CN110507662B - 一种黄精甾体皂苷元及其制备方法与应用 - Google Patents

一种黄精甾体皂苷元及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110507662B
CN110507662B CN201910790868.9A CN201910790868A CN110507662B CN 110507662 B CN110507662 B CN 110507662B CN 201910790868 A CN201910790868 A CN 201910790868A CN 110507662 B CN110507662 B CN 110507662B
Authority
CN
China
Prior art keywords
methanol
polygonatum
rhizoma polygonati
sapogenin
steroid
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201910790868.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110507662A (zh
Inventor
吴毅
黄丽萍
袁铭铭
宁火华
殷海霞
邬秋萍
丁银平
潘蕾
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangxi Institute For Drug Control
Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine
Original Assignee
Jiangxi Institute For Drug Control
Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangxi Institute For Drug Control, Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine filed Critical Jiangxi Institute For Drug Control
Priority to CN201910790868.9A priority Critical patent/CN110507662B/zh
Publication of CN110507662A publication Critical patent/CN110507662A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110507662B publication Critical patent/CN110507662B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/56—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids
    • A61K31/58—Compounds containing cyclopenta[a]hydrophenanthrene ring systems; Derivatives thereof, e.g. steroids containing heterocyclic rings, e.g. danazol, stanozolol, pancuronium or digitogenin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7042—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings
    • A61K31/7048—Compounds having saccharide radicals and heterocyclic rings having oxygen as a ring hetero atom, e.g. leucoglucosan, hesperidin, erythromycin, nystatin, digitoxin or digoxin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07J—STEROIDS
    • C07J71/00—Steroids in which the cyclopenta(a)hydrophenanthrene skeleton is condensed with a heterocyclic ring
    • C07J71/0005—Oxygen-containing hetero ring

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Steroid Compounds (AREA)

Abstract

本发明公开了黄精甾体皂苷及黄精甾体皂苷元在制备治疗或预防阿尔茨海默症药物中的应用，黄精甾体皂苷及黄精甾体皂苷元结构如下：其中，R1代表C1‑C6的烷基或烯基，R2代表H或者单糖或寡聚糖。药理活性研究结果表明，黄精甾体皂苷及黄精甾体皂苷元具有很好的预防、治疗抗老年痴呆的作用。

Description

一种黄精甾体皂苷元及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于中药开发利用领域，具体涉及一种新的黄精甾体皂苷元huangjingsterol B及其制备方法与应用。
背景技术
黄精是2016年国家卫计委最新颁布的既是食品又是药品的中药之一，具有补气养阴，健脾，润肺，益肾功效，用于脾胃气虚，体倦乏力，胃阴不足，口干食少，肺虚燥咳，劳嗽咳血，精血不足，腰膝酸软，须发早白，内热消渴等病症。传统认为黄精如果不炮制或炮制不合理，很可能就会引起某些副作用，临床上不应使用生黄精而应用制黄精。通过炮制，一方面可制其毒副作用，消除麻味，减轻对咽喉的刺激，另一方面可提高黄精的临床疗效，增强药物补脾润肺、益肾的作用。炆黄精是江西建昌帮最具有代表性的饮片之一，炆法存在历史超过400年。传统的建昌帮制备炆黄精是选择华东地区的姜形黄精药材，采用传统的炆制方法制备，是具有鲜明江西特色的中药饮片。黄精含有多种化学成分，主要包括多糖、甾体皂苷、三萜、生物碱、木脂素、黄酮、植物甾体皂苷元及挥发油等，其中多糖和甾体皂苷为其主要药效成分，具有降血糖、降血脂、抗炎、抗肿瘤、调节免疫等作用。现代临床常用于治疗糖尿病、动脉硬化等疾病。从滇黄精、多花黄精和黄精中共分离得67种甾体皂苷类化合物，按照苷元的骨架类型不同，可分为：螺甾烷醇型(I、II)C-25为S构型，甲基处于直立键；异螺甾烷醇型(III)C-25为R型，甲基位于平伏键，化学性质较稳定，存在较多。螺甾烷醇和异螺甾烷醇型苷元是其他苷元的前体，即其他苷元均是由这2种类型衍生而来。螺甾烷醇型皂苷大多为单糖链皂苷，糖基大多连在苷元的C-3位，少数在F环的C-23、C-24或C-27位上连有糖基，形成双糖链皂苷，C-3位的糖链由多种糖基以不同的连接方式组成。常见的糖基有葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖和岩藻糖。
发明内容
本发明从炆黄精中通过制备液相色谱等方法分离得到4种甾体皂苷及苷元：(25S)spirostan-5-en-12-one-3-O-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-[β-D-Xylopyranosyl(1→3)]-O-β-D-glucopyranosyl(1→4)-β-D-galactopyranoside(黄精皂苷A1，化合物3)、(25S)spirostan-5-en-12-one-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside(黄精皂苷A2，化合物4)、(25R)-3-β-hydroxyspirost-5-en-12-one(huangjingsterol A，化合物1)、3-β-hydroxyspirost-5,25-diene-12-one(huangjingsterol B，化合物2)，其中黄精甾体皂苷元B(huangjingsterol B)为首次发现的新结构，本发明进一步还公开了上述甾体皂苷及苷元的制备方法和以及在制备预防、治疗抗阿尔茨海默症药物中的应用。
本发明具体技术方案如下：
黄精甾体皂苷及黄精甾体皂苷元在制备治疗或预防阿尔茨海默症药物中的应用。本发明所述黄精甾体皂苷及黄精甾体皂苷元为具有黄精甾体皂苷元母核通式结构的化合物，包括异螺甾烷醇型苷元型以及衍生得到的化合物。
优选的，所述黄精甾体皂苷及黄精甾体皂苷元结构如下：
其中，R1代表C1-C6的烷基或烯基，R2代表H或者单糖或寡聚糖。
进一步的，所述R1代表＝CH2或者-CH3，R2代表H；或者，R1代表-CH3，R2代表
化合物1：黄精甾体皂苷元B、化合物2：黄精甾体皂苷元A、化合物3：黄精甾体皂苷A1和化合物4：黄精甾体皂苷A2，结构如下：
本发明另一目的在于提供一种新的黄精甾体皂苷元B，具有如下结构：
本发明另一目的在于提供上述黄精甾体皂苷元的制备方法，包括如下步骤：
(1)取多花黄精的干燥根茎，炆法炮制后，乙醇或乙醇水溶液提取，用二氯甲烷萃取，萃取液减压浓缩制得浸膏；
(2)将二氯甲烷浸膏用甲醇溶解后，干法上硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇为洗脱剂等度洗脱，依次接下5份2000ml洗脱液F1～F5及5份切得干柱组分F6～F10。，以石油醚-乙酸乙酯溶液线性梯度洗脱，依次得22个组分，在ODS柱上对第17组分进行色谱分离，并用甲醇-水溶液线性梯度洗脱，依次得到5个组分，取第2组分经高效液相制备色谱柱，以甲醇–水溶液等度洗脱，得到所述黄精甾体皂苷元。
优选的，步骤(1)采用70％乙醇溶液提取。
优选的，步骤(2)二氯甲烷浸膏部分用甲醇溶解后，干法上硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇(20:1)为洗脱剂等度洗脱，洗脱2.5个柱体积，依次接下5份2000ml洗脱液F1～F5；取干柱部分，自下而上切成5份，取第1份上硅胶柱，以体积比20:1～1:1的石油醚-乙酸乙酯溶液洗脱3个柱体积，依次得22个组分，在ODS柱上对第17组分进行色谱分离，并用体积比为20:80～70:30甲醇-水溶液线性梯度洗脱，依次得到5个组分，取第2组分经高效液相制备色谱柱，以体积比为65:35的甲醇–水溶液洗脱，得到黄精甾体皂苷元。
具体的操作步骤如下：
(1)取多花黄精的干燥根茎，炆法炮制后，乙醇或乙醇水溶液提取，用二氯甲烷萃取，萃取液浓缩制得浸膏；
具体的操作为：取多花黄精的干燥根茎，切厚片，经建昌帮传统炮制方法炆法进行炮制，50℃干燥，粉碎成粗粉，70％乙醇浸泡过夜，加热回流提取2次，每次2h，滤过，滤液合并，浓缩至小体积，用二氯甲烷萃取，萃取液浓缩至浸膏；
(2)将二氯甲烷浸膏部分用甲醇溶解后，干法上硅胶柱以二氯甲烷-甲醇(20:1)为洗脱剂等度洗脱，洗脱2.5个柱体积，依次接下5份2000ml洗脱液F1～F5；取干柱部分，自下而上切成5份，取第1份上硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯(优选以体积比20:1～1:1线性洗脱)洗脱3个柱体积，得22个组分F6-a～F6-v，在TLC监测下，在ODS柱上对组分F6-q(1.46g)进行色谱分析，并用甲醇-水(20:80～70:30)梯度洗脱，得到5个亚组分F6-q-1～F6-q-5。通过高效液相制备色谱法(甲醇–水，65:35)将亚组分F6-q-2纯化，得到化合物1黄精甾体皂苷元huangjingsterol B(12.6mg)(新化合物)和2黄精甾体皂苷元huangjingsterol A(30.2mg)。优选反相高效制备液相色谱条件为色谱柱：YMC-Pack ODS-A(250×20mm,S-5μm,12nm)流动相：甲醇-水＝65:35(V/V)，流速7mL/min。
本发明另一目的在于提供上述黄精甾体皂苷的制备方法，包括如下步骤：
(1)取多花黄精的干燥根茎，炆法炮制后，乙醇或乙醇水溶液提取，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取水相，正丁醇萃取液浓缩制得浸膏；
(2)将正丁醇浸膏(1900g)加水溶解，经D101大孔树脂柱以乙醇-水溶液洗脱，依次得到5个组分，将第4个组分用硅胶拌样，经过硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇溶液洗脱3个柱体积，得到6个组分，将第5组分用硅胶拌样，经过硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇溶液洗脱3个柱体积，依次得到8个组分，F5-a～F5-h。其中F5-e经中压制备液相色谱，以甲醇-水溶液梯度洗脱，得到7个组分，取第6组分经过硅胶柱层析，以二氯甲烷-甲醇溶液洗脱3个柱体积，得到10个组分，其中8、9组分经重结晶后得到所述黄精甾体皂苷。
优选的，步骤(1)采用70％乙醇溶液提取。
优选的，步骤(2)将浸膏加水溶解，经D101大孔树脂柱，以10％、30％、50％、70％、95％乙醇洗脱3个柱体积，70％乙醇洗脱液减压浓缩至干，用1:1.5的硅胶拌样，干法上硅胶柱(100-200目)，以二氯甲烷-甲醇(50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:2)为洗脱剂依次洗脱3个柱体积，得到6个组分F1～F6，将第5组分F5(10.88g)蒸干，用1:1.5的硅胶拌样，干法上硅胶柱(100-200目)，以二氯甲烷-甲醇(50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、3:2、1:1)为洗脱剂依次洗脱，得组分F5-a～F5-h 8个组分，将第5组分F5-e(1.9g)经中压制备液相色谱，以体积比为20:80～90:10甲醇-水溶液梯度洗脱，得到7个组分，取第6组分蒸干，用1:1.5的硅胶拌样，干法上硅胶柱(100-200目)，依次用体积比为20:1、15:1、10:1、5:1、7:2、2:1二氯甲烷-甲醇溶液各洗脱3个柱体积，得到10个组分，其中8、9组分经重结晶后得到所述黄精甾体皂苷。
具体的操作步骤如下：
(1)取多花黄精的干燥根茎，炆法炮制后，70％乙醇溶液提取，依次用二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇萃取水相，正丁醇萃取液浓缩制得浸膏；
具体的操作为：取多花黄精的干燥根茎，切厚片，经建昌帮传统炮制方法炆法进行炮制，50℃干燥，粉碎成粗粉，70％乙醇浸泡过夜，加热回流提取2h，滤过，浓缩至小体积，正丁醇萃取，浓缩至浸膏；
(2)取正丁醇萃取部分干膏1900g，加水溶解至10L，经D101大孔树脂柱(10％、30％、50％、70％、95％乙醇)洗脱，70％乙醇洗脱液减压浓缩至干，用1:1.5的硅胶拌样，干法上硅胶柱(100-200目)，以二氯甲烷-甲醇(50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:2)为洗脱剂依次洗脱3个柱体积，得到6个组分F1～F6，第5组分F5(10.88g)蒸干，用1:1.5的硅胶拌样，干法上硅胶柱(100-200目)，以二氯甲烷-甲醇(50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、3:2、1:1)为洗脱剂依次洗脱，得组分F5-a～F5-h 8个组分。其中F5-e(1.9g)经中压制备液相色谱，以甲醇-水(20:80～90:10)梯度洗脱，经TLC监测，合并得到7个组分F5-e-1～F5-e-7。F5-e-6(900mg)经过硅胶柱层析(100-200目)，以二氯甲烷-甲醇(20:1、15:1、10:1、5:1、7:2、2:1)为洗脱剂依次各洗脱3个柱体积，得组分10个组分F5-e-6-1～F5-e-6-10，其中F5-e-6-8(164mg)与F5-e-6-9(122mg)析出结晶，经重结晶后分别得到化合物3((25S)spirostan-5-en-12-one-3-O-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-[β-D-xylopyranosyl(1→3)]-O-β-D-glucopyranosyl(1→4)-β-D-galactopyranoside)(45.2mg)(黄精皂苷A1)和化合物4((25S)spirostan-5-en-12-one-3-O-β-D-glucopyra nosyl-(1→2)-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-gal actopyranoside)(38.7mg)(黄精皂苷A2)。
阿尔茨海默症(Alzheimer’s disease，AD，又称老年痴呆)是一种中老年常见的以渐行性记忆力减退、认知功能障碍、人格改变为特征的中枢神经系统退行性疾病。全球老年痴呆症病人已经超过4000万，随着世界人口老龄化的加剧，患者将持续增加，预计到2050年老年痴呆症患者人数将超过1.5亿，也就是85岁以上老人，每2人中就有1个老年痴呆症患者，由此将带来诸多的社会和经济问题，因此对AD的防治已成为十分迫切的社会与医学问题。目前治疗药物种类繁多，但多为对症治疗，且疗效不确切、特异性不强、毒副作用大、不易透过血脑屏障等，限制了其临床应用，因此开发高效低毒老年性痴呆防治药物一直是国内外医药界的研究热点。本发明从炆黄精中分离得到4种甾体皂苷类成分，特别是得到一种新的黄精甾体皂苷元huangjingsterol B，并对4种甾体皂苷的药理活性进行了研究，结果表明，黄精甾体皂苷元huangjingsterol B及黄精甾体皂苷元huangjingsterol A及黄精皂苷A1和A2都具有很好的预防、治疗抗老年痴呆的作用。
附图说明
图1为黄精甾体皂苷元huangjingsterol B和黄精甾体皂苷元huangjingsterol A检测波长为210nm的HPLC制备色谱图(tR huangjingsterol B＝182min,tR huangjingsterol A＝212min)。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1炆黄精中黄精甾体皂苷的制备
1.药材来源及炆黄精制备
本发明所用多花黄精药材为百合科植物多花黄精的干燥根茎，购自江西省樟树市药材市场，并经江西中医药大学药学院付小梅教授鉴定，且留存标本在江西省药品检验检测研究院中药标本室。
炆法黄精：取净黄精药材，用清水漂一天，取出，沥干，放入炆药罐内炆24h，至药熟透汁尽，取出，50℃干燥，加20％黄酒喷洒均匀，闷润，待酒吸尽，蒸制4h，焖一夜，取出，放入烘箱内50℃干燥，备用。
2.仪器与试剂
岛津2010系列高效液相色谱仪(日本岛津公司)，检测器均为PDA检测器，色谱柱为YMC(10μm，150×4.6mm和10μm，250×4.6mm)；岛津20-AD型制备高效液相色谱仪，制备柱为YMC(10μm，250×20mm)；Buchi中压液相制备色谱仪(瑞士步琪公司)；C18反相填料为日本YMC产品；A EYELA SB-1000旋转蒸发仪(日本EYELA公司)；电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械厂)；1H NMR(600MHz)和13C NMR(150MHz)谱用Varian UNITY INOVA 600型超导核磁共振仪测定，以氘代试剂作标定；Micromass ZabSpec质谱仪(美国Micromass公司)；Sartorius BP211D型电子天平(德国赛托利斯集团)；UV用UV-260紫外分光光度计(日本岛津公司)测定，溶剂为甲醇；柱色谱硅胶(100～200目)、薄层色谱硅胶(青岛海洋化工厂)；实验中所用试剂(石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、乙醇等)为天津市富宇精细化工有限公司产品，均为分析纯；水为娃哈哈纯净水，氘代试剂DMSO-d6(美国剑桥公司CIL)；色谱乙腈和甲醇为上海安谱科学仪器有限公司产品。
3.黄精甾体皂苷元及黄精甾体皂苷的制备与结构鉴定
3.1多花黄精的干燥根茎30kg经江西古汉精制中药饮片厂按照江西建昌帮传统炮制方法——炆法炮制后得到17kg炆黄精炮制品。取炆黄精药材粉碎，用10倍量70％乙醇浸泡1h，加热回流提取2次，每次2h，滤过，提取液合并浓缩至20L，依次用两倍体积的二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇溶液各萃取水相三次。萃取液分别减压浓缩至干，得二氯甲烷浸膏(210g)、乙酸乙酯浸膏(109g)和正丁醇浸膏(1900g)。
3.2二氯甲烷浸膏(210g)用适量甲醇溶解后，用1:1.5的硅胶拌样，干法上硅胶柱(100-200目)，以二氯甲烷-甲醇(20:1)为洗脱剂等度洗脱，洗脱2.5个柱体积，依次接下5份2000ml洗脱液F1～F5；取干柱部分，自下而上切成5份，取第1份F-6(60.8g)上硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯(20:1～1:1，V/V)洗脱3个柱体积，得22个组分F6-a～F6-v。在TLC监测下，在ODS柱上对组分F6-q(1.46g)进行色谱分析，并用甲醇-水(20:80和70:30)梯度洗脱，得到5个亚组分F6-q-1～F6-q-5。通过高效液相制备色谱法将亚组分F6-q-2纯化，色谱条件为：色谱柱：YMC-Pack ODS-A(250×20mm,5μm)流动相：甲醇-水(65:35，V/V)，流速7mL/min，得到化合物1黄精甾体皂苷元B(huangjingsterol B)(12.6mg)(新化合物)和2黄精甾体皂苷元A(huangjingsterol A)(30.2mg)，检测波长为210nm的HPLC制备色谱图如1所示，收集保留时间为182min及212min处的色谱峰进行结构鉴定。
3.3取正丁醇萃取部分干膏(1900g)加水溶解至10L，经D101大孔树脂柱，以10％、30％、50％、70％、95％乙醇各洗脱2.5个柱体积，得到5个组分，将第4个组分减压浓缩至干，用1:1.5的硅胶拌样，干法上硅胶柱(100-200目)，以二氯甲烷-甲醇(50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:2)为洗脱剂依次各洗脱3个柱体积，得到6个组分F1～F6，第5组分F5(10.88g)用1:1.5的硅胶拌样，干法上硅胶柱(100-200目)，以二氯甲烷-甲醇(50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1、3:2、1:1)为洗脱剂依次洗脱，得组分F5-a～F5-h。其中F5-e(1.9g)经中压制备液相色谱，以甲醇-水(20:80～90:10)梯度洗脱，经TLC监测，得到7个组分F5-e-1～F5-e-7。F5-e-6(900mg)经过硅胶柱层析(100-200目)，以二氯甲烷-甲醇(20:1、15:1、10:1、5:1、7:2、2:1)为洗脱剂依次各洗脱3个柱体积，得10个组分：F5-e-6-1～F5-e-6-10，其中组分F5-e-6-8(164mg)与组分F5-e-6-9(122mg)析出结晶，经重结晶后，分别得到化合物3(45.2mg)和4(38.7mg)。
4.结构鉴定
化合物1：白色粉末，[a]20D-1.1(c 0.09，MeOH)；UV(MeOH)max(loge):204(0.5648)nm；ESIMS m/z：427[M+H]+，449[M+Na]+。HRESIMS m/z：427.2854[M+H]+(calcd for C27H39O4，427.2848)；1HNMR(600MHz，C5D5N)and13CNMR(150MHz,C5D5N)。数据见表1。
化合物1结构解析
白色粉末，溶于吡啶。Libermann–Burchard反应阳性，ESI质谱显示了明确的准分子离子峰m/z:427[M+H]+，表明其分子量为426，通过HRESIMS m/z427.2854[M+H]+(calcdfor C27H39O4，427.2848)。确定其分子式为C27H38O4。
1HNMR谱高场区显示3个甲基质子信号和13CNMR谱(有27个碳信号及109.6的螺碳特征信号)，示该化合物为具有螺环的甾体皂苷元。
HMBC谱中，H-19与37.4ppm、141.9ppm、52.6ppm和37.7ppm相关，H-2.62ppm(C-43.4ppm)与31.1ppm、71.1ppm、141.9ppm、120.9ppm和37.7ppm相关，H-1.62ppm(C-31.1ppm)与37.4ppm、71.1ppm和37.7ppm相关，说明71.1ppm位于C-3位，141.9ppm位于C-5位，120.9ppm位于C-6位；H-18与212.8ppm、55.1ppm、56.3ppm和54.2ppm相关，说明212.8ppm位于C-12位，54.2ppm位于C-17位；H-26与29.0ppm、144.4ppm和109.0ppm相关，说明33.4ppm位于C-23位，说明109.0ppm位于C-27位，144.4ppm位于C-25位.
NOESY谱中H-19/H-1a，H-1b/H-3分别相关，说明3位羟基为β构型；与化合物2[3]中碳谱数据对比，除侧链上26位碳向高场位移1.9ppm外，其余碳的δ值基本一致，即为22α-O螺甾构型。综合以上信息，化合物1的结构鉴定为：3-β-hydroxyspirost-5,25-diene-12-one(结构以及关键HMBC相关如下)，命名为huangjingsterol B。
表1化合物1的核磁氢谱和碳谱数据
Recorder in C5D5N
化合物2：(25R)-3-β-hydroxyspirost-5-en-12-one
分子式：C27H40O4 [分子量]428
白色粉末(甲醇)。Libermann–Burchard反应阳性。ESIMS m/z：429[M+H]+，451[M+Na]+；1HNMR(600MHz，C5D5N)δ：5.38(1H，m，H-6)，1.32(3H，d，J＝6.6Hz，H-21)，1.13(3H，s，H-18)，1.05(3H，s，H-19)，0.71(3H，d，J＝6.0Hz，H-27)。13CNMR(150MHz，C5D5N)δ：37.5(C-1)，30.7(C-2)，71.1(C-3)，43.3(C-4)，141.9(C-5)，120.9(C-6)，31.7(C-7)，31.1(C-8)，52.6(C-9)，37.7(C-10)，37.8(C-11)，212.8(C-12)，55.1(C-13)，56.3(C-14)，31.7(C-15)，79.9(C-16)，54.2(C-17)，16.1(C-18)，19.2(C-19)，42.8(C-20)，14.1(C-21)，109.5(C-22)，31.9(C-23)，29.4(C-24)，30.7(C-25)，67.1(C-26)，17.5(C-27)。上述数据与文献(Ma K,Huang X F,Kong L Y.Steroidal saponins from Polygonatum cyrtonema[J].Chem NatCompd,2013,49(5):888-891.)报道基本一致，故鉴定化合物2为(25R)-3-β-hydroxyspirost-5-en-12-one，命名为huangjingsterol A。
化合物3：(25S)spirostan-5-en-12-one-3-O-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-[β-D-xylopyranosyl(1→3)]-O-β-D-glucopyranosyl(1→4)-β-D-galactopyranoside
分子式：C50H78O23 [分子量]1046
白色粉末(甲醇)。Libermann–Burchard反应阳性。ESIMS m/z：1047[M+H]+；1H-NMR(600MHz，C5D5N)δ：5.61(1H，d，J＝7.5Hz，H-Xyl-1)，5.27(1H，s，H-6)，5.26(1H，d，J＝8.0Hz，H-Glc'-1)，5.16(1H，d，J＝8.0Hz，H-Glc-1)，4.88(1H，d，J＝8.0Hz，H-Gal-1)，1.34(3H，d，J＝6.6Hz，H-21)，1.09(3H，s，H-18)，1.07(3H，d，J＝7.0Hz，H-27)，0.89(3H，s，H-19)。13C-NMR(150MHz，C5D5N)δ：37.2(C-1)，30.4(C-2)，77.6(C-3)，39.5(C-4)，141.3(C-5)，121.9(C-6)，32.2(C-7)，31.3(C-8)，52.7(C-9)，38.0(C-10)，37.5(C-11)，213.2(C-12)，55.4(C-13)，56.5(C-14)，32.0(C-15)，80.3(C-16)，54.4(C-17)，16.4(C-18)，19.3(C-19)，43.6(C-20)，14.2(C-21)，110.3(C-22)，26.8(C-23)，26.6(C-24)，28.0(C-25)，65.7(C-26)，16.7(C-27)，103.2(C-1')，73.7(C-2')，75.1(C-3')，80.3(C-4')，76.0(C-5')，61.0(C-6')，105.0(C-1”)，81.9(C-2”)，86.8(C-3”)，70.8(C-4”)，78.72C-5”)，62.8(C-6”)，105.4(C-1”')，75.4(C-2”')，78.8(C-3”')，71.3(C-4”')，77.8(C-5”')，67.4(C-6”')，105.6(C-1””)，75.8(C-2””)，77.6(C-3””)，70.5(C-4””)，67.4(C-5””)。上述数据与文献(Ma K,Huang X F,Kong L Y.Steroidal saponins from Polygonatum cyrtonema[J].Chem Nat Compd,2013,49(5):888-891.)报道基本一致，故鉴定化合物3为(25S)spirostan-5-en-12-one-3-O-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-[β-D-xylopyranosyl(1→3)]-O-β-D-glucopyranosyl(1→4)-β-D-galactopyranoside，命名为黄精皂苷A1。
化合物4：(25S)spirostan-5-en-12-one-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→3)]-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-galactopyranoside
分子式：C51H80O24 [分子量]1076
白色粉末(甲醇)。Libermann–Burchard反应阳性。ESIMS m/z：1077[M+H]+；1H-NMR(600MHz，C5D5N)δ：5.59(1H，d，J＝7.5Hz，H-Xyl-1)，5.47(1H，s，H-6)，5.28(1H，d，J＝7.9Hz，H-Glc”-1)，5.13(1H，d，J＝7.9Hz，H-Glc'-1)，4.86(1H，d，J＝7.6Hz，H-Gal-1)，1.32(3H，d，J＝6.5Hz，H-21)，1.05(3H，d，J＝7.0Hz，H-27)，0.89(3H，s，H-19)，1.08(3H，s，H-18)。13C-NMR(150MHz，C5D5N)δ：37.2(C-1)，30.4(C-2)，77.6(C-3)，39.5(C-4)，141.3(C-5)，121.9(C-6)，32.2(C-7)，31.3(C-8)，52.7(C-9)，38.0(C-10)，37.5(C-11)，213.2(C-12)，55.4(C-13)，56.5(C-14)，32.0(C-15)，80.3(C-16)，54.4(C-17)，16.4(C-18)，19.3(C-19)，43.6(C-20)，14.2(C-21)，110.3(C-22)，26.8(C-23)，26.6(C-24)，28.0(C-25)，65.7(C-26)，16.7(C-27)，103.(C-1')，73.7(C-2')，75.1(C-3')，80.3(C-4')，76.0(C-5')，61.0(C-6')，105.0(C-1”)，81.9(C-2”)，86.8(C-3”)，70.8(C-4”)，78.7(C-5”)，62.8(C-6”)，105.4(C-1”')，75.4(C-2”')，78.8(C-3”')，71.3(C-4”')，77.8(C-5”')，67.4(C-6”')，105.6(C-1””)，75.8(C-2””)，77.6(C-3””)，70.5(C-4””)，67.4(C-5””)，62.4(C-6””)。上述数据与文献(Ma K,Huang X F,Kong L Y.Steroidal saponins from Polygonatumcyrtonema[J].Chem Nat Compd,2013,49(5):888-891.)报道基本一致，故鉴定化合物2为(25S)spirostan-5-en-12-one-3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-O-[β-D-Glucopyranosyl-(1→3)]-O-β-D-glucopyranosyl-(1→4)-β-D-Galacto pyranoside，命名为黄精皂苷A2。
实施例3黄精甾体皂苷元和皂苷单体成分对神经细胞损伤的保护实验
1.单体成分对Aβ25～35所致AD细胞模型的保护作用
1.1实验材料
PC12细胞购置于中国科学院上海细胞库；Aβ25～35(Sigma-Aldrich,A4459038M4822V，USA)；Fetal bovine serum(Gibico,10437028 1896732,Mexico Origin)；Horse Serum(Gibico,16050122,New Zealand Origin)；RPMI Medium 1640 basic(Gibco,8118262,China)；Penicillin-Streptomycin Liquid(Solarbio,P1400 20180907,China)；Poly-L-lysine Solution,10×(Solarbio,P2100 20180115,China)；MTT(Solarbio,M8180829Z0511,China)；DMSO(Solarbio,D8370 520C0320,China)；PBS(Solarbio,P102020180910,China)。Annexin V-FITC/Hoechst33342细胞凋亡检测试剂盒(贝博生物，批号：BB130082)。β-Actin Mouse Monoclonal Antibody(affinity，T0022)；Bax Antibody(CellSignaling，0012)；Anti-Bcl2 antibody(abcam，ab7973)；Anti-Caspase-3(abcam，ab32351)。
1.2实验仪器
CO2培养箱(SANYO，MCO-750)；酶标仪(Biotek，ELx800)；超净工作台(苏州净化设备厂)；高速冷冻离心机(AllegraTMX-12R，Beckman Coulter)；倒置显微镜(Leica，DMI3000B)；型电热压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业医疗设备厂，YXQ-LS-SII)；水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂，HH-S)；移液枪(GILSON，法国)；In Cell Analysis 6000(GE，美国)。电泳仪、垂直电泳槽、转移槽(Bio-Rad)；EC3凝胶成像系统(UVP，美国)；多标记检测仪(VITOR 1420，Perkin Elmer)。
1.3实验方法
1.3.1对Aβ25～35损伤所致PC12细胞存活率的影响
取对数生长期PC12神经细胞以4×105密度接种于96孔板，100μL/孔，分为空白组，模型组，黄精甾体皂苷元A、B组，黄精皂苷A1、A2组，每组5个复孔。孵箱内培养24h。吸出培养基，给药组加入含药培养基100μL/孔，黄精甾体皂苷元、黄精皂苷终浓度为20、40、80μmol/L；空白组和模型组加入空白培养基100μL/孔。模型组和给药组，每孔加入2μL的Aβ25～ 351mmol/L，终浓度为20μmol/L。继续培养48h。每孔加入20μL的MTT，培养4h。吸去培养基，每孔加入150μL DMSO，在摇床上摇匀10min，酶标仪570nm处测OD值。
1.3.2对Aβ25～35诱导的PC12细胞凋亡率的影响
收集对数生长期的PC12细胞，调整细胞密度为1×104/孔，96孔板中加入150μL/孔。分设空白组、模型组、黄精甾体皂苷元A、B组，黄精皂苷A1、A2组，黄精甾体皂苷元、黄精皂苷终浓度为40、80μmol/L，每组设5个复孔。在5％CO2、37℃细胞培养箱中孵育12h，使细胞单层贴壁，此时加入培养基、药物组稀释到相应浓度的培养基每孔100μL，24h后模型组和给药组加入造模药Aβ25～35，使其终浓度为30μmol/L；48h后吸出培养基，PBS清洗3遍，在400μL×Annexin V结合液中加入5μL Annexin V-FITC染色液和10μL PI染色液后轻轻混匀，以50μL/孔加入培养板，2-8℃避光，孵育15min；加入Hoechst33342，每孔2μL，常温避光孵育5min；In Cell Analysis 6000进行分析。
1.3.3对Aβ25～35所致AD细胞模型凋亡相关蛋白表达量的影响(WB法)
取对数生长期PC12细胞，轻吹打至完全脱落，离心去上清液。培养基重悬细胞后，以4×105个/ml的浓度接种于培养皿中；分设空白组、模型组、黄精甾体皂苷元A、B组，黄精皂苷A1、A2组，黄精甾体皂苷元、皂苷终浓度为40、80μmol/L，每组5个复孔，37℃，5％CO2恒温培养箱中培养12小时；去上清液，空白组和模型组每个培养皿加入100μl的空白培养基，其余各给药组加入相应的含药培养基。37℃，5％CO2恒温培养箱中继续培养24小时；模型组和各个给药组加入Aβ25～35使其终浓度为30μmol/L，继续培养24h；吸去上清液，用PBS清洗三遍，每个培养皿加入1ml含10％PMSF的蛋白提取试剂，4℃裂解15min；在4℃，14000g离心10min；吸取细胞上清液转移至新的EP管中，于-20℃储存备用；用BCA试剂盒做蛋白定量(OD570)；SDS-PAGE电泳及蛋白转移；免疫反应检测目的蛋白。
1.4实验结果
实验结果见表2、3、4。与空白组相比较，模型组细胞存活性明显下降，早期凋亡率、死亡率明显上升，抗凋亡因子Bcl-2的表达下降，促凋亡因子Bax和Caspase-3的表达降低，说明造模成功。从表2可看出与模型组比较，黄精甾体皂苷元A、B组和黄精皂苷A1、A2在20、40、80μmol/L OD值明显上升，提示以上化合物可明显提高Aβ25～35损伤所致的PC12细胞存活率；从表3可看出，与模型组比较，黄精甾体皂苷元A、B和黄精皂苷A1、A2在40、80μmol/L死亡率和早期凋亡率明显降低，存活率明显增高，提示黄精甾体皂苷元A、B和黄精皂苷A1、A2可减少Aβ25～35所致神经细胞凋亡。从表4可看出，与模型组比较，黄精甾体皂苷元A、B和黄精皂苷A1、A2在40、80μmol/L可提高抗凋亡因子Bcl-2的表达，同时可降低促凋亡因子Bax和Caspase-3的表达，提示黄精甾体皂苷元A、B和黄精皂苷A1、A2对神经细胞凋亡有明显的保护作用。
表2不同浓度炆黄精中甾体皂苷元、皂苷单体成分对Aβ25～35损伤所致PC12细胞存活率的影响(n＝5)/>
与正常对照组比较，#P<0.05,##P<0.01；与模型对照组比较*P<0.05,**P<0.01。
表3不同浓度炆黄精中甾体皂苷元、皂苷单体成分对Aβ25～35诱导的PC12细胞凋亡率的影响(n＝5)
与正常对照组比较，#P<0.05,##P<0.01；与模型对照组比较*P<0.05,**P<0.01。
表4不同浓度炆黄精中甾体皂苷元、皂苷单体成分对Aβ25-35所致AD细胞模型的Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响(n＝5)/>
备注：与正常对照组比较，#P<0.05,##P<0.01；与模型对照组比较*P<0.05,**P<0.01。
2.黄精甾体皂苷元单体成分对Aβ25～35所致的原代海马神经元细胞AD模型存活率的影响
2.1实验方法提取乳鼠海马细胞并进行培养，MAP2/FITC染色法对海马细胞进行鉴定。调整细胞混悬液浓度，接种于预先用0.1％多聚赖氨酸包被过夜的96孔板中加入150μl/孔，调整细胞密度为1×104/孔。分设空白组、模型组、黄精甾体皂苷元A、B组，黄精皂苷A1、A2组，黄精甾体皂苷元、黄精皂苷终浓度为40、80μmol/L，每组设5个复孔；在5％CO2，37℃细胞培养箱中培养至第7天，使细胞单层贴壁，此时加入生长培养基、稀释到相应浓度含药培养基每孔100μL、模型组和给药组加入造模药Aβ25～35，使其终浓度为20μmol/L；5％CO2，37℃条件下孵育48h；每孔加入50μl，MTT(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h；小心吸去孔内培养液，每孔加入100μl DMSO，置摇床上低速振荡10～15min，使结晶充分溶解。在酶标仪上选择570nm波长测量各孔OD值。
2.2实验结果结果见表5。与空白组比较，模型组OD值明显下降，说明造模成功；与模型组比较，黄精皂苷A和黄精皂苷B在40、80μmol/LOD值明显上升，提示以上化合物对Aβ25～35所致的原代海马神经元细胞损伤有明显的保护作用。
表5不同浓度炆黄精中甾体皂苷元、皂苷单体成分对海马细胞活性的影响(n＝5)/>
与正常对照组比较，#P<0.05,##P<0.01；与模型对照组比较*P<0.05,**P<0.01。
3.小结
以上结果说明，上述炆黄精中两个甾体皂苷元单体和两个皂苷对Aβ所致的PC12神经细胞和原代海马神经元细胞损伤都有保护作用。提示炆黄精中的甾体皂苷元和皂苷可能是炆黄精抗老年痴呆的活性成分。

Claims (1)

1.一种黄精甾体皂苷元的制备方法，所述黄精甾体皂苷元结构如下：
所述R1代表＝CH2或者-CH3，R2代表H；
包括如下步骤：
(1)取多花黄精的干燥根茎，炆法炮制后，70％乙醇水溶液提取，用二氯甲烷萃取，浓缩制得浸膏；
(2)二氯甲烷浸膏部分用甲醇溶解后，干法上硅胶柱，以二氯甲烷-甲醇溶液洗脱，二氯甲烷与甲醇的体积比为20:1，洗脱2.5个柱体积；取干柱部分，自下而上切成5份，取第1份上硅胶柱，以体积比20:1～1:1的石油醚-乙酸乙酯溶液梯度洗脱3个柱体积，依次得22个组分，在ODS柱上对第17组分进行色谱分离，并用体积比为20:80～70:30甲醇-水溶液线性梯度洗脱，依次得到5个组分，取第2组分经高效液相制备色谱柱，以体积比为65:35的甲醇–水溶液洗脱，得到黄精甾体皂苷元。
CN201910790868.9A 2019-08-26 2019-08-26 一种黄精甾体皂苷元及其制备方法与应用 Active CN110507662B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910790868.9A CN110507662B (zh) 2019-08-26 2019-08-26 一种黄精甾体皂苷元及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910790868.9A CN110507662B (zh) 2019-08-26 2019-08-26 一种黄精甾体皂苷元及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110507662A CN110507662A (zh) 2019-11-29
CN110507662B true CN110507662B (zh) 2023-10-13

Family

ID=68627848

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910790868.9A Active CN110507662B (zh) 2019-08-26 2019-08-26 一种黄精甾体皂苷元及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110507662B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113960225B (zh) * 2021-10-11 2023-06-20 安徽师范大学 一种基于化学成份鉴别不同类型多花黄精的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1440979A (zh) * 2003-04-04 2003-09-10 沈阳药科大学 中药黄精中的甾体皂苷及其医药用途和制备方法
CN107006559A (zh) * 2017-05-24 2017-08-04 浙江财经大学 一种黄精药膳酥的加工方法
CN111202241A (zh) * 2020-01-16 2020-05-29 山东东兴源食品有限公司 黄精加工方法和黄精制品

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1440979A (zh) * 2003-04-04 2003-09-10 沈阳药科大学 中药黄精中的甾体皂苷及其医药用途和制备方法
CN107006559A (zh) * 2017-05-24 2017-08-04 浙江财经大学 一种黄精药膳酥的加工方法
CN111202241A (zh) * 2020-01-16 2020-05-29 山东东兴源食品有限公司 黄精加工方法和黄精制品

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"STEROIDAL SAPONINS FROM Polygonatum cyrtonema";Ke Ma, Xuefeng Huang,等。;《Chemistry of Natural Compounds》;20130930;第一页最后一段。 *
"黄精属植物甾体皂苷的分子进化及其化学分类学意义";杨崇仁，等。;《云南植物研究》;20071015;第593页，"2黄精属植物C－27甾体皂苷的分子多样性"，第596页表3黄精属植物中的甾体苷元，参见第598页左栏最后一段和右栏第一段。 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110507662A (zh) 2019-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wang et al. In vitro anti-cancer activity and structure–activity relationships of natural products isolated from fruits of Panax ginseng
CN110627861B (zh) 一种知母甾体皂苷化合物及其制备方法和应用
Li et al. Triterpenes possessing an unprecedented skeleton isolated from hydrolyzate of total saponins from Gynostemma pentaphyllum
CN102504006A (zh) 一组伊贝母中的甾体皂苷类化合物
Zhang et al. Discovery of cardio-protective constituents of Gualou Xiebai Decoction, a classical traditional Chinese medicinal formula
Xue et al. Cardenolide glycosides from root of Streptocaulon juventas
Sang et al. New steroid saponins from the seeds of Allium tuberosum L.
CN110507662B (zh) 一种黄精甾体皂苷元及其制备方法与应用
CN112300242B (zh) 一种呋甾皂苷类化合物单体的制备方法
CN112915096B (zh) 刺囊酸-28-O-β-D-葡萄糖苷的制药用途
CN103610682B (zh) 3α-羟基-30-齐墩果-12,20(29)-二烯-28-酸的制备方法和在制备抗肿瘤药物中的应用
CN108558980B (zh) 从鹊肾树根部分离的具有抗肿瘤活性的强心苷类化合物及其应用
CN111825735A (zh) 达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物及其制备和应用
CN113214214B (zh) 关苍术中一种萜类化合物的制备方法和应用
CN109761977B (zh) 一种黄精生物碱c及其制备方法与应用
Yan et al. Pregnane glycosides from Adonis amurensis and their bioactivity
Li et al. Four new immunomodulating steroidal glycosides from the stems of Stephanotis mucronata
CN111303238B (zh) 甾体皂苷类化合物及其制备方法和医药用途
CN110204589B (zh) 青葙子有效成分、提取方法及其在制备神经保护药物方面的应用
Ye et al. Minor cytotoxic cardenolide glycosides from the root of Streptocaulon juventas
WO2012061954A1 (zh) 具有抗癌活性的黄姜盾叶新苷的制备方法和用途
Song et al. Anti-inflammatory constituents from Caulis Trachelospermi
Zhu et al. C21 steroids from Streptocaulon juventas (Lour) Merr. induce apoptosis in HepG2
CN111187327B (zh) 一种从小驳骨中提取三萜类化合物驳骨萜a的方法及其应用
CN112047887B (zh) 一种宽筋藤酰胺及其制备方法与应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant