7(C-29),25.1(C-30),104.8(Ara-C-1),76.8(Ara-C-2),73.0(Ara-C-3),68.4(Ara-C-4),63.7(Ara-C-5),102.0(Rha-C-1),72.2(Rha-C-2),72.2(Rha-C-3),73.9(Rha-C-4),70.2(Rha-C-5),18.0(Rha-C-6)。
第二种化合物：白色无定形粉末，比旋光度
+10.589(c 0.332,MeOH)，紫外光谱(MeOH)λmax 205nm，红外光谱(KBr)νmax＝3456.44,2927.94,2877.79,2360.87,2341.58,1697.36,1458.18,1384.89,1141.86,1049.28,1026.13，高分辨质谱(HR-ESI-MS):m/z789.43927[M+Na]+(理论计算值C41H66O13Na+,789.45034)。1H-NMR(500MHz,CD3OD)δ3.63(1H,dd,J＝11.8Hz,4.6Hz,H-3),5.24(1H,brs,H-12),4.56(1H,d,J＝5.1Hz,Ara-H-1),5.16(1H,d,J＝1.8Hz,Rha-H-1)；13C-NMR(125MHz,CD3OD)δ39.6(C-1),26.5(C-2),82.3(C-3),44.0(C-4),48.1(C-5),18.9(C-6),33.7(C-7),42.7(C-8),48.6(C-9),37.6(C-10),24.7(C-11),128.6(C-12),139.6(C-13),40.9(C-14),29.6(C-15),27.3(C-16),49.6(C-17),47.9(C-18),74.3(C-19),43.3(C-20),25.2(C-21),32.9(C-22),64.6(C-23),13.7(C-24),16.4(C-25),17.6(C-26),24.6(C-27),182.5(C-28),29.6(C-29),16.2(C-30),104.3(Ara-C-1),76.6(Ara-C-2),73.6(Ara-C-3),69.1(Ara-C-4),64.7(Ara-C-5),101.1(Rha-C-1),72.0(Rha-C-2),72.1(Rha-C-3),73.9(Rha-C-4),70.2(Rha-C-5),18.0(Rha-C-6)。
第三种化合物：白色无定形粉末，比旋光度
+28.267(c 0.152,MeOH:H2O 1:1)，紫外光谱(MeOH)λmax 207nm，红外光谱(KBr)νmax＝3421.72,2924.07,2360.87,1743.65,1717.79,1458.18,1373.32,1238.30,1045.42，高分辨质谱(HR-ESI-MS):m/z979.48602[M+Na]+(理论计算值C48H76O19Na+,979.49808)。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ3.49(1H,dd,J＝11.71Hz,4.90Hz,H-3),5.10(1H,s,H-12),4.31(1H,d,J＝7.9Hz,Ara-H-1),4.38(1H,d,J＝7.52Hz,Glc-H-1),4.40(1H,d,J＝7.39Hz,Xyl-H-1)；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ38.0(C-1),25.4(C-2),80.0(C-3),42.3(C-4),45.9(C-5),17.3(C-6),32.3(C-7),39.2(C-8),46.8(C-9),36.0(C-10),23.2(C-11),125.9(C-12),138.5(C-13),41.2(C-14),28.2(C-15),26.0(C-16),46.6(C-17),46.1(C-18),72.4(C-19),41.6(C-20),24.0(C-21),31.4(C-22),62.2(C-23),12.8(C-24),15.6(C-25),16.9(C-26),23.7(C-27),179.4(C-28),29.1(C-29),15.8(C-30),103.1(Ara-C-1),70.2(Ara-C-2),80.1(Ara-C-3),67.8(Ara-C-4),66.0(Ara-C-5),21.2(Me,2-O-Acetyl),168.8(C＝O,Acetyl),102.3(Glc-C-1),81.5(Glc-C-2),76.9(Glc-C-3),69.4(Glc-C-4),76.7(Glc-C-5),60.9(Glc-C-6),104.5(Xyl-C-1),74.2(Xyl-C-2),76.5(Xyl-C-3),69.7(Xyl-C-4),65.8(Xyl-C-5)。
第四种化合物：白色无定形粉末，比旋光度
+5.580(c 0.218,MeOH:H2O1:1)，紫外光谱(MeOH)λmax 204nm，红外光谱(KBr)νmax＝3441.01,2927.94,2360.87,1701.22,1458.18,1384.89,1026.13，高分辨质谱(HR-ESI-MS):m/z951.49188[M+Na]+(理论计算值C47H76O18Na+951.50317)。1H-NMR(500MHz,DMSO-d6)δ3.53(1H,dd,J＝11.4Hz,4.6Hz,H-3),5.12(1H,s,H-12),4.36(1H,d,J＝5.9Hz,Ara-H-1),5.10(1H,s,Rha-H-1),4.32(1H,d,J＝7.6Hz,Glc-H-1)；13C-NMR(125MHz,DMSO-d6)δ38.4(C-1),25.4(C-2),79.1(C-3),42.3(C-4),46.4(C-5),17.2(C-6),32.3(C-7),39.2(C-8),46.8(C-9),36.0(C-10),23.1(C-11),126.0(C-12),138.4(C-13),41.2(C-14),28.1(C-15),26.0(C-16),46.6(C-17),46.0(C-18),72.4(C-19),41.6(C-20),24.0(C-21),31.4(C-22),62.5(C-23),13.2(C-24),15.7(C-25),16.8(C-26),23.6(C-27),179.4(C-28),29.0(C-29),15.7(C-30),102.9(Ara-C-1),81.9(Ara-C-2),72.6(Ara-C-3),67.1(Ara-C-4),64.7(Ara-C-5),100.2(Rha-C-1),70.4(Rha-C-2),82.0(Rha-C-3),72.0(Rha-C-4),68.3(Rha-C-5),17.8(Rha-C-6),103.2(Glc-C-1),76.8(Glc-C-2),73.5(Glc-C-3),69.9(Glc-C-4),76.9(Glc-C-5),61.0(Glc-C-6)。
表1第一种化合物-4苷元部分核磁共振波谱数据(1H为500MHz,13C为125MHz,ppm)
表2第一种化合物-4糖基部分核磁共振波谱数据(1H为500MHz,13C为125MHz,ppm)
第一种化合物高分辨质谱(HR-MS)、核磁共振氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)谱图如图3所示，第二种化合物高分辨质谱(HR-MS)、核磁共振氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)谱图如图4所示，第三种化合物高分辨质谱(HR-MS)、核磁共振氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)谱图如图5所示，第四种化合物高分辨质谱(HR-MS)、核磁共振氢谱(1H-NMR)和碳谱(13C-NMR)谱图如图6所示。
2、抗炎活性评价
采用脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞产生炎症模型，给药后利用NO试剂盒检测炎症介质NO释放量评价4个新的三萜皂苷化合物抗炎活性。
2.1试剂及方法
2.1.1主要试剂及配制
1)1L H-DMEM培养基：取10.0g H-DMEM干粉，置于洁净的容器中，加入1L三蒸水，再加入3.7g NaHCO3，放入干净的转子，在磁力搅拌器下搅拌至溶解，搅拌至结束前的30min，加入双抗溶液10mL。洗净两个500mL的瓶子烘干，并泡酸，再用二次水洗，烘干，并高温高压灭菌，再烘干。于超净工作台中，用0.22μM孔径的滤器过滤，并分装到上面的瓶子中，于4℃冰箱中保存备用。
2)完全培养基：90％H-DMEM培养基，10％FBS。
3)细胞冻存液：70％H-DMEM培养基，20％FBS，10％DMSO溶液
4)细胞复苏液：80％H-DMEM培养基，20％FBS。
5)磷酸缓冲液(PBS)：准确称取NaCl 8g，KCl 0.2g，Na2HPO4·12H2O 2.88g，KH2PO40.2g于1L洁净的容器中，三蒸水定容至1L，放入干净的转子，在磁力搅拌器下搅拌至溶解，分装于500mL的分装瓶里面，然后放入高温高压灭菌锅里面灭菌，待恢复至常温以后，置于4℃冰箱中保存备用。
6)MTT(母液)：MTT母液其浓度为5mg/mL。准确称取MTT 100mg，用磷酸缓冲液(PBS)避光并超声溶解，定容至20mL，用0.22μM滤膜过滤除菌，于4℃冰箱中避光保存，备用。
7)LPS(母液)：LPS母液浓度1mg/mL。准确称取5mg LPS，加入磷酸缓冲液(PBS)定容至5mL。用0.22μM微孔滤器过滤后分装，-20℃冰箱中保存，备用。
2.1.2药品的配制：4个新的五环三萜皂苷类化合物分别用DMSO溶解，配制成100mM，再根据实验所需稀释成相应的浓度，放于4℃冰箱，备用。
2.1.3细胞培养：将小鼠巨噬细胞RAW264.7在加有10％热灭活胎牛血清，100μ/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM培养基中于37℃、5％CO2的培养箱中培养。
2.1.4MTT实验：细胞毒性实验采用MTT法进行评估，取生长状态良好的RAW 264.7细胞，用胰蛋白酶消化，加入含有5mL完全培养基制成单细胞悬液，细胞浓度约为5×105cells/mL，每孔100μL，接种于96孔板(其中96孔板周围一圈加入200μL的PBS缓冲液，以消除边缘蒸发效应)。约24h细胞贴壁完全后，弃去原有培养液，加入含不同浓度的样品组和对照组的培养基，每孔200μL，每组做5个平行，置于5％CO2，37℃的培养箱中培养24h。待药物作用结束后，弃去原有培养液，每孔加入20μL MTT(5mg/mL)，180μL PBS溶液，培养箱中孵育4h。4h后终止培养，小心吸去孔内培养液，每孔加入150μL DMSO，用酶标仪检测570nm的OD值。
2.1.5抗炎活性评价：将对数期的RAW 264.7，接种于96孔板，每孔100μL，使其均匀分布，在37℃、5％CO2的培养箱中培养24h，待细胞稳定贴壁后更换培养液，空白组加入新鲜培养液200μL，模型组加入含有LPS(脂多糖)的培养液200μL，LPS浓度为1μg/mL，阳性对照组加入含有LPS和5μM的吲哚美辛的培养液200μL，实验组分别加入了含有LPS和4个新的五环三萜皂苷类化合物的培养液200μL，每组做5个平行，其中4个新的五环三萜皂苷类化合物的给药浓度分别为25μM、50μM、100μM。各培养液培养24h后，分别从各孔取50μL细胞培养液上清加入96孔板中，再依次加入GriessⅠ和GriessⅡ试剂各50μL，然后测定540nm波长处的吸光值。分别测定浓度为0、1、2、5、10、20、40、60、100μm/mL的NaNO2标准品的OD540，作标准曲线。最后根据NaNO2标准曲线来计算细胞培养上清液中NO的浓度。
2.2结果
2.2.1MTT实验结果
4个新的五环三萜皂苷对RAW146.7细胞存活率影响实验结果如图7所示，结果表明4个新的五环三萜皂苷类化合物在给药剂量不高于100μM时，给药组细胞存活率无显著差异。表明4个新的五环三萜皂苷类化合物在浓度不大于100μM时，对RAW146.7细胞均无明显细胞毒性作用，因此抗炎活性评价实验选定给药浓度分别别为25、50、100μM。
2.2.2抑制NO结果
4个新的五环三萜皂苷抑制LPS诱导的RAW146.7细胞NO生成结果如图8所示，结果表明：与空白组想比，模型组NO释放量均显著增加，表明LPS诱导的RAW146.7细胞炎症介质NO显著增加，炎症模型建模成功。4个新的五环三萜皂苷类化合物高剂量组(100μM)给药后NO释放量均显著下降，抑制率分别为35.8％(*p<0.05)、29.2％(*p<0.05)、19.8％(*p<0.05)、34.4％(*p<0.05)。表明4个新的五环三萜皂苷类化合物均具有较好抗炎活性，且第一种化合物、第二种化合物、第四种化合物呈剂量依赖性抑制NO的释放。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一种五环三萜皂苷类化合物的提取分离方法，其特征在于，所述五环三萜皂苷类化合物的提取分离方法包括：
步骤一，将5kg干燥华中枸骨根，适当粉碎后用95%乙醇20L在室温下浸渍提取3次，经旋转蒸发仪减压浓缩后得总浸膏；
步骤二，向得到的总浸膏中加入水形成水混悬液，分别用石油醚PE、乙酸乙酯EtOAc和正丁醇n-BuOH依次萃取，减压浓缩，分别得到石油醚萃取部位、乙酸乙酯萃取部位和正丁醇萃取部位；
步骤三，取乙酸乙酯萃取部位经硅胶柱层析，用(100：0)-(5：1)的PE-EtOAc 和(100：0)-(1：1)的CH2Cl2-MeOH依次梯度洗脱，得到11个流分B1~B11；
步骤四，上步所述流分B10先采用反相硅胶柱层析，经甲醇-水梯度洗脱，然后采用半制备高效液相色谱甲醇/水等度洗脱得第一种化合物；所述流分B11经反相硅胶柱层析，利用甲醇-水梯度洗脱和半制备高效液相色谱制备得到第二种化合物；
其中，第一种化合物为3β-O-[α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖]-泰国树脂酸，分子式为：
第二种化合物为3β-O-[α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖]-23-羟基-坡模酸，分子式为：
2.如权利要求1所述的五环三萜皂苷类化合物的提取分离方法，其特征在于，步骤三进行中，并列进行以下步骤：
取正丁醇萃取部位采用D101大孔吸附树脂柱层析分离，分别用水、30%乙醇、50%乙醇、90%乙醇洗脱；取50%乙醇洗脱流分20g经硅胶柱层析，(10：1)-(0：1)的CH2Cl2-MeOH梯度洗脱，得到6个次级流分C1-C6。
3.如权利要求2所述的五环三萜皂苷类化合物的提取分离方法，其特征在于，步骤四进行中，并列进行以下步骤：
所述流分C4先采用反相硅胶柱层析，经甲醇-水梯度洗脱，然后采用半制备高效液相色谱经甲醇/水等度洗脱得第三种化合物；所述流分C6直接采用半制备高效液相色谱经甲醇/水等度洗脱得到第四种化合物；
第三种化合物为3β-O-[β-D-吡喃木糖(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖(1→3)-2-O-乙酰基-α-L吡喃阿拉伯糖]-23-羟基-坡模酸，分子式为：
第四种化合物为3β-O-[β-D-吡喃葡萄糖(1→3)-α-L-吡喃鼠李糖(1→2)-α-L-吡喃阿拉伯糖]-23-羟基-坡模酸，分子式为：
4.如权利要求1、2或3所述的五环三萜皂苷类化合物的提取分离方法，其特征在于，步骤四制备第一种化合物中，甲醇-水梯度洗脱为10%MeOH-90%MeOH；所述半制备高效液相色谱为等度洗脱色谱条件为MeOH/H2O，69：31，v：v，3.5mL/min，tR = 26.3 min；
步骤四制备第二种化合物中，甲醇-水梯度洗脱为10%MeOH-90%MeOH；所述半制备高效液相色谱为等度洗脱色谱条件为MeOH/H2O，68：32，v：v，3.5mL/min，tR = 20.4 min；
步骤四制备第三种化合物中，反相硅胶柱层析采用甲醇-水17：83；v：v，15mL/min 洗脱；所述半制备高效液相色谱为等度洗脱色谱条件为MeOH/H2O，68：32，v：v，3.5mL/min，tR =19.1 min；
所述步骤四制备第四种化合物，次级流分C6直接采用半制备高效液相色谱的色谱条件为甲醇/水，65：35，v：v3.5mL/min，tR = 29.8 min。
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