CN111825735A - 达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，涉及达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物及其制备方法和应用。本发明通过将植物来源的达玛烷皂苷的酸水解产物或分离后的皂苷元灌胃给予SD大鼠，收集7周的生物样本，并采用乙酸乙酯进行样本物的提取，而后对提取所得浸膏进行分离纯化后，依赖于化学和光谱实验精确鉴定其结构，并探讨其生物合成途径的推导过程。本发明对该衍生物进行抗癌生物活性评价及机制研究，结果表明，本发明制备的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物具有明显的抗癌作用。可以用于制备治疗癌症的药物。
Description
技术领域：
本发明属于医药技术领域，涉及达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物及其制备方法和应用，具体涉及达玛烷皂苷元体内生物转化的一系列具有新代谢位点的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物及其制备方法和在制备抗癌药物中的应用。
背景技术：
达玛烷皂苷元通过其母核构架主要可分为达玛烷型，奥克梯隆型，齐墩果烷型以及其他类。齐墩果烷型皂苷为五环三萜达玛烷皂苷元，但是在目前的研究中，发现了Ro，Ri这两种达玛烷皂苷元为齐墩果烷型母核。达玛烷型皂苷则主要为四环三萜类结构。习惯性按其母核上羟基数量划分为二醇型(如Ra1，Ra2，Rb1， Rb2，Rb3，Rc，Rd，Rg3和Rh等)和三醇型(如Re，Rg2，Rf和Rh)，其区别在于：二醇型为C-3，C-12，C-20位各含有一个羟基位。而三醇型则是在C-3，C-6， C-12，C-20位各含有一个羟基。
人参、西洋参、三七等为五加科人参属植物，现代科学研究，从人参、西洋参、三七等植物中发现的大量达玛烷皂苷元类成分是本属植物中的主要功能物质。在本属植物的地上部分(茎叶)的研究中也发现了结构相同和相似的达玛烷皂苷元类衍生物。目前，国内的一类抗癌新药“参一胶囊”已经于2003年上市，新药的主要成分为人参中发现的二醇组双糖苷—达玛烷皂苷元Rg3。这为人参属植物的充分利用和开发成药用资源提供了重要机遇和依据。本课题组大量的前期研究已证明，来自人参属植物的人参，西洋参和三七茎叶中的达玛烷皂苷元及其衍生物具有抗肿瘤活性。尤其对本课题组发现的20(R)-25-甲氧基-原人参二醇和 20(R)-25-羟基-原人参二醇及其同系物的系列研究，首次发现了达玛烷皂苷元侧链结构变化产生的新构效关系成为达玛烷型衍生物结构修饰过合成研究的热点课题。
达玛烷类化合物在人参属植物中大量存在。现代药理学研究表明，达玛烷皂苷元具有显著的抗肿瘤、免疫调节和提高生命质量等多种生物活性，低剂量达玛烷皂苷元就可以促进肿瘤细胞向正常方向分化。因此，该成分在肿瘤防治中的研究和应用已经成为国际肿瘤治疗界的研究热点之一。在达玛烷型皂苷元的分类中，基于它们的糖苷配基，将它们分类为(20S)-原人参二醇和(20S)-原人参三醇基团。人参总皂苷及单体化合物对于促进癌细胞凋亡，促进分化，提高癌细胞对化疗药的敏感性，同时在提高机体的免疫力等方面有重要的作用，可用于多种癌症的预防阶段和治疗阶段。针对其抗肿瘤活性，本课题组以及其他的课题组进行了一系列的研究。郭玉梅等研究发现达玛烷皂苷元和低糖链的皂苷具有显著的抗肿瘤作用。在本课题组的研究中，25-甲氧基-原人参二醇(25-OCH3-PPD，AD-1)，是人参酸水解产物分离出来的有潜力的抗癌天然化合物。它表现出对多种癌细胞的活性，如乳腺癌，前列腺，肺癌，胃癌和胰腺癌。与已在中国被批准为癌症治疗药物的Rg3相比，该化合物对几种癌细胞系的生长具有10-100倍的细胞毒活性。经体内25-OCH3-PPD的药代动力学研究发现，在血浆中它可以代谢产生 25-OH-PPD。到目前为止，关于25-OCH3-PPD代谢的研究数量有限。仅检测了哺乳动物肝微粒体中的代谢，为了获得更多关于其代谢的信息以改善其临床应用，25-OCH3-PPD的代谢命运是必须理解的。
本发明通过口服给予大鼠25-OCH3-PPD后，从收集的粪便中发现了新的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物，同时也发现一种齐墩果烷皂苷元具有优异的抗肿瘤活性。所以本发明旨在发现活性更好的先导化合物，从而开发新的癌症抑制剂。
发明内容：
本发明的目的是提供一种达玛烷皂苷元体内生物转化衍生物，包括达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物，该系列衍生物具有生物合成途径可追溯的代谢规律和特征，代谢位点具有新颖性，扩环产物不仅代谢率高且具有更高的抗癌作用，本发明还提供了该类衍生物的制备方法。
本发明的技术方案如下：
本发明提供了经体内生物转化后制备得到的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物及其盐和异构体：
其中：
R为H、C1-C4烷基、羟基、C1-C4羧基、羟基取代的C1-C4烷基、C1-C4醛基；
所述的衍生物及其盐和异构体可以为：
本发明优选如下达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物及其盐和异构体：
式A中，R为H、C1-C4烷基、羟基取代的C1-C4烷基、C1-C4羧基；
式B中，R为H、C1-C4烷基、羟基、C1-C4醛基、羟基取代的C1-C4烷基、 C1-C4羧基；
式C中，R为H、C1-C4烷基；
式D中，R为H、C1-C4烷基；
式E中，R为H、C1-C4烷基；
式F中，R为H、C1-C4烷基；
式G中，R为H、C1-C4烷基；
本发明优选如下达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物及其盐和异构体：
本发明以大鼠灌胃给予母药：20(R)-25-甲氧基-原人参二醇，得到确定代谢位点和代谢规律，进行代谢谱和生物合成途径推测：
20(R)-25-甲氧基-原人参二醇
所述的达玛烷皂苷元来自于五加科植物人参、西洋参、三七等及葫芦科植物绞股蓝中总皂苷酸水解产物。
本发明提供了上述达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物的制备方法，包括以下步骤：
步骤1：灌胃药液的配制；
步骤2：大鼠灌胃，制备血液、尿液、粪便和胆汁的生物样品；
步骤3：步骤2得到的各生物样本浸膏进行柱层析分离，得到不同的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物1a,2a,4a,7a,1b,3b-7b,1c,5c,6d,1e,7e,5f,5g；
步骤4：根据步骤3得到的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元的结构，进行代谢谱和生物合成途径推测，根据本发明得到的确定代谢位点和代谢规律预测得到生物合成途径上可接受的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物3a,5a,6a, 8a-12a,2b,8b-12b,2c-4c,6c-12c,1d-5d,7d-12d,2e-6e,8e-12e,1f-4f,6f,1g-4g,6g；
具体地，本发明包括如下步骤：
步骤1：将五加科植物人参、西洋参、三七等及葫芦科植物绞股蓝中的皂苷酸水解产物或分离后的皂苷元，置于锥形瓶中，用尽量少的乙醇超声溶解，然后慢慢加入丙二醇，同时不断用玻璃棒搅拌，最后逐滴加蒸馏水，得到澄清透明无药品析出的灌胃药液；
步骤2：将步骤1得到的灌胃药液，根据大鼠重量给药(1mL/100g)，收集24h的生物样本(包括血液、尿液、粪便和胆汁)，经离心、过滤等处理后，置于冰箱中冻存。此过程持续7周后，将所得所有生物样本混合，进行超声提取、减压浓缩后，得到各生物样本浸膏；
步骤3：将步骤2得到的各生物样本浸膏进行柱层析分离，得到不同的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物1a,2a,4a,7a,1b,3b-7b,1c,5c,6d,1e,7e,5f, 5g；
步骤4：根据步骤3得到的不同的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元的结构，进行代谢谱和生物合成途径推测，根据本发明得到的确定代谢位点和代谢规律预测得到生物合成途径上可接受的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物3a,5a, 6a,8a-12a,2b,8b-12b,2c-4c,6c-12c,1d-5d,7d-12d,2e-6e,8e-12e,1f-4f,6f,1g-4g, 6g；
本发明制备得到的终产物1a,2a,4a,7a,1b,3b-7b,1c,5c,6d为达玛烷皂苷元主要为C-29位发生代谢转化，1e,7e为侧链环合达玛烷皂苷元衍生物，5f,5g为达玛烷皂苷元母核扩环生物转化为齐墩果烷皂苷元衍生物。
所述的步骤1中，用皂苷酸水解产物或分离后的皂苷元配制灌胃药液，配制溶剂为乙醇、丙二醇、纯净水的混合，乙醇：丙二醇：纯净水的体积比为 1:30-50:10-20。
所述的步骤2中，减压浓缩各生物样本时采用水浴恒温40～50℃；
所述的步骤3中：采用分段分离的方式：
首先进行粗分离，常压冲柱，分别使用石油醚：乙酸乙酯＝10～20:1，3～8:1， 1～2:1，1:2～5洗脱，分别得混合馏分1-10；
混合馏分4使用硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝5～3:1和半制备型HPLC-ELSD洗脱剂为85％-90％甲醇-水进行分离，得到衍生物5f和5g。
混合馏分5使用硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝1～2:1，再经乙酸乙酯重结晶和半制备型HPLC-ELSD(80％-90％甲醇-水)进行分离，得到一对差向异构体1e和7e，实现了手性物质的非手性柱拆分。
混合馏分7使用硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝2～3:1，分离得到粗品衍生物，经乙酸乙酯重结晶后得到衍生物1a，将重结晶母液使用半制备型 HPLC-ELSD(流动相为80％-90％甲醇-水)分离，得到一对差向异构体1a和7a，实现了手性物质的非手性柱拆分；
混合馏分8使用硅胶柱分离，梯度洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝1～3:1、1:1～3 得到8-1、8-2、8-3、8-4、8-5五个馏分，其中8-3馏分使用半制备型HPLC-ELSD (流动相为80％-90％甲醇-水)继续分离，得到衍生物4b。
混合馏分9使用硅胶柱分离，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝30～50:1、20～10:1、1～3:1，得到9-1、9-2、9-3、9-4、9-5五个馏分，通过半制备型HPLC-ELSD(流动相为75％-85％甲醇-水)进一步纯化馏分9-2得到衍生物2a、4a、1c和5c。
混合馏分10使用硅胶柱分离，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝30～50:1、20～10:1、 1～3:1，得到10-1、10-2、10-3、10-4四个馏分，馏分10-1通过半制备型HPLC-ELSD (流动相为70％-80％甲醇-水)进一步纯化得到衍生物6b和6d。馏分10-3通过半制备型HPLC-ELSD(流动相为70％-80％甲醇-水)进一步纯化得到衍生物3b。馏分10-4通过开放型ODS色谱柱分离，洗脱剂依次为10％～90％甲醇-水，得到的70％混合洗脱馏分，使用半制备型HPLC-ELSD(流动相为70％-80％甲醇-水) 进一步分离制备纯化，得到衍生物1b、5b和7d。
所述的步骤3中的化合物，由于化学结构中缺乏发色团，在其紫外(UV) 光谱中显示出不吸收。因此，紫外检测器不是检测三七皂苷及其微量代谢物的最佳工具。蒸发光散射检测器(ELSD)通常用于检测不具有UV吸收的化合物，其可适用于测定三七皂苷。
所述的步骤3中得到的化合物为：1a：20(R)-25-甲氧基-达玛烷-3β,12β,20- 三醇，2a：20(R)-达玛烷-3β,12β,20,25,29-五醇，4a：20(R)-25-甲氧基-3β,12β,20- 三羟基-达玛烷-4-羧酸，7a：20(S)-25-甲氧基-达玛烷-3β,12β,20-三醇,1b：20(R)- 达玛烷-3β,12β,20,25-四醇,3b：20(R)-3β,12β,20,25-四羟基-达玛烷-4-醛,4b： 20(R)-3β,12β,20,25-四羟基-达玛烷-4-羧酸，5b：20(R)-4-降达玛烷-3β,12β,20,25- 四醇，6b：20(R)-达玛烷-3β,4β,12β,20,25-五醇，7b：20(S)-达玛烷-3β,12β,20,25- 四醇，1c：20(R)-12β,20,25三羟基-达玛烷-3-酮，5c：20(R)-12β,20,25-三羟基-4- 降达玛烷-3-酮，6d：(20R,24R)-4-降达玛烷-3β,12β,20,25-五醇，1e：3β,12β,20(R)-20,25-环氧二甲烷-3,12-二醇，7e：3β,12β,20(S)-20,25-环氧二甲烷 -3,12-二醇，5f：3β,21α,22β-羟基-24-norolean-12-烯,5g：3β,21α-羟基-24- norolean-12-烯-22酮。
根据步骤3中所述的化合物结构进行代谢物生物合成分析，发现代谢衍生物主要由1a的C-25-去甲基化变为1b。然后经1b的C-29位多次氧化(3b→4b) 和脱羧(5b)后形成。由于1a，7a，1b和7b同时存在，并且20R异构体占优势，这表明脱水可以在C-20处发生，导致碳正离子的平衡。在动物中，羊毛甾醇转化为胆固醇，其中包括3个甲基的损失，侧链双键的减少，以及△5,6-双键的形成，以取代△8,9-双键。绵羊甾醇的C-4的两个角甲基与1a的相同。根据已经分离的代谢物的代谢途径分析，发现1a的代谢与动物中胆固醇的合成非常相似(去除C-4上有角甲基的过程)。可以推测出，由1a和1b代表的糖苷配基的代谢位点主要发生在C-29位，并且由此可以推导出相关的一系列代谢衍生物，这些衍生物没有制备分离得到的原因可能是代谢痕量或不稳定所致。
所述的步骤4中根据本发明得到的确定代谢位点和代谢规律预测得到生物合成途径上可接受的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物化合物为3a,5a,6a, 8a-12a,2b,8b-12b,2c-4c,6c-12c,1d-5d,7d-12d,2e-6e,8e-12e,1f-4f,6f,1g-4g,6g；
本发明目的提供一种达玛烷皂苷元体内生物转化衍生物，该系列衍生物具有生物合成途径可追溯的代谢规律和特征，代谢位点具有新颖性，扩环产物不仅代谢率高且具有更高的抗癌作用，本发明还提供了该类衍生物的制备方法。
本发明提供了达玛烷皂苷元本和齐墩果烷皂苷元衍生物及其生物合成途径上可接受的代谢位点变化、异构体和活性衍生物在制备抗癌药物中的应用。
有益效果：本发明提供了一系列达玛烷皂苷元代谢衍生物，该部分衍生物对癌细胞具有明显的抑制作用，因此本发明中具有抗癌作用的代谢衍生物可以应用于制备抗癌药物中。
附图说明
图1为细胞周期阻滞实验。
A：化合物5f作用MCF-7细胞。B：化合物3b作用IOSE144细胞。C：20(R)-25- 甲氧基-原人参二醇(AD-1)作用MCF-7细胞。
图2为5f诱导HO-8901细胞凋亡的机制。
通过蛋白质印迹试验在HO-8901细胞中检测Bax的易位和线粒体细胞色素 c(CytC)的释放。
数据表示为独立进行的一式三份实验的平均值±SD。*P<0.05，**P <0.01，***P<0.001。
具体实施方式：
代谢衍生物制备实施例1：
步骤1：称取达玛烷皂苷的酸水解产物或分离后的皂苷元400mg，置于100 mL锥形瓶中，用2mL乙醇使其超声溶解，然后慢慢加入68mL丙二醇，同时不断用玻璃棒搅拌，最后逐滴加入32mL蒸馏水，得到澄清透明无药品析出的灌胃药液；
步骤2：将步骤1得到的灌胃药液，根据大鼠重量给药(1mL/100g)，收集24h的生物样本(包括血液、尿液、粪便和胆汁)，经离心、过滤等处理后，置于冰箱中冻存。此过程持续7周后，将所得所有生物样本混合，进行超声提取、减压浓缩后，得到各生物样本浸膏；
步骤3：将步骤2得到的各生物样本浸膏进行柱层析分离，分别使用石油醚：乙酸乙酯＝10～20:1，3～8:1，1～2:1，1:2～5洗脱，分别得混合馏分1-10，混合馏分9使用硅胶柱分离，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝30～50:1、20～10:1、1～3:1，得到9-1、9-2、9-3、9-4、9-5五个馏分，通过半制备型HPLC-ELSD(流动相为82％甲醇-水)进一步纯化馏分9-2，得到新代谢衍生物2a、4a和5c。
20(R)-达玛烷-3β,12β,20,25,29-五醇(2a)
所得化合物2a为白色粉末。1H-NMR(pyridine-d5,400MHz,ppm):δH 1.67 (1H,m),0.92(1H,m),1.96(1H,m),1.39(1H,m),3.65(1H,m),0.95(1H,m),1.93 (1H,m),1.84(1H,m),1.61(1H,m),1.07(1H,m),1.52(1H,m),2.13(2H,m),3.95 (1H,td,J1,2＝5.1,J1,3＝10),2.05(1H,m),1.51(1H,m),1.27(1H,m),2.03(1H,m), 2.44(1H,m),0.96(3H,s),0.91(3H,s),1.43(3H,s),1.69(2H,m),1.74(1H,m),1.51 (1H,m),1.90(1H,m),1.55(2H,m),1.16(3H,s),1.16(3H,s),4.51(2H,d, J1,2＝10.86),1.56(3H,s),1.04(3H,s),3.17(3H,s)；13C-NMR(pyridine-d5,400MHz, ppm):δC 39.55(C-1),27.05(C-2),80.40(C-3),43.74(C-4),57.26(C-5),18.47(C-6), 31.82(C-7),40.45(C-8),50.95(C-9),37.55(C-10),32.84(C-11),71.20(C-12), 49.67(C-13),52.11(C-14),35.96(C-15),28.96(C-16),51.18(C-17),17.71(C-18), 17.21(C-19),73.60(C-20),23.22(C-21),44.25(C-22),19.55(C-23),41.56(C-24), 74.93(C-25),25.55(C-26),25.53(C-27),64.83(C-28),24.00(C-29),16.16(C-30), 49.33(OCH3).MS:m/z 531.4020[M+Na]+.
20(R)-25-甲氧基-3β,12β,20-三羟基-达玛烷-4-羧酸(4a)
所得化合物4a为白色粉末。1H-NMR(pyridine-d5,400MHz,ppm):δH 1.67 (1H,m),0.92(1H,m),1.96(1H,m),1.39(1H,m),3.38(1H,dd,J1,2＝3.78, J1,3＝11.70),1.048(1H,m),1.92(1H,m),1.84(1H,m),1.60(1H,m),1.08(1H,m), 1.54(1H,m),2.18(2H,m),3.97(1H,td,J1,2＝4.92,J1,3＝10.08),2.06(1H,m),1.54 (1H,m),1.39(1H,m),2.48(1H,m),1.94(1H,m),2.44(1H,m),0.98(3H,s),1.14 (3H,s),1.41(3H,s),1.68(2H,m),2.35(2H,m),1.54(2H,m),1.15(3H,s),1.15(3H, s),1.74(3H,s),1.12(3H,s),3.16(3H,s)；13C-NMR(pyridine-d5,400MHz,ppm):δC 40.28(C-1),27.07(C-2),78.59(C-3),50.06(C-4),57.47(C-5),18.46(C-6),31.80 (C-7),40.37(C-8),50.36(C-9),38.24(C-10),32.89(C-11),71.23(C-12),49.74 (C-13),52.20(C-14),35.75(C-15),29.67(C-16),51.21(C-17),17.67(C-18),14.93 (C-19),73.59(C-20),23.19(C-21),44.23(C-22),21.17(C-23),41.57(C-24),74.92 (C-25),25.55(C-26),25.52(C-27),25.10(C-29),16.12(C-30),49.33(OCH3).MS: m/z 523.3993[M+H]+.
20(R)-12β,20,25-三羟基-4-降达玛烷-3-酮(5c)
所得化合物5c为白色粉末。1H-NMR(pyridine-d5,400MHz,ppm):δH 1.84 (1H,m)；1.11(1H,m),2.39(1H,m)；2.28(1H,m),2.21(1H,td,J1,2＝6.5,J1,3＝12.9), 0.97(1H,s),1.38(1H,m)；1.18(1H,m),1.46(1H,m),2.13(1H,m)；1.63(1H,m), 3.92(1H,td,J1,2＝5.2,J1,3＝9.9),2.04(1H,m),1.58(1H,m)；1.03(1H,m),2.42(1H, m),1.05(3H,s),0.97(3H,s),1.42(3H,s),1.74(2H,m),2.12(1H,m)；2.05(1H,m), 1.73(2H,m),1.43(3H,s),1.43(3H,s),1.16(3H,s),1.07(3H,d,J1,2＝6.54),0.89(3H, s)；13C-NMR(pyridine-d5,400MHz,ppm):δC 40.80(C-1),37.96(C-2),212.4(C-3), 44.89(C-4),53.87(C-5),22.75(C-6),34.27(C-7),40.01(C-8),48.41(C-9),37.16 (C-10),32.98(C-11),71.01(C-12),49.72(C-13),52.14(C-14),31.73(C-15),27.03 (C-16),51.19(C-17),16.02(C-18),13.85(C-19),73.76(C-20),23.12(C-21),44.41 (C-22),19.09(C-23),45.96(C-24),70.08(C-25),30.59(C-26),30.30(C-27),12.40 (C-29),17.55(C-30).MS:m/z 485.3601[M+Na]+.
代谢衍生物制备实施例2：
步骤1：称取达玛烷皂苷的酸水解产物或分离后的皂苷元400mg，置于100 mL锥形瓶中，用2mL乙醇使其超声溶解，然后慢慢加入68mL丙二醇，同时不断用玻璃棒搅拌，最后逐滴加入32mL蒸馏水，得到澄清透明无药品析出的灌胃药液；
步骤2：将步骤1得到的灌胃药液，根据大鼠重量给药(1mL/100g)，收集24h的生物样本(包括血液、尿液、粪便和胆汁)，经离心、过滤等处理后，置于冰箱中冻存。此过程持续7周后，将所得所有生物样本混合，进行超声提取、减压浓缩后，得到各生物样本浸膏；
步骤3：将步骤2得到的各生物样本浸膏进行柱层析分离，分别使用石油醚：乙酸乙酯＝10～20:1，3～8:1，1～2:1，1:2～5洗脱，分别得混合馏分1-10，混合馏分8使用硅胶柱分离，梯度洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝1～3:1、1:1～3得到8-1、 8-2、8-3、8-4、8-5五个馏分，其中8-3馏分使用半制备型HPLC-ELSD(流动相为84％甲醇-水)继续分离，得到衍生物4b。
20(R)-3β,12β,20,25-四羟基-达玛烷-4-羧酸(4b)
所得化合物4b为白色粉末。1H-NMR(pyridine-d5,400MHz,ppm):δH 1.68 (2H,m),2.66(1H,m),1.41(1H,m),0.92(1H,m),1.24(1H,m),1.67(1H,m),1.06 (1H,m),3.48(1H,m),1.56(1H,m),1.28(1H,m),1.15(1H,m),1.40(1H,m),1.87 (1H,m),1.40(1H,m),1.87(1H,m),0.78(3H,s),0.77(3H,s),0.94(3H,s),1.25(2H, m),1.60(2H,m),1.23(2H,m),1.02(3H,s),1.02(3H,s),1.08(3H,s),0.91(3H,s)；13C-NMR(pyridine-d5,400MHz,ppm):δC40.46(C-1),25.78(C-2),77.45(C-3), 47.64(C-4),57.03(C-5),17.56(C-6),30.63(C-7),39.61(C-8),48.92(C-9),36.93 (C-10),31.49(C-11),69.87(C-12),48.14(C-13),51.10(C-14),35.06(C-15),29.62 (C-16),49.45(C-17),16.81(C-18),14.64(C-19),72.18(C-20),22.36(C-21),42.82 (C-22),20.25(C-23),44.53(C-24),68.92(C-25),29.45(C-26),29.30(C-27),180.34 (C-28),25.33(C-29),15.25(C-30).MS:m/z 531.5656[M+Na]+.
代谢衍生物制备实施例3：
步骤1：称取达玛烷皂苷的酸水解产物或分离后的皂苷元400mg，置于100 mL锥形瓶中，用2mL乙醇使其超声溶解，然后慢慢加入68mL丙二醇，同时不断用玻璃棒搅拌，最后逐滴加入32mL蒸馏水，得到澄清透明无药品析出的灌胃药液；
步骤2：将步骤1得到的灌胃药液，根据大鼠重量给药(1mL/100g)，收集24h的生物样本(包括血液、尿液、粪便和胆汁)，经离心、过滤等处理后，置于冰箱中冻存。此过程持续7周后，将所得所有生物样本混合，进行超声提取、减压浓缩后，得到各生物样本浸膏；
步骤3：将步骤2得到的各生物样本浸膏进行柱层析分离，分别使用石油醚：乙酸乙酯＝10～20:1，3～8:1，1～2:1，1:2～5洗脱，分别得混合馏分1-10，混合馏分10使用硅胶柱分离，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝30～50:1、20～10:1、1～3:1，得到10-1、10-2、10-3、10-4四个馏分，馏分10-1通过半制备型HPLC-ELSD(流动相为74％甲醇-水)进一步纯化得到新代谢衍生物6b和6d。
20(R)-达玛烷-3β,4β,12β,20,25-五醇(6b)
所得化合物6b为白色粉末。1H-NMR(pyridine-d5,400MHz,ppm):δH 1.78 (1H,m),0.99(1H,m),2.19(1H,m),1.87(1H,m),3.55(1H,dd,J1,2＝4.86, J1,3＝11.58),0.96(1H,s),1.59(1H,m),1.35(1H,m),1.58(1H,m),2.23(1H,m),1.69 (1H,m),3.99(1H,td,J1,2＝5.04,J1,3＝10.20),2.47(1H,m),1.63(1H,m),1.09(1H,m), 1.97(1H,m),1.40(1H,m),2.47(1H,m),1.16(3H,s),1.33(3H,s),1.43(3H,s),1.76 (2H,m),2.06(1H,m),1.95(1H,m),1.76(2H,m),1.44(3H,s),1.44(3H,s),1.59 (3H,s),0.99(3H,s)；13C-NMR(pyridine-d5,400MHz,ppm):δC 39.3(C-1),28.2 (C-2),76.0(C-3),74.5(C-4),55.10(C-5),30.6(C-6),35.4(C-7),40.3(C-8),40.1 (C-9),37.7(C-10),32.58(C-11),71.3(C-12),49.70(C-13),52.3(C-14),31.8(C-15), 27.1(C-16),51.19(C-17),16.02(C-18),13.85(C-19),73.76(C-20),23.12(C-21), 44.41(C-22),19.09(C-23),45.96(C-24),70.08(C-25),30.59(C-26),30.30(C-27), 26.1(C-29),17.7(C-30).MS:m/z 503.3653[M+Na]+.
(20R,24R)-4-降达玛烷-3β,12β,20,25-五醇(6d)
所得化合物6d为白色粉末。1H-NMR(pyridine-d5,400MHz,ppm):δH 1.79 (1H,m),1.31(1H,m),3.09(1H,m),1.31(1H,m),0.68(1H,s),1.48(1H,m),1.28 (1H,m),1.44(1H,m),2.23(1H,m),1.69(1H,m),3.62(1H,m),1.75(1H,m),1.06 (2H,m),1.85(1H,m),1.23(1H,m),2.08(1H,m),1.01(3H,s),0.87(3H,s),1.16 (3H,s),1.48(2H,m),1.61(2H,m),1.84(2H,m),1.26(3H,s),1.26(3H,s),0.96(3H, d,J1,2＝5.28),0.91(3H,s)；13C-NMR(pyridine-d5,400MHz,ppm):δC 38.38(C-1), 29.85(C-2),76.69(C-3),38.61(C-4),51.89(C-5),22.84(C-6),34.14(C-7),39.50 (C-8),48.27(C-9),36.61(C-10),31.8(C-11),71.27(C-12),48.61(C-13),51.93 (C-14),31.08(C-15),26.60(C-16),50.20(C-17),15.80(C-18),14.14(C-19),74.49 (C-20),22.15(C-21),43.19(C-22),21.03(C-23),44.36(C-24),71.19(C-25),29.60 (C-26),29.51(C-27),15.22(C-29),17.20(C-30).MS:m/z 481.3888[M+Na]+.
继续分离馏分10-3通过半制备型HPLC-ELSD(流动相为76％甲醇-水)进一步纯化得到新代谢衍生物3b。
20(R)-3β,12β,20,25-四羟基-达玛烷-4-醛(3b)
所得化合物3b为白色粉末。1H-NMR(pyridine-d5,400MHz,ppm):δH 1.75(1H, m),0.98(1H,m),2.25(1H,m),2.20(1H,m),3.63(1H,m),1.07(1H,m),1.87(1H, m),1.61(1H,m),1.45(1H,m),1.25(1H,m),3.61(1H,m),1.56(1H,m),1.03(1H, m),3.94(1H,m),2.02(1H,m),2.15(1H,m),1.93(1H,m),1.36(1H,m),2.43(1H, m),0.98(3H,s),0.82(3H,s),1.42(3H,s),1.74(2H,m),2.09(1H,m),1.73(1H,m), 1.74(2H,m),1.42(3H,s),1.50(3H,s),0.93(3H,s)；13C-NMR(pyridine-d5,400 MHz,ppm):δC 38.86(C-1),28.96(C-2),76.45(C-3),54.02(C-4),57.71(C-5),19.65 (C-6),35.30(C-7),40.19(C-8),50.05(C-9),37.63(C-10),31.76(C-11),71.08 (C-12),49.66(C-13),52.12(C-14),32.89(C-15),27.02(C-16),51.14(C-17),16.08 (C-18),17.09(C-19),73.75(C-20),23.18(C-21),44.43(C-22),19.10(C-23),45.98 (C-24),70.08(C-25),30.61(C-26),30.03(C-27),207.95(C-28),21.77(C-29),17.63 (C-30).MS:m/z 493.3888[M+H]+.
继续分离馏分10-4通过开放型ODS色谱柱分离，洗脱剂依次为10％～90％甲醇-水，得到的70％混合洗脱馏分，使用半制备型HPLC-ELSD(流动相为76％甲醇-水)进一步分离制备纯化，得到新代谢衍生物5b。
20(R)-4-降达玛烷-3β,12β,20,25-四醇(5b)
代谢衍生物制备实施例4：
步骤1：称取达玛烷皂苷的酸水解产物或分离后的皂苷元400mg，置于100 mL锥形瓶中，用2mL乙醇使其超声溶解，然后慢慢加入68mL丙二醇，同时不断用玻璃棒搅拌，最后逐滴加入32mL蒸馏水，得到澄清透明无药品析出的灌胃药液；
步骤2：将步骤1得到的灌胃药液，根据大鼠重量给药(1mL/100g)，收集24h的生物样本(包括血液、尿液、粪便和胆汁)，经离心、过滤等处理后，置于冰箱中冻存。此过程持续7周后，将所得所有生物样本混合，进行超声提取、减压浓缩后，得到各生物样本浸膏；
步骤3：将步骤2得到的各生物样本浸膏进行柱层析分离，分别使用石油醚：乙酸乙酯＝10～20:1，3～8:1，1～2:1，1:2～5洗脱，分别得混合馏分1-10，混合馏分4使用硅胶柱洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝5～3:1和半制备型HPLC-ELSD洗脱剂为87.5％甲醇-水进行分离，得到衍生物5f和5g。
3β,21α,22β-羟基-24-norolean-12-烯(5f)
所得化合物5f为白色粉末。1H-NMR(pyridine-d5,400MHz,ppm):δH 1.65(1H, m),1.01(1H,m),3.31(1H,td,J1,2＝5.16,J1,3＝10.5),0.73(1H,td,J1,2＝1.56,J1,3＝12.3),1.43(1H,m),1.35(1H,m),1.93(1H,m),1.28(1H,m),1.65(1H,m),2.06(2H,m), 5.37(1H,m),1.07(2H,m),2.61(1H,dd,J1,2＝3.60,J1,3＝13.68),2.11(1H,m),1.39 (1H,m),3.77(1H,d,J1,2＝2.70),3.86(1H,d,J1,2＝3.00),1.27(3H,m),0.9(3H,s), 1.07(3H,s),1.27(3H,s),1.30(3H,s),1.49(3H,s)；13C-NMR(pyridine-d5,400MHz, ppm):δC 38.99(C-1),31.96(C-2),76.13(C-3),39.62(C-4),52.18(C-5),21.52(C-6), 31.98(C-7),40.39(C-8),46.21(C-9),36.98(C-10),24.72(C-11),123.15(C-12), 145.06(C-13),42.60(C-14),21.03(C-15),27.89(C-16),36.95(C-17),44.46(C-18), 47.66(C-19),39.62(C-20),80.02(C-21),75.04(C-22),16.34(C-23),14.51(C-25), 17.51(C-26),26.86(C-27),22.73(C-28),32.49(C-29),21.75(C-30).MS:m/z 467.3496[M+Na]+.
3β,21α-羟基-24-norolean-12-烯-22酮(5g)
所得化合物5g为白色粉末。1H-NMR(pyridine-d5,400MHz,ppm):δH 1.65 (1H,m),1.03(1H,m),2.04(1H,m),1.85(1H,m),3.33(1H,m),1.58(1H,m),0.73 (1H,m),1.44(1H,m),1.26(1H,m),1.65(1H,m),1.28(2H,m),5.31(1H,m),1.69 (1H,m)；0.98(1H,m),2.41(1H,m),4.58(1H,s),0.93(3H,s),0.97(3H,s),2.01(3H, m),1.30(3H,s),0.90(3H,s)；13C-NMR(pyridine-d5,400MHz,ppm):δC 38.96(C-1), 31.98(C-2),76.12(C-3),39.61(C-4),52.18(C-5),21.46(C-6),32.56(C-7),40.02 (C-8),46.12(C-9),37.02(C-10),25.91(C-11),125.01(C-12),141.73(C-13),42.52 (C-14),25.66(C-15),28.71(C-16),46.23(C-17),48.17(C-18),40.54(C-19),48.44 (C-20),79.84(C-21),216.73(C-22),16.34(C-23),14.48(C-25),17.42(C-26),24.65 (C-27),21.53(C-28),29.23(C-29),19.26(C-30).MS:m/z 465.3339[M+Na]+.
实施例5：达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元代谢衍生物抗癌活性研究
1.细胞MTT实验
1.1药物与试剂
(1)达玛烷皂苷元代谢衍生物主要由达玛烷皂苷的酸水解产物或分离后的皂苷元灌胃给予大鼠后，从所收集的生物样品中分离到的代谢产物，纯度大于等于 97％。达玛烷皂苷酸水解产物，对照品由沈阳药科大学赵余庆教授实验室制备。离体试验先用DMSO溶解，然后用培养液稀释后加药。
受试药物的结构如表1所示：
表1
(2)试剂：
二甲基亚砜DMSO：购自美国sigma公司；
RPMI-1640培养基：购美国Invitrogen Gibco公司；
DMEM培养基：购自美国Invitrogen Gibco公司；
胎牛血清：购自美国Invitrogen Gibco公司；
细胞培养瓶：购于大连美仑生物技术有限公司；
96孔板：购于大连美仑生物技术有限公司；
其他耗材如口罩手套枪头等：购于沈阳莱博科贸有限公司。
1.2细胞株
株癌细胞：人脑胶质瘤细胞(U87)，宫颈癌细胞(Hela)，人乳腺癌细胞(MCF-7)，人肺癌细胞(A549)，人卵巢癌细胞(HO-8901)。2株正常细胞：人胃粘膜细胞(GES-1)，人卵巢上皮细胞(IOSE144)。
1.3实验方法
1.3.1细胞培养
6种肿瘤细胞养于无菌细胞间，温度37℃，相对湿度98％，含5％CO2、95％空气的培养箱内。培养基为加入10％牛血清FBS和1％双抗(100U青霉素和100 U链霉素以及50μM 2-巯基乙醇)的RPMI-1640、DMEM培养基。
1.3.2药物浓度的配制
分别称取化合物(分子摩尔质量×10-2mg)的量，用移液枪加入1mL DMSO，浓度为1mmoL/mL，再分别稀释10倍，5倍，2.5倍，1.25倍，浓度分别为0.1 μmoL/μL，0.2μmoL/μL，0.4μmoL/μL，0.8μmoL/μL。临用时用相应的培养液将其稀释为10，20，40，80μM进行实验。
1.3.3 MTT的测定方法
取对数生长期的肿瘤细胞制成单细胞悬液，以1×104/孔的密度接种于96孔板上，培养终体积为100μL/well，37℃，5％CO2的培养箱内培养，细胞贴壁培养24h后加药，分设在对照组、给药组，阳性对照药选择丝裂霉素C和达玛烷皂苷元-Rg3，每组设3个复孔。药物总体积100μL，于加药后的48小时每孔加入浓度为5mg/mL的MTT 10μL，轻微振荡混匀后，置于37℃培养箱继续培养。 4h后，取出96孔培养板，弃上清，每孔加入DMSO 100μL，于摇床上振荡10min，充分溶解蓝紫色的甲臜沉淀。在酶标检测仪上读取490nm下的各孔吸光度值(A490)，计算IC50值，以检测药物对细胞的毒性作用。
IC50值是指被测量的拮抗剂的半抑制浓度。即可使细胞凋亡至总数一半时的药物浓度，当用MTT比色法测定药物细胞毒性，加入药物溶液后，观察染色深浅，测定吸光度值，染色越浅，毒性越大。当计算得到的IC50值大于100μM时，我们一般认为药物对正常细胞基本没有毒性。
1.4实验结果
表2.达玛烷皂苷衍生物的抗肿瘤活性(IC50，μM)和细胞毒性(IC50，μM).
*：表示阳性对照组。
结果表明：本发明达玛烷皂苷元的代谢衍生物对各种肿瘤细胞均具有不同程程度的抑制作用，尤其化合物5f对人脑胶质瘤细胞(U87)，宫颈癌细胞(Hela)，人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)，人肺癌细胞(A549)，人卵巢癌细胞(HO-8901) 的抑制作用均较强，人卵巢癌细胞(HO-8901)更为显著，活性强于阳性对照以及原达玛烷皂苷元。同时所有化合物对正常细胞均显示出低毒或无毒。
实施例6：
由于化合物5f对人卵巢癌细胞(HO-8901)具有显著的抑制作用，我们进行化合物5f对于人卵巢癌细胞的机制研究。
1.确定细胞的形态变化
细胞用DOE处理48h后，在光学显微镜下观察其形态变化。将HO-8901 细胞(1.0×105个细胞/孔)与DOE一起温育24小时，并用5f处理12小时。将对照细胞暴露于0.1％DMSO。将细胞在4℃下用4％甲醛固定1h。固定后，用 5μM 4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)和碘化丙锭(PI)(50μg/mL PI,50μg/mL RNase，0.1％柠檬酸钠和0.1％Triton X-100,pH8.0)处理细胞。在37℃，黑暗中保持10min。在荧光显微镜下观察细胞。
荧光染色实验观察显示，用5f处理的HO-8901细胞显示出泡状区域，其可能是凋亡小体。结果表明HO-8901细胞可能经历了由5f引起的细胞凋亡(图 1-A)。
2.检测细胞凋亡
根据膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒(Abcam)，通过膜联蛋白V染色和 PI染色测定5f诱导的凋亡情况。简而言之，在分析之前，用测试化合物(0,10, 20μM)处理接种在96孔板中孵育12h的HO-8901细胞(2.0×10 5细胞/孔)12 h。早期凋亡中的细胞单独为膜联蛋白V-FITC阳性，并通过流式细胞术(Beckman Coulter，USA)计数。分析细胞凋亡率。
结果表明，HO-8901癌细胞系在暴露于10μM和20μM的药物浓度中后表现出显着的细胞凋亡增加。在HO-8901细胞中用母药AD-1(20μM)处理后未检测到凋亡细胞(如图1-B所示)。
3.蛋白质印迹分析
使用RIPA裂解缓冲液提取总细胞蛋白，并通过BCA(二辛可宁酸)测定法测定上清液的蛋白质浓度。SDS-PAGE在10％凝胶中进行，每个泳道含有等量的蛋白质。电泳后，将分离的蛋白质条带转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。用TBST缓冲液中的5％牛血清白蛋白(BSA)封闭PVDF膜1h。封闭后，将膜与1:1000稀释的一抗Cl-caspase-3，Cl-caspase-9，PARP，Cytochrome C，Bax，或β-肌动蛋白一起温育，在4℃过夜。在随后的洗涤步骤后，将PVDF膜与1： 5000稀释的与过氧化物酶缀合的第二抗体在室温下温育2h，并用含有0.1％Tween-20的TBST洗涤三次。使用增强的化学发光系统(Kodak)在X射线胶片上显现阳性条带。
通过蛋白质印迹评估HO-8901细胞中的Cl-caspase-3，Cl-caspase-9和切割的PARP的表达水平结果，图1-C显示在5f处理后，Cl-caspase-3，Cl-caspase-9和裂解的PARP的表达水平被激活。同时图2显示，Bax水平在细胞质中减少，伴随着线粒体部分的相应增加。此外，可以在5f处理的HO-8901细胞中观察到线粒体细胞色素C的释放。这些结果证实5f的促细胞凋亡特征是通过线粒体途径起作用的。
实施例7：
由于化合物5f对人前列腺癌LNCaP细胞株，人前列腺癌PC3细胞株具有显著的抑制作用，我们进行化合物5f对人前列腺癌细胞的裸鼠体内抗肿瘤活性研究。
雌性Balb/c裸鼠65只，均在右前上肢腋窝皮下接种LNCaP小鼠前列腺癌细胞作为实验组，从接种之日起，每日称量体重和观察测量肿瘤体积，待瘤体积达100mm3时随机分为3组，即模型组6只、人参二醇PD(1e)组(20mg/kg) 6只、阳性药组(紫杉醇80mg/kg)6只。
阳性药组与5f组分别用生理盐水与DMSO按一定比例进行配置，模型组灌胃予以等量生理盐水。各组均每天灌胃给药治疗1次，共治疗3周，每三天观察记录各组小鼠体重与瘤体积。于治疗结束后第2天禁食不禁水，第三天裸鼠颈椎脱臼处死，剥离肿瘤，剖取肝、肾、脾，于分析天平称重，记录各组织质量，计算各组抑瘤率。
抑瘤率＝[1-(给药组平均瘤重/模型组平均瘤重)]×100％
实施例8：
由于化合物1e是代谢物分离过程中量最多的代谢物(>200mg)，且对人乳腺癌细胞(MDA-MB-231)具有显著的抑制作用，我们进行化合物1e对人乳腺癌细胞的裸鼠体内抗肿瘤活性研究。
雌性Balb/c裸鼠65只，均在右前上肢腋窝皮下接种Mdamb231小鼠乳腺癌细胞作为实验组，从接种之日起，每日称量体重和观察测量肿瘤体积，待瘤体积达100mm3时随机分为3组，即模型组6只、人参二醇PD(1e)组(20 mg/kg)6只、阳性药组(紫杉醇80mg/kg)6只。
阳性药组与1e组分别用生理盐水与DMSO按一定比例进行配置，模型组灌胃予以等量生理盐水。各组均每天灌胃给药治疗1次，共治疗3周，每三天观察记录各组小鼠体重与瘤体积。于治疗结束后第2天禁食不禁水，第三天裸鼠颈椎脱臼处死，剥离肿瘤，剖取肝、肾、脾，于分析天平称重，记录各组织质量，计算各组抑瘤率。
抑瘤率＝[1-(给药组平均瘤重/模型组平均瘤重)]×100％
Claims (10)
1.具有A、B、C、D、E、F或G结构所示的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物：
其中，R为H、C1-C4烷基、羟基、C1-C4羧基、羟基取代的C1-C4烷基、C1-C4醛基。
2.权利要求1所述的具有A、B、C、D、E、F或G结构所示的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物，选自：
3.权利要求1所述的具有A、B、C、D、E、F或G结构所示的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物，
其中，
式A中，R为H、C1-C4烷基、羟基取代的C1-C4烷基、C1-C4羧基；
式B中，R为H、C1-C4烷基、羟基、C1-C4醛基、羟基取代的C1-C4烷基、C1-C4羧基；
式C中，R为H、C1-C4烷基；
式D中，R为H、C1-C4烷基；
式E中，R为H、C1-C4烷基；
式F中，R为H、C1-C4烷基；
式G中，R为H、C1-C4烷基。
4.权利要求1-3任何一项所述的具有A、B、C、D、E、F或G结构所示的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物，选自：
5.一种药物组合物，包含权利要求1-4中任何一项所述的具有A、B、C、D、E、F或G结构所示的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物中的一种或几种和药学上可接受的载体。
6.如权利要求2所述的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物的制备方法，其特征在于，
步骤1：灌胃药液的配制；
步骤2：大鼠灌胃，制备血液、尿液、粪便和胆汁的生物样品；
步骤3：步骤2得到的各生物样本浸膏进行柱层析分离，得到不同的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物1a,2a,4a,7a,1b,3b-7b,1c,5c,6d,1e,7e,5f,5g；
步骤4：根据步骤3得到的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元的结构，进行代谢谱和生物合成途径推测，根据本发明得到的确定代谢位点和代谢规律预测得到生物合成途径上可接受的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物3a,5a,6a,8a-12a,2b,8b-12b,2c-4c,6c-12c,1d-5d,7d-12d,2e-6e,8e-12e,1f-4f,6f,1g-4g,6g。
7.如权利要求6所述的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物的制备方法，其特征在于，
步骤3中，采用分段分离的方式，首先进行粗分离，常压冲柱，分别使用石油醚：乙酸乙酯＝10～20:1，3～8:1，1～2:1，1:2～5洗脱，分别得混合馏分1-10；
混合馏分4使用硅胶柱和半制备型HPLC-ELSD分离，硅胶柱层板洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝5～3:1，半制备型HPLC-ELSD的流动相为85％-90％甲醇-水进行分离，得到衍生物5f和5g；
混合馏分5使用硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝1～2:1，再经乙酸乙酯重结晶和半制备型HPLC-ELSD进行分离，流动相为80％-90％甲醇-水，得到一对差向异构体1e和7e；
混合馏分7使用硅胶柱分离，洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝2～3:1，分离得到粗品衍生物，经乙酸乙酯重结晶后得到衍生物1a，将重结晶母液使用半制备型HPLC-ELSD分离，流动相为80％-90％甲醇-水，得到一对差向异构体1a和7a；
混合馏分8使用硅胶柱分离，梯度洗脱剂为石油醚：乙酸乙酯＝1～3:1、1:1～3得到8-1、8-2、8-3、8-4、8-5五个馏分，其中8-3馏分使用半制备型HPLC-ELSD继续分离，流动相为80％-90％甲醇-水，得到衍生物4b；
混合馏分9使用硅胶柱分离，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝30～50:1、20～10:1、1～3:1，得到9-1、9-2、9-3、9-4、9-5五个馏分，通过半制备型HPLC-ELSD进一步纯化馏分9-2，流动相为75％-85％甲醇-水，得到衍生物2a、4a、1c和5c。
混合馏分10使用硅胶柱分离，洗脱剂为二氯甲烷：甲醇＝30～50:1、20～10:1、1～3:1，得到10-1、10-2、10-3、10-4四个馏分，馏分10-1通过半制备型HPLC-ELSD进一步纯化，流动相为75-85％甲醇-水，得到衍生物6b和6d；馏分10-3通过半制备型HPLC-ELSD进一步纯化，流动相为70％-80％甲醇-水，得到衍生物3b；馏分10-4通过开放型ODS色谱柱分离，洗脱剂依次为10％～90％甲醇-水，得到的70％混合洗脱馏分，使用半制备型HPLC-ELSD进一步分离制备纯化，流动相为70％-80％甲醇-水，得到衍生物1b、5b和7d。
8.如权利要求6所述的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物的制备方法，其特征在于，步骤1中灌胃药液的配制中，使用20(R)-25-甲氧基-原人参二醇配制灌胃药液，溶剂为乙醇、丙二醇、纯净水的混合，乙醇：丙二醇：纯净水的体积比为1:30-50:10-20。
9.权利要求1-4任何一项所述的具有A、B、C、D、E、F或G结构所示的达玛烷皂苷元和齐墩果烷皂苷元衍生物或权利要求5所述的药物组合物在制备抗肿瘤药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的肿瘤选自卵巢癌，肺癌，肝癌，结肠癌，胃癌，前列腺癌，胰腺癌，宫颈癌或乳腺癌。
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| CN101234117A (zh) * | 2008-02-20 | 2008-08-06 | 沈阳药科大学 | 一对新的人参皂苷元和它们的混合体的医药用途 |
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