CN112047887B - 一种宽筋藤酰胺及其制备方法与应用 - Google Patents

一种宽筋藤酰胺及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种从宽筋藤中提取到的新的宽筋藤酰胺A及其制备方法和应用。所述宽筋藤酰胺A，结构为

Description

一种宽筋藤酰胺及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于中药开发利用领域，具体涉及一种宽筋藤酰胺A及其制备方法与应用。
背景技术
藏药宽筋藤(Tinospora sinensis(Lour.)Merr.)，藏文名勒哲，是防己科青牛胆属植物中华青牛胆的干燥藤茎，是藏药中常用的药材。宽筋藤主要产于我国西藏东南部，海南，云南，广东、广西等地也有分布，资源丰富。宽筋藤功能清热解毒、祛风通络，镇心安神，临床上主要用于风湿骨痛、腰肌劳损等症，藏族地区民间用于防治衰老病和AD的有效药物。我们的前期研究发现宽筋藤提取物可明显减少AD模型大鼠的Aβ沉积、Tau蛋白过度磷酸化、海马神经元的损伤，并改善其学习记忆；宽筋藤中木脂素、萜类以及酰胺类成分对Aβ引起神经元损伤有保护作用，提示宽筋藤可能有良好的抗AD作用。
宽筋藤含有多种化学成分，主要包括二萜类，苯丙素类，倍半萜类，木脂素类，生物碱类，黄酮类等化学成分。其中萜类和苯丙素类成分在宽筋藤中量较大，为其主要药效成分，具有降血糖，抗炎，抑菌，抗病毒，降血脂等作用，现代临床常用于治疗糖尿病、高脂血症、类风湿性关节炎等疾病。宽筋藤属植物中所含酰胺类含量较低，目前发现种类较少，从宽筋藤共分离得到橙黄胡椒酰胺、橙黄胡椒乙酰胺(朱小芳,马亚娟,白文婷,等.宽筋藤脂溶性部位的化学成分分离鉴定[J].中国实验方剂学杂志:2019,25(02):163-168)、克罗酰胺K，顺式-克罗酰胺K，N-反式-阿魏酰酪胺(史生辉,钱帅,王庶,等.宽筋藤化学成分的研究(Ⅱ)[J].中成药,2017,39(09):1866-1869)、5-(1-methylpropyl)-3,6-dioxo-2-piperazineacetic acid、N-acetyl-1-ethyl ester glutamic acid等酰胺类化合物(塔娜.宽筋藤的化学成分与药理作用研究.中南民族大学硕士毕业论文，2018:p11-13)。其结构式如下所示：
Figure GDA0002145828090000011
Figure GDA0002145828090000021
发明内容
针对现有技术的问题，本发明提供了一种从宽筋藤中提取到的新的宽筋藤酰胺A及其制备方法和应用。
本发明具体技术方案如下：
一种宽筋藤酰胺A，具有如下结构：
Figure GDA0002145828090000022
本发明另一目的在于提供上述宽筋藤酰胺A的制备方法，包括如下步骤：
(1)取宽筋藤的干燥藤茎，乙醇溶液提取后(优选70％乙醇溶液加热回流提取，1-5小时)，使用正丁醇萃取，取正丁醇部分，优选进一步将正丁醇部分浓缩。
具体的操作为：取宽筋藤的干燥藤茎，切薄片，70％乙醇浸泡过夜，加热回流提取2h，滤过，提取2次，浓缩至无醇味，用正丁醇萃取，取正丁醇部分浓缩制得浸膏。
(2)取正丁醇部分，湿法上大孔树脂柱(优选D101)，依次用水、30％、50％、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液；
优选步骤(1)将正丁醇部分浓缩制得浸膏后，用20％乙醇溶解，湿法上大孔树脂柱，依次用水、30％、50％、70％的乙醇溶液各洗脱3个柱体积。
(3)将70％乙醇洗脱液与硅胶干法拌样，上硅胶柱，依次用二氯甲烷:甲醇的体积比为10:1,8:1,6:1,4:1的洗脱液洗脱，收集二氯甲烷:甲醇的体积比为4:1的洗脱部分；
优选70％乙醇洗脱液浓缩制得浸膏后，再用20％乙醇溶解后，用1.5倍重量的100-200目硅胶拌样，选择200-300目硅胶柱装柱，依次用二氯甲烷:甲醇的体积比为10:1,8:1,6:1,4:1的洗脱液各洗脱3个柱体积，收集二氯甲烷:甲醇的体积比为4:1的洗脱部分。
(4)取步骤(3)二氯甲烷:甲醇的体积比为4:1的洗脱部分上凝胶柱(优选SephadexLH-20)，甲醇洗脱，收集第二个柱体积部分，得到本发明所述宽筋藤酰胺A。
本发明另一目的在于提供宽筋藤酰胺A在制备治疗或预防阿尔茨海默症药物中的应用，所述宽筋藤酰胺A结构如下：
Figure GDA0002145828090000031
阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一种中老年常见的以渐行性记忆力减退、认知功能障碍、人格改变为特征的中枢神经系统退行性疾病，其特征性病理变化表现为皮层与海马胆碱能神经元缺失、神经细胞外β-淀粉样肽(Amyloid beta，Aβ)聚集形成老年斑(sennepfaques，SPs)、以及细胞内高度磷酸化Tau(p-Tau)蛋白形成神经原纤维缠结(neurofibrillarytangles，NFTs)。目前全球老年痴呆症病人已经超过4000万，随着世界人口老龄化的加剧，患者将持续增加，预计到2050年老年痴呆症患者人数将超过1.5亿，也就是85岁以上老人，每2人中就有1个老年痴呆症患者，因此对AD的防治已成为十分迫切的社会与医学问题。AD严重威胁老年人的生命安全，是继心脏病、癌症后的第3位死因，给家庭和社会带来严重的经济负担。
目前AD治疗药物主要有乙酰胆碱酯酶(AChE)抑制剂、N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体拮抗剂，但多为对症治疗，且疗效不确切、特异性不强、毒副作用大、不易透过血脑屏障等，限制了其临床应用，因此开发高效低毒AD防治药物一直是国内外医药界的研究热点。本发明从宽筋藤中分离得到系列酰胺类成分，特别是得到一种新的宽筋藤酰胺A，并对这一成分药理活性进行了研究，结果表明，宽筋藤酰胺A具有很好的预防、治疗AD的作用，具备开发为AD治疗药物的潜质。
附图说明
图1为宽筋藤酰胺A的1H NMR谱图。
图2为宽筋藤酰胺A的13C NMR谱图。
图3为宽筋藤酰胺A的DEPT135图。
图4为宽筋藤酰胺A的HSQC图。
图5为宽筋藤酰胺A的HSBC图。
图6为宽筋藤酰胺A的COSY图。
图7为宽筋藤酰胺A的质谱图。
具体实施方式
以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。
在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。
下面结合具体实例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。
实施例1宽筋藤中酰胺A的制备
1.药材来源
本发明所用宽筋藤药材为防己科植物青牛胆属中华青牛胆Tinospora sinensis的干燥根茎，购自西藏自治区拉萨药材市场，并经西藏医学院格桑次仁副教授鉴定，且留存标本在江西中医药大学药学院药理实验室。
2.仪器与试剂
Sephadex LH-20(瑞典Amersham Biosciences公司)；AEYELA SB-1000旋转蒸发仪(日本EYELA公司)；电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械厂)；1H NMR(600MHz)和13C NMR(150MHz)谱用Varian UNITY INOVA 600型超导核磁共振仪测定，以氘代试剂作标定；Micromass ZabSpec质谱仪(美国Micromass公司)；Sartorius BP211D型电子天平(德国赛托利斯集团)；柱色谱硅胶(100～200目)、薄层色谱硅胶(青岛海洋化工厂)；实验中所用试剂(石油醚、二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇、95％乙醇、无水乙醇、硫酸、甲酸等)为天津市富宇精细化工有限公司产品，均为分析纯；水为娃哈哈纯净水，氘代试剂DMSO-d6(美国剑桥公司CIL)；色谱乙腈和甲醇为上海安谱科学仪器有限公司产品。
3.宽筋藤酰胺A的制备与结构鉴定
取宽筋藤的干燥藤茎10公斤，切薄片，70％乙醇浸泡过夜，加热回流提取2h，滤过，提取2次，浓缩至无醇味，用正丁醇萃取，取正丁醇部分浓缩制得浸膏。
正丁醇部分用20％乙醇溶解，湿法上大孔树脂柱，依次用水、30％、50％、70％的乙醇溶液各洗脱3个柱体积，收集70％的乙醇溶液，浓缩制得浸膏，再用20％乙醇溶解后，用1.5倍重量的100-200目硅胶拌样，选择200-300目硅胶柱装柱，依次用二氯甲烷:甲醇的体积比为10:1,8:1,6:1,4:1的洗脱液洗脱，依次得到4个洗脱部分Fr1～Fr4，收集二氯甲烷:甲醇的体积比为4:1的洗脱部分Fr4。取洗脱部分Fr4上Sephadex LH-20凝胶柱，甲醇洗脱，收集第二个柱体积部分，得到宽筋藤酰胺A 35mg。
4.结构鉴定
白色透明针晶，易溶于甲醇，HR-ESI-MS显示m/z：219.1484[M+H]+，分子式为C13H18ON2。核磁共振1H-NMR谱(表1)显示二个双峰甲基信号：δH 0.4316(3H,d,J＝6.8)和δH0.7912(3H,d,J＝7.04)，结合峰裂分规律和耦合常数推测化合物中可能含有异丙基。核磁共振13C-NMR谱中δC 169.4121为羰基碳信号，δC 17.106和δC19.1105两个甲基碳信号。苯环上的碳信号δC137.0868,δC131.4809,δC129.5972,δC128.1968，信号积分比为1:2:2:1，结合苯环上质子信息δH7.19-7.29(5H,m)HMBC和HMQC谱确定结构中含有一取代苯环。HMBC和HMQC图谱显示显示6号位亚甲基氢与1′C，3′C和5′C相关，显示亚甲基与苯环相连。DEPT135谱显示，只有δC40.14一个亚甲基，结合碳谱信息，有两个季碳原子。核磁共振氢谱二个双峰甲基信号，通过HMBC和HMQC图谱可观察到如下两个甲基质子都分别与C-7相关，确定结构含有异丙基。
综合分析宽筋藤酰胺A的1H NMR、13C NMR、DEPT135、HSQC、HSBC、COSY和质谱(如图1～7所示)，将该化合物的氢谱和碳谱数据予以归属(见表1)。
综上所述，确认该化合物为：2-isopropyl-5-phenylmethyl-imidazolidinone-4-one，为一未见文献报道的新化合物，命名为宽筋藤酰胺A，结构如下：
Figure GDA0002145828090000051
表1宽筋藤酰胺A的核磁氢谱和碳谱数据(溶剂为甲醇，δin ppm,J in Hz)
Figure GDA0002145828090000052
实施例2宽筋藤酰胺A对神经细胞损伤的保护实验
1.宽筋藤酰胺A对Aβ25～35所致AD细胞模型的保护作用
1.1实验材料
PC12细胞购置于中国科学院上海细胞库；Aβ25～35(Sigma，053M4804V)；MTT细胞增殖及毒性检测试剂盒(Solarbio，20150708)；改良型RPMI Medium 1640培养基(Gibco，8115154)；胎牛血清(Gibico，1095513)；顶级马血清(江苏恩莫阿塞生物技术有限公司，WPX141002)；多聚赖氨酸(博士德生物，NO.10F03A03)；PBS(Solarbio，20160825)。AnnexinV-FITC/Hoechst33342细胞凋亡检测试剂盒(贝博生物，批号：BB130082)。β-Actin MouseMonoclonal Antibody(affinity，T0022)；Bax Antibody(Cell Signaling，0012)；Anti-Bcl2antibody(abcam，ab7973)；Anti-Caspase-3(abcam，ab32351)。
1.2实验仪器
CO2培养箱(SANYO，MCO-750)；酶标仪(Biotek，ELx800)；超净工作台(苏州净化设备厂)；高速冷冻离心机(AllegraTMX-12R，Beckman Coulter)；倒置显微镜(Leica，DMI3000B)；型电热压力蒸汽灭菌器(上海博讯实业医疗设备厂，YXQ-LS-SII)；水浴锅(江苏省金坛市医疗仪器厂，HH-S)；移液枪(GILSON，法国)；In Cell Analysis 6000(GE，美国)。电泳仪、垂直电泳槽、转移槽(Bio-Rad)；EC3凝胶成像系统(UVP，美国)；多标记检测仪(VITOR1420，Perkin Elmer)。
1.3实验方法
1.3.1宽筋藤酰胺A对Aβ25～35损伤所致PC12细胞存活率的影响
取对数生长期PC12神经细胞以4×105密度接种于96孔板，100μL/孔，分为空白组，模型组，宽筋藤酰胺A组，每组5个复孔。孵箱内培养24h。吸出培养基，给药组加入含药培养基100μL/孔，宽筋藤酰胺A终浓度为6.25、12.5、25.0μmol/L；空白组和模型组加入空白培养基100μL/孔。模型组和给药组，每孔加入2μL的Aβ25～351mmol/L，终浓度为20μmol/L。继续培养48h。每孔加入20μL的MTT，培养4h。吸去培养基，每孔加入150μLDMSO，在摇床上摇匀10min，酶标仪570nm处测OD值。
1.3.2宽筋藤酰胺A对Aβ25～35诱导的PC12细胞凋亡率的影响
收集对数生长期的PC12细胞，调整细胞密度为1×104/孔，96孔板中加入150μL/孔。分设空白组、模型组、宽筋藤酰胺A组，宽筋藤酰胺A终浓度为6.25、12.5、25.0μmol/L，每组设5个复孔。在5％CO2，37℃细胞培养箱中孵育12h，使细胞单层贴壁，此时加入培养基、药物组稀释到相应浓度的培养基每孔100μL，24h后模型组和给药组加入造模药Aβ25～35，使其终浓度为30μmol/L；48h后吸出培养基，PBS清洗3遍，在400μL×Annexin V结合液中加入5μLAnnexin V-FITC染色液和10μLPI染色液后轻轻混匀，以50μL/孔加入培养板，2-8℃避光，孵育15min；加入Hoechst33342，每孔2μL，常温避光孵育5min；用In Cell Analysis 6000进行拍照分析。
1.3.3宽筋藤酰胺A对Aβ25～35所致AD细胞模型凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达量的影响(WB法)
取对数生长期PC12细胞，轻吹打至完全脱落，离心去上清液。培养基重悬细胞后，以4×105个/ml的浓度接种于培养皿中；设8个组分别为空白、模型、宽筋藤酰胺A终浓度6.25、12.5、25.0μmol/L，每组3个复孔，37℃，5％CO2恒温培养箱中培养12小时；去上清液，空白组和模型组每个培养皿加入100μl的空白培养基，其余各给药组加入相应的含药培养基。37℃，5％CO2恒温培养箱中继续培养24小时；模型组和各个给药组加入Aβ25～35使其终浓度为30μmol/L，继续培养24h；吸去上清液，用PBS清洗三遍，每个培养皿加入1ml含10％PMSF的蛋白提取试剂，4℃裂解15min；在4℃，14000g离心10min；吸取细胞上清液转移至新的EP管中，于-20℃储存备用；用BCA试剂盒做蛋白定量(OD570)；SDS-PAGE电泳及蛋白转移；免疫反应检测目的蛋白。
1.4实验结果
实验结果见表2、表3、表4。通过SPSS19.0分析，与空白组相比较，模型组细胞存活性明显下降，早期凋亡率、死亡率明显上升，抗凋亡因子Bcl-2的表达下降，促凋亡因子Bax和Caspase-3的表达降低，说明造模成功。从表2可看出与模型组比较，宽筋藤酰胺A组在6.25、12.5、25.0μmol/L OD值明显上升，提示宽筋藤酰胺A可明显提高Aβ25～35损伤所致的PC12细胞存活率；从表3可看出，与模型组比较，宽筋藤酰胺A在6.25、12.5、25.0μmol/L死亡率和早期凋亡率明显降低，存活率明显增高，提示宽筋藤酰胺A可减少Aβ25～35所致神经细胞凋亡；从表4可看出，与模型组比较，宽筋藤酰胺A在6.25、12.5、25.0μmol/L可提高抗凋亡因子Bcl-2的表达，同时可降低促凋亡因子Bax和Caspase-3的表达，提示宽筋藤酰胺A对神经细胞凋亡有明显的保护作用。
表2不同浓度宽筋藤酰胺A对Aβ25～35损伤所致PC12细胞存活率的影响
Figure GDA0002145828090000071
Figure GDA0002145828090000072
备注:与正常对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
表3不同浓度宽筋藤酰胺A对Aβ25～35诱导的PC12细胞凋亡率的影响
Figure GDA0002145828090000081
Figure GDA0002145828090000082
备注：与正常对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
表4不同浓度宽筋藤酰胺A对Aβ25-35所致AD细胞模型的Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响
Figure GDA0002145828090000083
Figure GDA0002145828090000084
备注：与正常对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
2.宽筋藤酰胺A对Aβ25～35所致的原代海马神经元细胞AD模型存活率的影响
2.1实验方法
提取乳鼠海马细胞并进行培养，MAP2/FITC染色法对海马细胞进行鉴定。调整细胞混悬液浓度，接种于预先用0.1％多聚赖氨酸包被过夜的96孔板中加入150μl/孔，调整细胞密度为1×104/孔。分设空白组、模型组、宽筋藤酰胺A组，宽筋藤酰胺A终浓度为6.25、12.5、25.0μmol/L，每组设4个复孔；在5％CO2，37℃细胞培养箱中培养至第7天，使细胞单层贴壁，此时加入生长培养基、稀释到相应浓度的含宽筋藤酰胺A培养基每孔100μ、模型组和给药组加入造模药Aβ25～35，使其终浓度为20μmol/L；5％CO2，37℃条件下孵育48h；每孔加入50μl，MTT(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h；小心吸去孔内培养液，每孔加入100μl DMSO，置摇床上低速振荡10～15min，使结晶充分溶解。在酶标仪上选择570nm波长测量各孔OD值。
2.2实验结果
结果见表5。通过SPSS19.0分析，模型组与空白组比较OD值明显下降，说明造模成功；与模型组比较，宽筋藤酰胺A在6.25、12.5、25.0μmol/L OD值明显上升，提示宽筋藤酰胺A对Aβ25～35所致的原代海马神经元细胞有明显的保护作用。
表5不同浓度宽筋藤酰胺A对海马细胞活性的影响
Figure GDA0002145828090000091
Figure GDA0002145828090000092
备注：与正常对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01；与模型对照组比较*P＜0.05，**P＜0.01。
3.小结
以上结果说明，宽筋藤酰胺A对Aβ损伤的PC12神经细胞和海马神经元细胞都有保护作用。提示宽筋藤酰胺A是宽筋藤抗老年痴呆的活性成分。

Claims (8)

1.一种宽筋藤酰胺A，其特征在于具有如下结构：
Figure FDA0002087281640000011
2.如权利要求1所述宽筋藤酰胺A的制备方法，包括如下步骤：
(1)取宽筋藤的干燥藤茎，乙醇溶液提取后，使用正丁醇萃取，取正丁醇部分；
(2)取正丁醇部分，湿法上大孔树脂柱，依次用水、30％、50％、70％乙醇洗脱，收集70％乙醇洗脱液；
(3)70％乙醇洗脱液与硅胶干法拌样，上硅胶柱，依次用二氯甲烷:甲醇的体积比为10:1,8:1,6:1,4:1的洗脱液洗脱，收集二氯甲烷:甲醇的体积比为4:1的洗脱部分；
(4)取步骤(3)二氯甲烷:甲醇的体积比为4:1的洗脱部分上凝胶柱，甲醇洗脱，收集第二个柱体积洗脱部分，得到权利要求1所述宽筋藤酰胺A。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(1)采用70％乙醇溶液加热回流提取2小时。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(2)先将正丁醇部分浓缩制得浸膏后，再用20％乙醇溶解，湿法上大孔树脂柱，依次用水、30％、50％、70％的乙醇溶液各洗脱3个柱体积。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中70％乙醇洗脱液浓缩制得浸膏后，再用20％乙醇溶解后，用1.5倍重量的100-200目硅胶拌样，选择200-300目硅胶柱装柱，依次用二氯甲烷:甲醇的体积比为10:1,8:1,6:1,4:1的洗脱液各洗脱3个柱体积，收集二氯甲烷:甲醇的体积比为4:1的洗脱部分。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(2)大孔树脂为D101。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤(4)中凝胶柱为Sephadex LH-20。
8.权利要求1所述的宽筋藤酰胺A在制备治疗或预防阿尔茨海默病药物中的应用。
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