KR20040090433A - 탄신온 투에이를 유효성분으로 함유하는 항염증제 조성물 - Google Patents

Abstract

이에 본 발명자들 또한 새로운 항염증제를 탐색하는데 있어, 표적이 되는 TNF-α, IL-1β 또는 IL-6 등의 프로-염증성 사이토카인들 및 iNOS 유전자를 억제할 수 있는 물질을 찾기 위해 많은 연구를 수행하였다. 그 결과, 단삼의 뿌리로부터 분리한 디테르펜 (diterpenes) 계열의 화합물인 탄신온 IIA (Tanshinone IIA)가 iNOS의 발현과 NO 생성량을 억제하고, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등의 프로-염증성 사이토카인들의 생성량을 감소시켜, 상기 탄신온 IIA를 유효성분으로 함유하는 조성물이 항염증제 조성물로서 이용될 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서, 본 발명의 목적은 항염증제 조성물을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명에 따른 조성물은 류마티스를 비롯한 골관절 및 퇴행성 관절염 질환 등의 과다 염증반응에 의하여 발생하는 질환의 치료에 이용될 수 있는 물질로서 탄신온 IIA를 유효성분으로 함유함을 특징으로 한다.

Description

탄신온 투에이를 유효성분으로 함유하는 항염증제 조성물 {An Anti-inflammatory Composition Containing Tanshinone IIA }

염증반응은 매우 복잡한 생화학적 반응에 의해 일어나며, 프로스타글란딘 (prostaglandins), 루코트린 (leukotrienes), 혈소판 활성화 인자 (platelet activating factor), 일산화질소 (nitric oxide; NO) 및 프로-염증성 사니토카인(pro-inflammatory cytokine) 등의 다양한 매개물질이 염증반응에 관여하여, 염증성 질병을 유발시키는 것으로 밝혀졌다. 따라서, 상기 염증반응의 다양한 매개인자의 생성량을 억제하거나 활성을 감소시킬 수 있는 물질을 검색하여 항염증제를 발굴하였다. 현재, 항염증제 시험약제의 평가를 위한 생체 및 시험관 모델이 잘 정립되어 있다.

당업계에서는 설치류 대식세포주 RAW 264.7를 대상으로 리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS)와 같은 그람 음성 세균의 내독성 물질과 인터페론-감마 (interferon-γ; IFN-γ) 또는 LPS를 단독으로 활성화 시킨 후, 단삼의 뿌리에서 분리한 탄신온 IIA를 처리하여 염증성 매개물질 생성의 억제 능력을 검색하여 염증 치료용 약제로 우수한 효과가 있음을 규명하였다.

일산화질소(NO)는 염증반응에 관련된 중요한 매개 분자로 알려져 있다 (Clancy R. M. et al Arthritis Rheumatology. 1998; 41: 1141-1151). 일산화질소 합성효소 (NO synthase), 특히 유도성 일산화질소 합성효소 (inducible nitric oxide synthase, iNOS)에 의해 합성된 NO 등의 반응성 물질들은 많은 염증에 관련된 병리학적 증상의 유발에 관여한다. 즉, iNOS는 LPS의 자극에 의해 과다하게 발현되어, 면역질환 (immunological diseases)을 비롯한 염증성 질환(inflammatory diseases)을 유발시킨다고 한다 (Jang, D. & Murrell, G. A. C., Free Radical Biology & Medicine, 1998, 24: 1511-1519; Miyasaka, N. & Hirata, Y., Life Science, 1997, 61: 2073-2081). 또한, 프로-염증성 사이토카인 등의 다른 자극에 의해 iNOS가 과다하게 발현되는 경우, 일부 염증 및 자가면역질환이 유발된다고 알려져 있다.

한편, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등의 프로-염증성 사이토카인 (pro-inflammatory cytokines)으로 알려진 대식세포 유래의 매개물질이 염증반응 및 면역반응의 중심역할을 하는 것으로 알려져 있다 (Clancy R. M. et al. Arthritis Rheumatology. 1998; 41: 1141-1151; Straub R. H. et al., FASEB Journal 2000; 14: 1380-1388; Mannel D. N. & Echtenacher B Chemical Immunology 2000; 74: 141-161). 특히, 상기 프로-염증성 사이토카인들은 염증부위에서 다량 발견되기 때문에, 과도한 염증반응에 의해 유발되는 류마티스 관절염, 골관절 및 퇴행성 관절염 또는 상처부위의 과도한 염증 증상의 발현에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다.

상기와 같은 프로-염증성 사이토카인 및 염증 매개물질의 생성과 활성을 억제시키는 물질검색이, 새로운 항염증제 및 항류마티스제의 탐색 및 그의 효능 평가에 중요하게 이용될 수 있음을 알 수 있다.

이상을 정리하면, 염증반응을 일으킬 수 있는 물질로 세포를 자극하면, TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등의 프로-염증성 사이토카인들의 발현이 유도되고, 생성된 프로-염증성 사이토카인들은 iNOS를 코딩하는 유전자의 발현을 자극시켜, 염증반응에 관여하는 일산화질소의 반응성 물질을 생성하여 염증반응을 일으킨다. 그리고 다른 염증에 관련된 유전자들도 발현시킬 수 있으며, TNF-α, IL-1β 또는 IL-6 등의 프로-염증성 사이토카인들도 염증반응에 관여하는 다른 생물학적 반응들도 활성화시킨다.

따라서, TNF-α, IL-1β 또는 IL-6 등의 프로-염증성 사이토카인들 및 iNOS의유전자는, 과다한 염증반응에 의해 발생되는 폐혈증, 류마티스 관절염 등의 질병을 치료하기 위한 새로운 항염증제 개발에 유용한 표적으로 이용될 수 있다고 당업계에 인식되어 왔다.

본 발명은 단삼 (학명: Salvia miltiorrhiza BUNGE)의 뿌리에서 분리한 디테르펜 (diterpenes) 계열의 화합물인 탄신온 IIA (Tanshinone IIA)을 유효성분으로 함유하는 항염증제 조성물에 관한 것으로, 염증반응을 매개하는 물질로 알려진 일산화질소 (nitric oxide; NO), 유도성 일산화질소 합성효소 (inducible nitric oxygen synthase; iNOS), TNF-α, IL-1β 및 IL-6를 억제함으로써 염증반응을 치료할 수 있다.

도 1은 탄신온 IIA의 화학구조를 나타낸 도면이다.

도 2은 LPS와 IFN-γ 자극에 의해 유도된 NO 생성량(도 2a)과 iNOS 발현(도 2b)에 대한 탄신온 IIA의 억제 효과를 보여주는 도면이다.

도 3은 LPS로 자극에 유도되는 TNF-α(도 3 a), IL-1β(도 3b) 및 IL-6(도 3c) 등 프로 염증성 사이토카인의 생성량에 대한 탄신온 IIA의 억제 효과를 보여주는 도면이고, 도 3d는 LPS와 LPS와 IFN-γ 자극에 의해 유도된 세포 독성에 대한 탄신온 IIA의 보호능력을 나타내는 도면이다

본 발명의 목적은, 탄신온 IIA가 1) 항염증반응과 관련된 프로-염증성 사이토카인의 생성을 대식세포에서 억제할 수 있고; 2) iNOS 유전자 발현을 억제하여 대식세포에서 생성되는 일산화탄소의 양을 감소시키는 것으로 나타나; 탄신온 IIA를 유효성분으로 함유하는 항염증제 조성물을 제공하는 것이다.

단삼 (Salvia miltiorrhiza BUNGE)은 꿀풀과 (Labiatae)에 속하는 다년초로 뿌리가 적색이어서 단삼이라 한다. 한의학에서는 뿌리를 심근경색, 복통, 골관절통, 악창종독 및 월경불순 등의 부인병 질환의 치료에 사용되고 있다. 뿌리에 함유된 것으로 알려진 성분은 baicalin등의 플라보노이드 성분(flavonoids),isotanshione I, tanshinone I, tanshinone IIA, tanshinone IIB, cryptotanshinone 등의 수종의 디테르펜 성분 (diterpenes), 올레안산 (oleanoic acid) 등의 트리테르펜 성분 (triterpenes), rosmarinic acid 등의 페닐프로판노이드 성분 (phenylpropanoids) salvianolic acid, lithospermic acid B 등의 리그난 성분(lignans) 등이 있다. 이중 디테르펜계 성분이 가장 많이 함유되어 있는데 isotanshione I, tanshinone I, tanshinone IIA, tanshinone IIB, cryptotanshinone 등은 단삼에만 함유되어 있는 성분이다.

특히, 단삼에 함유된 탄신온 IIA는 인간 백혈병 세포주 (HL60)에서 케스페이스-3 (caspase-3)을 경유한 세포사멸 (apoptosis)을 유도하고 (Sung H. J. et al., Experimental Molecular Medicine. 1999; 31: 174-178), 마우스 면역세포에서 분비되는 인터루킨-12 (interleukin-12; IL-12)와 인터페론-감마 (interferon-γ); IFN-γ )을 억제하는 효과가 있다는 보고가 있다 (Kang B. Y. et al., Immunopharmacology. 2000; 49: 355-61). 또한 탄신온 IIA는 혈중 콜레스트롤과 지방의 혈관축적에 원인이 되는 저농도 리포프로테인 (low density lipoprotein; LDL)의 억제 (Niu X. L., et al., Free Radic Res. 2000; 33: 305-312), 마우스에서 아드리아마이신이 유도하는 지방산화 (adriamycin-induced lipid peroxidation)의 억제 (Zhou G. Y., et al., Pharmacological Reserch. 1999; 40: 487-491) 및 간세포 (liver cell)에서 지질산화 (lipid peroxidation)에 따른 DNA 손상으로부터 보호해주는 기능이 있다 (Cao E. H., et al., Free Radical Biological Medicine. 1996; 20: 801-806). 그러므로 탄시논 II-A는 강력한 항산화제 효과가 있는 것으로알려졌다.

탄신온 IIA을 포함한 디테르펜계 화합물은 식물계를 포함한 천연물에 다량 존재하는 골격으로, 단삼에 가장 많은 성분이 함유된 화합물군이다.

동아시아 지역에서 염증질환의 치료제로 사용되고 있는 단삼의 항염증효과 (antiinflammatory activity)는 주성분군인 디테르펜계 화합물로 판명되었으나(Gao, Chung His I Ho Chih. 1983; 3: 300-301) 작용기전과 류마티스 관절염 등의 염증질환에 대한 효과는 아직 연구된 바 없다.

본 발명에서는, 단삼을 당 업계에 통상적으로 알려진 방법으로 추출 및 분리방법에 의해 디테르펜계 화합물중, 탄신온 IIA를 순수한 단일성분으로 분리하여 항염증 효과와 염증반응에 관여하는 대식세포에서 어떠한 작용기작을 갖는지를 명확하게 밝혀내었다. 따라서, 본원 발명에서 분리한 탄신온 IIA는 류마티스를 비롯한 관절염 치료에 있어서, 보다 구체적인 처방전략을 수립하여 과다 염증반응에 의한 질병을 갖고 있는 환자의 치료에 보다 유리하게 이용될 수 있다. 탄신온 IIA의 분리방법은 하기의 실시 예에서 보다 구체적으로 설명되어 있다.

한편, 본 발명에 따르면, 과다한 염증반응에 의하여 일어날 수 있는 질환들은 당 업계에 통상적으로 주지되어 있으며, 그러한 질환치료에 본 발명에 따른 조성물을 투여하여 효과를 얻을 수 있다. 본 발명의 조성물에 의해 치료될 수 있는 질병, 즉 과다한 염증반응에 의해 일어날 수 있는 질환의 예로는, 류마티스 관절염, 골관절, 퇴행성 관절염, 다발성경화증 (multiple sclerosis), 전신성 홍반성 낭창증 (systemic lupus erythematosus, SLE), 건선(psoriasis), 염증성 대장질환(inflammatory bowel disease), 자가면역 간염(autoimmune hepatitis) 등의 자가면역질환 및 패혈증 (septic shock)을 포함하지만, 이에 의해 본원 발명이 한정되지는 않고, 당 업계에 통상적으로 주지된 염증반응 관련 질환들도 본원 발명의 범위에 포함된다.

본 발명에 의하면, 단삼의 뿌리로부터 분리된 탄신온 IIA는 RAW264.7 대식세포주에서 생산되는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등의 사이토카인을 농도 의존적으로 현저히 억제시킬 수 있으며, iNOS의 발현을 억제함으로써 NO의 생성량을 감소시킬 수 있다. 따라서, 탄신온 IIA는 프로염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 과도한 생산을 차단하며, 염증매개물질인 NO의 생성을 효과적으로 억제시킴으로써 항염증 치료제로 이용될 수 있다.

본 발명의 항염증제 조성물에서 유효성분인 탄신온 IIA의 유효량은 투여방법, 제재형태, 환자의 나이, 환자의 체중, 환자의 감수성 및 질환의 상태에 따라 적절하게 선택되어질 수 있으며, 구체적으로 제한되는 것은 아니지만, 일반적으로 탄신온 IIA를 0.001∼500 ㎎/㎏체중의 1회 투여분량으로 투여되도록 제형화 될 수 있다. 물론, 유효성분의 투여량이 상기범위를 벗어난 양일 수도 있다.

탄신온 IIA를 상기한 범위 내로 투여하기 위한 제재는 통상의 형태를 가질 수 있으며, 예를 들면 알약, 캅셀 형태나 드링크제, 의약품 등의 형태로 사용할 수 있다. 이들은 경구 또는 각종의 비경구 경로에 의해 과다염증반응에 의해서 발생하는 질환의 치료를 위해 투여될 수 있으며, 투여제형에 따라 적합한, 그리고 당 업자에게 이미 주지되어 있으며 당업자가 용이하게 선정할 수 있는 각종의 부형제,담체 또는 희석제 등을 함유할 수 있다.

이하, 실시 예에 의해서 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명의 범위가 이에 의해서 한정되는 것은 아니다. 하기에서 모든 실험은 최소한 3번 이상 반복하였으며, 유의성 검증은 스튜던트 t-검사법[Student's t-test; Microcal Origin version 5.0 software (Microcal Software, USA)]에 의해 실시하였고, 유의성의 한계는 p<0.05로 하였다.

실시예 1:탄신온 IIA 의 분리

본 실험에서 사용된 단삼 (Salvia miltiorrhiza BUNGE)은 2000년 9월에 대한민국 전라북도 익산시 소재의 한약건재상에서 구입하였다. 표본은 원광대학교 치과대학 구강미생물학교실에 보관되어있다.

건조된 단삼 뿌리에서 탄신온 IIA를 95%이상의 순도로 분리하였다. 즉, 뿌리 2.0 kg을 분쇄하여 7일간 6ℓ의 메탄올 (MeOH)로 3회 반복 추출한 다음 감압농축기로 용매를 제거하여 추출물 72 g을 얻었다. 이 메탄올 추출물을 증류수에 현탁시킨 후, 헥산 (n-hexane) 디클로르메탄 (CH2Cl2), 에틸아세테이트 (EtOAc), 부탄올 (n-BuOH) 그리고 물층 (H2O)순으로 계통분획하였다.

디클로로메탄 가용부 14g을 실리카 겔 (230-400 mesh, 400g) 컬럼 크로마토그래피 (지름 6 cm, 길이 34 cm)을 100% n-hexane, n-hexane-EtOAc (50:1, 25:1, 12:1, 5:1, 1:1)의 용매로 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 Fr. SM-31; 41mg, 400mL, Fr. SM-32; 686mg, 800mL, Fr. SM-33; 2250mg, 800mL, Fr. SM-34; 890mg, 800mL, Fr.SM-35; 231mg, 800mL, Fr. SM-36; 760mg 등 6개의 소분획을 얻었다. 이중 소분획 Fr. SM-33을 리사이클 분취용 고속액체크로마토그래피 (Recycling-preparative HPLC) (용매; 클로로포롬, 흐름속도; 3.5 mL/min)법을 이용하여 머무름시간 (retention time) 26.5분에서 활성 성분 탄신온 IIA (Fr. SM-331, 91 mg)을 순수히 분리하였다

분리한 화합물을 이화학적, 분광학적 분석법인 녹는점 (melting point), 수소(1H-) 와 탄소(13C-) 핵자기공명 (neuclar magmetic resonace; nmr), 질량분석(mass) 방법을 측정한 결과와 기존에 문헌 (Ryu S. Y., et al., Two novel abietane diterpenes from Salvia miltiorrhiza, Planta Medica, 1997; 63:44-46, An L. K., et al., Reaction of tanshinones with biogenic amine metabolites in vitro, Tetrahedron, 2002; 58: 10315-10321)과 비교하여 탄신온 IIA로 동정하였다. 탄신온 IIA의 이화학적 특징과 1H- 와 13C- NMR 스펙트럼 데이터는 다음과 같다. mp 216-217℃, 1H-NMR (CDCl3, 600 MHz) δ 1.32 (s. 6H, H-18 and H-19), 1.67 (m, 2H, H-3), 1.81 (m, 2H, H-2), 2.28 (d, J=1.2Hz, 3H, H-17), 3.19 (t, J =6.2Hz, 2H, H-1), 7.23 (d, J =1.2Hz, 1H, H-16), 7.57 (d, AB, J=8.1Hz, 1H, H-7), 7.64 (d, AB, J=8.1Hz, H-6). 13C-NMR (CDCl3, 150 MHz) δ29.88 (C-1), 19.11 (C-2), 37.83 (C-3), 34.65 (C-4), 144.48 (C-5), 133.46 (C-6), 120.23 (C-7), 127.45 (C-8), 126.49 (C-9), 150.12 (C-10), 183.65 (C-11), 175.79 (C-12), 119.88 (C-13), 161.73 (C-14), 121.14 (C-15), 141.27 (C-16), 8.79 (C-17), 31.83 (C-18), 31.83 (C-19). LC/ESI+MS[M+H]+ m/z;295.3.

탄시논 II-A의 구조식은 도 1에서 보여지는 바와 같다.

(탄신온 IIA의 화학구조식)

실시예 2:시약

리포폴리사카라이드 (lipopolysaccharide, LPS), RPMI-1640 배지 및 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디프-에닐테트라졸리움 (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diph-enyltetrazoleum, MTT)은 시그마사 (Sigma Chemical Company)에서 구입하였다.

우태아 혈청 (Fetal bovine serum, FBS) 및 항생제는 깁코/RBL사(Gibco/RBL)에서 구입했다.

모든 시약류와 조직배양에 사용된 배양액은 측색계 LAL 검사(colorimetricLimulus amoebocyte lysate assay)(측정한도, 10 pg/ml; Whittaker Bioproducts)를 수행하여 내독소 함량을 측정하였다. 그 결과, 이들 시약 및 배양액은 내독소를 전혀 함유하지 않았다. 조직배양 플레이트와 직경 100mm 페트리접시는 넌크사 (Nunc, Inc., USA))로부터 구입하여 사용했다.

TNF-α, IL-1β 및 IL-6등 사이토카인 면역효소흡착 (ELISA) 엇세이 키트는 R&D사로부터 구입했다 (McKinley Place N.E., Minneapolis, U.S.A).

iNOS 항체는 산타크루즈사로부터 구입했다 (2161 Delaware Avenue, California, U.S.A.)

실시예 3: RAW264.7 대식세포주 및 그의 배양

설치류 대식 세포주 (the murine macrophage cell line, RAW264.7)는 미국의 ATCC사로부터 구입했다 (American Tissue Culture Collection, ATCC).

상기 대식세포주는, 항생제 및 항균제로서 100 U/mL의 페니실린 G 및 100 U/mL의 스트렙타마이신 (streptomycin) 및 10% 열처리 우태아혈청(heat inactivated FBS)을 첨가한 완전한 RPMI 1640 배지에서 5% CO2의 습한 대기, 37℃의 조건으로 배양하였다.

실시예 4:아질산 (Nitrite) 농도 측정.

DMSO에 용해한 탄신온 IIA을 여러 가지 농도로 처리하고 여기에 인터페론 감마(IFN-γ , 5 U/mL)와 LPS (10 ng/mL) 을 주입하고 24시간 배양한 후 실험하였다. 세포배양액의 최종 DMSO의 농도는 0.1%였다. 배양된 대식세포의 상층액을 수집하여 Griess reagent (1% sulfanilamide, 0.1% N-(1-naphthyl)-ethylenediamine dihydrochloride in 2.5% phosphoric acid solution)와 동량으로 주입한 후 10분간 실온에 방치하였다. 아질산 농도는 ELISA 플레이트 리더를 이용하여 540 nm에서 그 흡광도를 측정하여 결정하였다. 세포가 없는 배양액은 아질산이 5-8 M로 나타나 이 값을 기준으로 하여 실험군의 아질산 값을 측정하였다.

그 결과 도 3d에서 나타낸 바와 같이 탄신온 IIA의 농도에 의존적으로 아질산 생산량이 크게 억제되었다. 특히 10 μg/mL의 농도에서는 NO 생성 억제제로 잘 알려진 NGMMA 처리군과 비슷하게 억제되어 탄신온 IIA는 낮은 농도에서 NO 생산량을 크게 억제 시킴을 알 수 있었다.

실시예 5:iNOS의 웨스턴 불롯 분석

상기에서 보여준 바와 같이, 탄신온 IIA는 NO 생산량을 억제시키는 효과가 우수하였음을 확인한 후 iNOS 발현에 미치는 효과를 알아보기 위하여 iNOS 폴리클론 항체를 이용하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. RAW264.7 대식세포주를 탄신온 IIA로 처리함 없이 또는 1시간 동안 전처리한 후, IFN-γ (5 U/mL)와 LPS (10 ng/mL)로 6시간 동안 자극하였다. 그런 다음 세포용해제 (인산완충 용액)를 이용였다. 즉, 세포는 10 mM HEPES, 10m M KCI, 1 mM dithiothreitol, 1 mM phenylmethylsulfonyl fluoride, 0.2 mM EDTA (pH 7.4) 등이 함유되어 있는 세포용해제를 첨가하고 15분간 얼음위에서 방치하고 Dounce homogenizer를 이용하여 60strokes 로 세포를 마쇄하고 50 mM HEPES and 250 mM KCI (pH 7.4)이 포함되어 있는 용액을 첨가 하였다. 핵과 마쇄되지 않은 세포덩어리를 제거하기 위해서 4℃에서 500 g로 5분간 원심분리 하였다. 세포추출액의 단백질량은 블레드포드 방법에 따라 정량하고 50 ㎍을 10% SDS-PAGE로 분리한 다음 transfer solution (20% methanol, 25mM Tris, 192mM glycine, pH 8.3)을 이용해 nitrocellulose membrane에 분리된 단백질을 전사 시켰다. 비 특이반응을 제거하기 위해서 5% 비지방 skim milk가 함유된 TTBS로 4℃에서 2시간 이상 충분히 흔들면서 방치하였다. 그 후 TBS로 3회 세척하고 anti-iNOS antibody (1: 1,000)를 주입하여 3 시간동안 실온에서 반응시킨 후 충분히 세척하고 horse radish peroxidase가 부착된 anti-goat IgG (1 : 100)을 주입하고 1 시간 동안 실온에서 반응시켰다. 대조군으로는 anti-actin 항체를 이용하여 수행하였다. Membrane은 TBS로 충분히 세척하고 통상적인 ECL방법으로 발색시켰다.

그 결과 도 2b에 나타낸 바와 같이 탄신온 IIA가 처리되지 않고 IFN- + LPS만 처리된 실험군에서는 iNOS가 과량 발현되었으나, 탄신온 IIA가 처리된 실험군에서는 농도에 의존적으로 크게 억제되는 효과가 있었다. 특히 탄신온 IIA 10 μg/mL 처리군에서는 iNOS 발현 억제제로 알려진 NGMMA 처리군과 비슷하게 억제되어 매우 우수한 효과를 보였다.

실시예 6:사이토카인 생산의 측정

대식세포 매개 프로-염증성 사이토카인로서 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등의 생합성 또는 그들의 작용기작을 교란시킬 수 있는 물질은 염증반응 및 류마티스 관절염의 치료효과를 갖는다는 것이 당 업계에 인식되어 있다. 따라서, 상기 프로-염증성 사이토카인은 류마티스제 등의 항염증제에 대한 약리학적인 효능 평가에 이용될 수 있다. 본 실시예에서도, 탄신온 IIA가 활성화된 RAW264.7 대식세포주가 생산하는 프로-염증성 사이토카인(TNF-α, IL-1β 및 IL-6)을 억제시킬 수 있는지를 실험하였다.

우선, 그람-음성 박테리아 내독소인 LPS는 대식세포에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-6 등의 프로-염증성 사이토카인의 생산을 유도하는 인자로 당 업계에 잘 알려져 있다. 따라서, 본 실시예에서는 1 ㎍/mL의 LPS를 처리하여 대식세포주에서 프로-염증성 사이토카인의 생성을 유도하였다. 이에 대한 구체적인 실험 방법은 다음과 같다.

사이토카인 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 생산은 면역검사를 수행하여 측정하였다. 1 x 106/mL의 RAW264.7 세포를 10, 50 또는 100 ng/mL의 탄신온 IIA로 1시간 동안 전처리한 후, TNF-α는 1 ㎍/mL의 LPS로 6시간 처리하였으며, IL-1β는 는 1 ㎍/㎖의 LPS로 8시간 처리하였고, IL-6는 1 ㎍/mL의 LPS로 18시간 처리하였다. 그 후, 배양액을 원심분리하여 세포들을 침전시킨 후, 상층액을 수집하고, 상층액 내 TNF-α, IL-1β와 IL-6의 양을 퀀티카인사(QuantikineTM, USA) 및 R & D 시스템사 (R & D Systems, USA)로부터 구입한 키트 및 키트의 사용자 매뉴얼에 기재된 방법대로 각 사이토카인의 양을 측정하였다.

그 결과는 도 3에 나타내었으며, 결과값은 3번씩 3회 반복 실험하여 평균±표준편차로 나타냈다.

그 결과로, 도 3(a-c)에서 보는 바와 같이, 탄시논 II-A로 RAW264.7 대식세포를 1 시간 전처리한 후, LPS로 프로-염증성 사이토카인의 생산을 유도하면, 농도 의존적으로 생산량이 현저하게 감소함을 알 수 있었다.

실시예 7:세포 생존율

세포의 생존율은 다음과 같은 방법에 의해서 측정하였다. 즉, 상기 참고 실시예 3에서 배양한 세포 현탁액(1x106 세포수/mL)에 50 ㎍/mL의 MTT를 첨가하고, 4시간 동안 반응시켰다. 반응으로 생성된 포르마잔(formazan)은 산성 2-프로판올 (시그마사, U.S.A.)에 용해시킨 후, 590 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 시험약물을 처리하지 않은 대조군 세포의 흡광도를 100%로 하여, 시험약물이 처리된 실험군의 흡광도를 비교하여 상대적 세포 생존율을 계산하였다.

그 결과 본 발명에서 사용된 탄신온 IIA의 농도(0.1-10 μg/mL)는 세포독성이 없었고, 도 3d에서 나타낸 바와 같이 IFN-γ와 LPS 처리군에서 나타난 독성을 제거하는 효과가 뚜렸하였다. 그러므로 상기 실시 예 4-6에서 나타낸 NO, iNOS alc 프로 염증성사이토카인의 억제는 탄신온 IIA 화합물의 독성과 무관하였다.

이상에서 살펴본 바와 같이, 탄신온 IIA는 염증반응에 관여하는 여러 매개인자, 즉, TNF-α, IL-1β, IL-6의 프로-염증성 사이토카인의 생성, NO 생성 및 iNOS 발현 등을 억제할 수 있다. 따라서, 탄신온 IIA를 함유하는 조성물은 류마티스를비롯한 골관절, 퇴행성 관절염, 패혈증 등과 같은 과다한 염증반응에 의해 유발되는 질환의 치료에 이용될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 조성물은 분리한 탄신온 IIA를 함유하고, 인체에 어떠한 심각한 부작용을 유발하지 않기 때문에, 장기적으로 투여하여도 부작용을 거의 나타내지 않는다.

Claims (3)

1. 탄신온 IIA를 유효성분으로 하여 이루어지며, 생체내 대식세포에서 일산화질소, TNF-α, IL-β 및 IL-6의 과량생성과 유도성 일산화질소 합성효소의 과발현에 기인하는 치료용 약제 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 탄신온 IIA는 단삼에서 추출된 것을 특징으로 하는 염증 치료용 약제 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 탄신온 IIA 하루 투여량은 성인 체중 1 kg 당 0.001-500 mg인 것을 특징으로 하는 염증 치료용 약제 조성물