CN106749492A

CN106749492A - 一种甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN106749492A
Application number: CN201611025739.3A
Authority: CN
Inventors: 贾景明; 阎婷; 胡高升
Original assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Current assignee: Shenyang Pharmaceutical University
Priority date: 2016-11-22
Filing date: 2016-11-22
Publication date: 2017-05-31
Anticipated expiration: 2036-11-22
Also published as: CN106749492B

Abstract

本发明属于医药技术领域，涉及从延龄草的根及根茎中提取分离的一种新甾体皂苷类化合物及其在制备炎症细胞抑制剂中的应用。该化合物具有式Ⅰ化学结构式，实验结果表明，它能抑制LPS刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7中炎症介质NO的产生，且其制备方法简易，有利于对其进行进一步的药理和临床研究，开发其在抗炎药物中的应用。

Description

一种甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种甾体皂苷类化合物及其制备方法和应用，具体涉及从延龄草根茎中提取分离得到的一种新的甾体皂苷及其制备方法和在制备抗炎药物中的用途。

背景技术

炎症是指机体对于外界刺激而利用系统的活体组织对外界致炎因子产生防御的一种十分重要而又常见的病理过程。非甾体类药物是目前临床上常用的抗炎药物,在我国,其消耗量仅次于抗感染药。但是,有诸多的不良反应,如影响消化系统,长期使用可导致胃溃疡。近年来，由于中药良好的抗炎作用和毒副作用小而受到广泛的关注。

延龄草为百合科延龄草属植物，以干燥根茎及成熟果实入药，为著名的土家族七药之一，已被列入国家三级保护植物。该药味甘、性平，有小毒，具有镇静安神、活血止血、散淤疗伤、止痛等功效，主治高血压、神经衰弱、眩晕头痛、跌打损伤、外伤出血等症，尤其在土家族民间治疗各种炎性疾病，如疼痛，溃疡，发烧和风湿性疼痛。延龄草富含甾体皂苷，有抗炎、降血脂、抗肿瘤、镇痛止血、免疫调节等作用，本发明所涉及的具有呋喃环的甾体皂苷化合物及其活性，迄今为止尚未见有专利或文献报道。

发明内容

本发明提供一种从延龄草根茎中提取分离得到的一种新的甾体皂苷和制备方法及其在制备抗炎药物中的用途。

本发明所述化合物的结构如式Ⅰ所示，

本发明的制备方法的技术方案包括如下步骤：

以延龄草根茎干燥药材为原料，以乙醇水溶液加热回流提取，浓缩得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于水中得混悬液，依次加入与混悬液体积相等的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将各个萃取溶液浓缩，得到浸膏，将正丁醇萃取物经硅胶柱色谱，用体积配比为100:0-0:100的二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇溶液进行梯度洗脱，其中二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇合适配比的洗脱物经ODS柱色谱，用体积比为10:90-100:0的甲醇-水溶剂梯度洗脱，将其中甲醇-水合适体积比的洗脱部分经半制备ODS高效液相色谱进行纯化，以合适体积比的甲醇-水溶液为流动相，得式Ⅰ化合物。

所述制备方法中，所述乙醇为浓度为：60％-70％的乙醇水溶液。

所述回流提取次数为2-3次，提取时间为每次1.5-2小时。

所述二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇合适的配比为100:25-100:35。

所述ODS柱色谱洗脱剂甲醇-水合适的体积比为68:32-72:28。

所述半制备ODS高效液相色谱流动相甲醇-水溶液合适的体积比为65:35-75:25。

式Ⅰ化合物为白色无定型粉末(甲醇)，[α]²⁰ _D–73.8(c 0.60,C₅H₅N)，Liebermann-Burchard反应阳性，Molish反应阳性，10％硫酸乙醇显浅红色。HR-ESI-MS给出其准分子离子峰1175.5809[M+H]⁺，确定式Ⅰ化合物的分子式为C₅₇H₉₀O₂₅(不饱和度为13)。化合物的IR(KBr)谱显示在3395，1646cm^-1处有吸收，提示该化合物结构中含有羟基、碳碳双键官能团。¹H-NMR(400MHz,pyridine-d₅)谱中，在高场区给出四个甾体皂苷特征甲基峰信号，即：δ_H0.89(3H,s,CH₃-18)，0.98(3H,d,J＝6.3Hz,CH₃-27)，1.08(3H,s,CH₃-19)和1.97(3H,s,CH₃-21)，及¹³C-NMR(400MHz,pyridine-d₅)谱中，高场区δ_C 9.0(C-21)、17.3(C-27)、18.3(C-18)、19.4(C-19)为苷元上四个甲基信号；δ_H 1.58(3H,d,J＝5.8Hz)，1.59(3H,d,J＝5.8Hz)，1.76(3H,d,J＝6.1Hz)为三个鼠李糖基的甲基质子信号；低场区δ_H 4.81(1H,d,J＝7.8Hz)，4.94(1H,d,J＝7.8Hz)，5.83(1H,br s)，6.28(1H,br s)和6.39(1H,br s)为5个糖的端基质子信号。¹³C NMR共有57个碳，其中5个单糖片段有30个碳，所以苷元的分子式为C₂₇H₄₀O₃，提示苷元是含有三个氧原子的甾体骨架。¹H NMR中δ_H 5.32(1H,br d,J＝3.2Hz,H-6)为烯烃质子信号；3.57(1H,dd,J＝9.4,5.5Hz,H-26)，3.94(1H,m,H-26)，3.87(1H,m,H-3)分别为26位与3位连氧质子信号，结合¹³C NMR中，6个烯碳信号δ_C 112.0(C-20)、121.7(C-6)、137.2(C-17)、141.2(C-5)、153.8(C-22)和155.3(C-16)，故推测式Ⅰ化合物的苷元为Δ^5,16,20(22)-furostatriene-3,26-diol。

苷元的结构进一步通过HMBC相关确定，如Ⅱ所示，δ_H 1.08(3H,s,Me-19)与C-1(δ_C37.4),C-5(δ_C 141.2)和C-9(δ_C 51.1)相关，说明Me-19连接在10位碳上；δ_H 0.89(3H,s,Me-18)与C-12(δC 35.7)，C-14(δC 60.9)和C-17(δ_C 137.2)相关，说明Me-18连接在13位碳上；δ_H 1.97(3H,s,Me-21)与C-17(δ_C 137.2)，C-20(δ_C 112.0)和C-22(δ_C 153.8)相关，说明Me-21连接在20位碳上；δ_H 0.98(3H,d,Me-27)与C-24(δ_C 33.2)，C-25(δ_C 33.6)和C-26(δ_C75.0)相关，说明Me-27连接在25位碳上；δ_H 5.32(1H,d,H-6)与C-4(δ_C 39.1),C-8(δ_C 30.5)和C-10(δ_C 37.4)相关。26位亚甲基的△(δ_H26b–δ_H26a)＝0.37ppm<0.48，根据文献报道，为25R构型，推断式Ⅰ化合物的苷元立体构型为(25R)-Δ^5,16,20(22)-furostatriene-3β,26-diol。

对式Ⅰ化合物进行酸水解，所得的糖残基通过HPLC分析，确定化合物含有D-葡萄糖和L-鼠李糖。糖链片段数据显示有5个端基质子信号，3个甲基信号，5个端基碳信号(δ_C100.4,102.2,102.3,103.3和104.9)，提示含有两个2个葡萄糖基和3个鼠李糖基。根据葡萄糖端基质子³J_1,2>7.0Hz，判断苷键构型为β-构型。根据¹³C NMR谱中鼠李糖基C-3(δ_C-RI72.9,δ_C-RII 72.9和δ_C-RIII 72.9)及C-5(δ_C-RI 69.6,δ_C-RII 68.4和δ_C-RIII 70.5)与文献对比，得出苷键构型为α-构型。在HMBC谱中，δ_H 4.94(1H,d,J＝7.8Hz)和δ_C 78.1(C-3)相关，表明四个糖基链连接在C-3，δ_H 4.81(1H,d,J＝7.8Hz)和δ_C 75.0(C-26)相关，表明β-吡喃葡萄糖连接在C-26。

通过以上解析，最终确定式Ⅰ化合物即为本发明的具有呋喃环的甾体皂苷。

表1：式Ⅰ化合物的¹H-NMR(400MHz,pyridine-d₅)和¹³C-NMR(400MHz,pyridine-d₅)数据

对所得到的式Ⅰ化合物进行体外LPS刺激RAW264.7巨噬细胞的抑制作用，体外实验结果表明式Ⅰ化合物在体外对LPS刺激RAW264.7巨噬细胞具有较好的抑制作用，其IC₅₀值为17.78μM。因此，本发明所述的甾体皂苷具有制备临床炎症治疗药物的前景。

本发明的优点在于，所得到的化合物结构新颖，提取分离方法简易，且具有较好的抗炎活性。

附图说明

图1为式I化合物对巨噬细胞RAW264.7的毒性检测及对LPS诱导细胞产生NO的作用***p<0.001vs对照组，#p<0.05，##p<0.01vs LPS组。

具体实施方式

实施例1：式I化合物的制备：

以延龄草根茎干燥药材1.7Kg为原料，以70％乙醇加热回流提取3次，每次2小时，浓缩得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于水中，依次加入与混悬物体积相等的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将各个萃取溶液浓缩，得到浸膏。将正丁醇萃取物经硅胶柱色谱，用体积配比为100:0-0:100的二氯甲烷-甲醇溶液进行梯度洗脱，其中二氯甲烷-甲醇配比为100:30的洗脱物经ODS柱色谱，用体积比为10:90-100:0的甲醇-水溶剂梯度洗脱，将其中甲醇-水体积比为70:30的洗脱部分经半制备ODS高效液相色谱进行纯化，以体积比为69:31的甲醇-水溶液为流动相，得式Ⅰ化合物。

实施例2：式I化合物的药理活性

试验方法和结果

1、MTT法检测式I化合物对RAW264.7细胞成活率的影响

取对数生长期培养的RAW264.7细胞，用含10％胎牛血清的新鲜DMEM培养基将细胞密度调至5×10⁴个/mL接种于96孔板中，待其过夜生长后加不同浓度受试化合物，药物预处理1h后加LPS(100ng/mL)继续培养24h，最后检测细胞活性。每孔加入20μL的MTT(5mg/mL)后于培养箱中继续培养4h。小心吸弃上层培养基，每孔加入100μL的DMSO。放置10min，震荡40s左右，使甲瓒晶体完全溶解。将96孔板置于酶标仪中，检测570nm和630nm处的OD值。利用酶标仪及相应软件进行数据处理，利用平均值按如下公式计算细胞成活率：细胞成活率％＝样品组OD平均值/空白对照组OD平均值×100％

2、Griess法检测式I化合物对LPS刺激RAW264.7细胞的NO抑制作用

取对数生长期培养的RAW264.7细胞，用含10％胎牛血清的新鲜DMEM培养基将细胞密度调至5×10⁴个/mL接种于96孔板中，待其过夜生长后加不同浓度受试化合物，药物预处理1h后加LPS(100ng/mL)继续培养24h，吸取上清培养液50μL，加入50μL的Griess试剂Ⅰ和Griess试剂Ⅱ，室温下反应15min，540nm处测定其OD值。根据标准曲线计算上清培养液的NO浓度。

3、式I化合物抗炎活性结果

LPS(100ng/mL)可明显诱导细胞产生NO，达到比较理想的细胞炎症状态。式I化合物对RAW264.7细胞中LPS诱导产生的NO显示了较好的抑制作用。由Fig.1B可以看出，式I化合物对NO的抑制作用呈浓度依赖性。由Fig.1A可知，当式I化合物的浓度达到160μM时细胞仍保持能较好的活性，没有明显的细胞毒性。

Claims

1.一种甾体皂苷类化合物，其特征在于，该化合物具有式Ⅰ的结构：

2.根据权利要求1所述的甾体皂苷类化合物，其特征在于，该化合物从延龄草的根及根茎中分离得到的。

3.如权利要求1所述的甾体皂苷类化合物的制备方法，其特征在于：以延龄草根茎干燥药材为原料，以乙醇加热回流提取，浓缩得浸膏状乙醇提取物，将乙醇提取物混悬于水中得混悬液，依次加入与混悬液体积相等的石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，将各个萃取溶液浓缩，得到浸膏，将正丁醇萃取物经硅胶柱色谱，用体积配比为100:0-0:100的二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇溶液进行梯度洗脱，其中二氯甲烷/三氯甲烷-甲醇体积比为100:25-100:35的洗脱物经ODS柱色谱，用体积比为10:90-100:0的甲醇-水溶剂梯度洗脱，将其中甲醇-水体积比为68:32-72:28的洗脱部分经半制备ODS高效液相色谱进行纯化，以体积比为65:35-75:25的甲醇-水溶液为流动相，得式Ⅰ化合物。

4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述乙醇浓度为：60％-70％。

5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的回流提取次数为2-3次，提取时间为1.5-2小时。

6.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的乙醇的体积为延龄草根茎干燥药材重量的8-10倍。

7.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的甾体皂苷类化合物或药学上可接受的载体。

8.一种药物制剂，其特征在于，包含权利要求1所述的甾体皂苷类化合物或权利要求7所述的药物组合物。

9.权利要求1所述的甾体皂苷类化合物在制备抗炎药物中的应用。

10.权利要求7所述的药物组合物或权利要求8的药物制剂在制备抗炎药物中的应用。