CN111763186B - 一种半日花烷型化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种半日花烷型化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明对益母草药材的物质基础进行研究，发现了新的化学成分半日花烷型化合物并提出了其相应的提取分离方法，发明人运用现代波谱学手段，对上述方法分离得到的化合物进行了结构鉴定。本发明还通过体外活性筛选发现该类化合物具有抗炎活性，本发明为新颖的天然抗炎药物的开发提供了新的选择。

Description

一种半日花烷型化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及医药技术领域，特别涉及一种半日花烷型化合物及其制备方法和应用。
背景技术
益母草为唇形科草本开花植物益母草(Leonurus japonicus Houtt.)地上新鲜或干燥全草。原产于亚洲多国，包括中国、日本、柬埔寨等，现已被包括南美洲、北美洲、欧洲、非洲等世界其他多地引种。我国益母草属约12种，分布于全国各地。具有活血调经、利尿消肿的功效，是中医妇科良药。
发明内容
有鉴于此，本发明旨在从益母草中制备提取出一种具有生物活性的半日花烷型二萜类化合物。
本发明提出了一种半日花烷型化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，该化合物具有式I结构：
Figure RE-GDA0002116860610000011
R1选自＝O，-OH，-NH2,＝NH,＝S，-SH，-COOH或可选取代的 C1-C10烷氧基、酯基、烷氧酰基、烷氨基、酰氨基；
R2和R3分别选自＝O或-OH；
5’C和6’C以及8’C和9’C之间选自单键或双键；
R4选自
Figure RE-GDA0002116860610000021
其中，
X选自N，O，S；
13’C和14’C，14’C和15’C，以及13’C和16’C之间选自单键或双键；R5、R6及R7分别选自-H，＝O，-OH，-NH2,＝NH,＝S，-SH，-COOH, 或可选取代的C1-C10烷氧基、酯基、烷氧酰基、烷氨基、酰氨基。
比如，C1-C10可以是脂肪或环状的、并可选地被F、Cl、Br、I、 CN、OH、SH、NH2、CHO、COOH、C1-10烷基、C1-10烷氨基、N,N- 二(C1-10烷基)氨基、C1-10烷氧基、C1-10烷酰基、C1-10烷氧羰基、 C1-10烷基磺酰基、C1-10烷基亚磺酰基、C3-10环烷基、C3-10环烷氨基、C3-10杂环烷氨基、C3-10环烷氧基、C3-10环烷基酰基、C3-10环烷氧羰基、C3-10环烷基磺酰基、C3-10环烷基亚磺酰基取代。
进一步地，R1选自＝O，-OH，-NH2,＝NH,＝S，-SH，-COOH或可选取代的C1-C5烷氧基、酯基、烷氧酰基、烷氨基、酰氨基；R5、 R6及R7分别分别选自-H，＝O，-OH，-NH2,＝NH,＝S，-SH，-COOH 或可选取代的C1-C5烷氧基、酯基、烷氧酰基、烷氨基、酰氨基。
优选地，当8’C和9’C之间选自单键时，9’C为R’或S’且可选地被 -OH，-NH2，-SH取代。
进一步地，R5、R6及R7分别选自-H,＝O，-OH或-OAc，
进一步地，R1选自＝O，-OH或-OAc。
优选地，R2和R3不相同。
优选地，R4选自：
Figure RE-GDA0002116860610000031
更优选地，前述化合物选自：
Figure RE-GDA0002116860610000032
本发明还提出了一种前述化合物的制备方法，其特征在于，该方法包括：
(1)称取益母草药材，粉碎，加70％-95％v/v乙醇回流提取，提取液减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏；
(2)将乙醇浸膏用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并乙酸乙酯部分，减压回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏；
(3)采用硅胶柱色谱对乙酸乙酯浸膏进行分离，石油醚:乙酸乙酯＝(100:0)～(0:100)梯度洗脱，并按体积收集每个梯度冲洗8个柱体积收集所得流份并进行浓缩，得各个极性段。
(4)取石油醚-乙酸乙酯＝75:25-90:10洗脱部分上MCI柱，分别采用纯水、30％甲醇、60％甲醇、90％甲醇、100％甲醇溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱8个柱体积，浓缩得到各个极性段，即纯水段、30％甲醇水段、60％甲醇水段、90％甲醇水段、纯甲醇段。纯甲醇段再次使用硅胶柱色谱进行分离，依次使用石油醚-丙酮进行洗脱，分别收集不同极性段的洗脱液，即可到本发明的新化合物，进一步采用制备薄层色谱分离，二氯甲烷--甲醇系统展开，刮取目标产物色谱带，以甲醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，即得各产物。
本发明还提出了前述任一所述化合物或其药学上可接受的盐在制备抗炎药物中的应用。
本发明还提供了一种药物，它含有上述化合物或其药学上可接受的盐。
本发明中，所述药学上可接受的盐为化合物的盐酸盐、硫酸盐、枸橼酸盐、苯磺酸盐、氢溴酸盐、氢氟酸盐、磷酸盐、乙酸盐、丙酸盐、丁二酸盐、草酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、富马酸盐、马来酸盐、酒石酸盐或三氟乙酸盐。
本发明化合物用作药物时，可以直接使用，或者以药物组合物的形式使用。该药物组合物含有0.1-99％，优选为0.5-90％的本发明化合物，其余为药物学上可接受的，对人和动物无毒和惰性的可药用载体和/或赋形剂。
所述的药用载体或赋形剂是一种或多种固体、半固体和液体稀释剂、填料以及药物制品辅剂。将本发明的药物以单位体重服用量的形式使用。本发明的药物采用制药和食品领域公认的方法制备成各种剂型、如液体制剂(注射剂、混悬剂、乳剂、溶液剂、糖浆剂等)、固体制剂(片剂、胶囊剂、颗粒剂，冲剂等)、喷剂、气雾剂等。本发明的药物可经注射(静脉注射、静脉滴注、肌肉注射、腹腔注射、皮下注射)和口服、舌下给药、粘膜透析等给药途径进行抗炎的治疗。
本发明对益母草药材的物质基础进行研究，发现了新的化学成分并提出了其相应的提取分离方法，发明人运用现代波谱学手段，对上述方法分离得到的化合物进行了结构鉴定。本发明还通过体外活性筛选发现该类化合物具有抗炎活性，本发明为新颖的天然抗炎药物的开发提供了新的选择。
具体实施方式
下面用本发明实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发明：
实施例1化合物Japonicone A的提取、分离纯化和结构鉴定
(1)药材的提取：称取益母草药材50kg，粉碎，加20倍量80％ v/v乙醇回流提取2次，每次3h，提取液减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.5kg；
(2)化合物的分离纯化：
a.将乙醇浸膏用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并乙酸乙酯部分，减压回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏500g；
b.采用硅胶柱色谱对乙酸乙酯浸膏进行分离，石油醚:乙酸乙酯＝ (100:0)～(0:100)梯度洗脱，并按体积收集每个梯度冲洗8个柱体积收集所得流份并进行浓缩，得16个极性段。
c.取石油醚-乙酸乙酯＝85:15洗脱部分上MCI柱，分别采用纯水、 30％甲醇、60％甲醇、90％甲醇、100％甲醇溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱8个柱体积，浓缩得到各个极性段，即即纯水段、30％甲醇水段、60％甲醇水段、90％甲醇水段、纯甲醇段。纯甲醇段再次使用硅胶柱色谱进行分离，使用石油醚-丙酮(8:1)进行洗脱，收集洗脱液，即可到本发明的Japonicone A,采用制备薄层色谱分离，二氯甲烷-甲醇 (10:1)展开，刮取目标产物色谱带，以甲醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得Japonicone A 12.5mg。
(3)化合物的结构鉴定：白色粉末，可溶于甲醇、丙酮、氯仿、DMSO 等溶剂；由高分辨质谱正离子模式检测m/z 461.2520[M+Na]+可确定分子式为C24H38O7；根据化合物的13C-NMR(CDCl3,100MHz)图谱，共有24个碳信号，结合DEPT和HSQC谱可知，分别含有4个甲基、4个亚甲基、6 个次亚甲基【其中1个与氧原子相连(δC 81.5)和3个烯碳(δC 110.8， 143.3和138.7)】和6个季碳【其中2个羰基碳(δC 214.5和209.9)，1 个加氧δC 79.1和1个烯碳δC125.0】。
此外,1H-NMR(CDCl3,400MHz)谱中，在高场显示四个甲基单峰信号【δH1.52(3H,s),1.27(3H，d，J＝7.0Hz),1.17(3H，s)和1.14(3H，s)】；在低场显示3个烯氢信号δH 7.37(1H,t,J＝1.6Hz),7.24(1H,s)和 6.28(1H,d,J＝0.8Hz)为典型的β-单取代呋喃环信号。上述数据表明，该化合物为呋喃型二萜，具有两个游离羰基。该化合物的二维HMBC谱中，化学位移为δH 1.52(H3-18)，δH 1.14(H3-19)的二个甲基同时与化学位移为214.5(C-3)，46.2(C-4)，52.8(C-5)的碳有远程相关，推测这两个甲基共同连接在C-4上，并且一个羰基连接在C-3上；另外一个羰基通过H-5(3.59，s)与δC 209.9相关，确认羰基连接在C-6上；两个羟基连接C-7和C-9上，通过7-H(δH 3.76,1H,dd,J＝5.9,3.2Hz)和H3-17与 C-8和C-9远程相关，H3-17和H3-20都与与C-9远程相关推测，H2-11(δH 1.76,1.98)与C-9、C-10、C-12(δC 21.3)和C-13(δC 125.0)相关推测单取代的呋喃环通过C-11、C-12碳链与C-9相连；H2-1(δH 2.35，1.84)与C-10、C-20(δC 17.3)、C-5、C-3相关，H2-2(δH 2.33，2.78)与C-10， C-1，C-3相关，H-5(δH3.59)与C-4、C-6、C-10、C-20相关，H2-12(δH 2.57)与C-9、C-13、C-14(110.8)和C-16(138.7)相关进一步证明了以上推测。化合物的相对构型通过NOESY谱进行推断，H-7，H-8，H2-11， H3-18与H3-20相关，表明H-7，H-8，H3-18，H3-20在环的同侧(β方向)，同理，7-OH，H3-17，H3-19和H-5，7-OH，H3-17和9-OH相关，表明它们位于另一侧(α方向)。具体波谱数据见表1。
(4)核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AV-400spectrometer测定，数据见表1。
(5)核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AV-100spectrometer测定，数据见表2。
实施例2化合物Japonicone B的提取、分离纯化和结构鉴定
(1)药材的提取：称取益母草药材50kg，粉碎，加20倍量80％v/v 乙醇回流提取2次，每次3h，提取液减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.5 kg；
(2)化合物的分离纯化：
a.将乙醇浸膏用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并乙酸乙酯部分，减压回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏500g；
b.采用硅胶柱色谱对乙酸乙酯浸膏进行分离，石油醚:乙酸乙酯＝ (100:0)～(0:100)梯度洗脱，并按体积收集每个梯度冲洗8个柱体积收集所得流份并进行浓缩，得16个极性段。
c.取石油醚-乙酸乙酯＝85:15洗脱部分上MCI柱，分别采用纯水、30％甲醇、60％甲醇、90％甲醇、100％甲醇溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱8个柱体积，浓缩得到各个极性段，即即纯水段、30％甲醇水段、60％甲醇水段、 90％甲醇水段、纯甲醇段。纯甲醇段再次使用硅胶柱色谱进行分离，使用石油醚-丙酮(6:1)进行洗脱，收集洗脱液，即可到本发明的Japonicone B，采用制备薄层色谱分离，二氯甲烷-甲醇(8:1)展开，刮取目标产物色谱带，以甲醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得Japonicone B 16.8mg。
(3)化合物的结构鉴定：白色粉末，可溶于甲醇、丙酮、氯仿、DMSO 等溶剂；由高分辨质谱正离子模式检测m/z 393.2278[M+H]+可确定分子式为C22H33O6；化合物的核磁数据与Japonicone A的核磁数据比较，发现两者非常接近，所不同的是化合物Japonicone B比Japonicone A少了 C-3[δC 214.5]的酮羰基信号，而多了一个连氧次甲基[δH 4.49(1H,dd, J＝3.2,2.2Hz)；δC 79.6]和一个乙酰氧基的信号峰[δH 2.07(3H，s)；δC 21.0和172.4]。化合物的相对构型通过NOESY谱进行推断，H-8，H2-11 与H3-20相关，表明H-8，H3-20在环的同侧(β方向)，同理，H-3,H-5 与H3-19相关,H-5与7-H相关，H-7与H3-17相关，表明它们位于另一侧 (α方向)。具体波谱数据见表1。
(4)核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AV-400spectrometer测定，数据见表1。
(5)核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AV-100spectrometer测定，数据见表2。
实施例3化合物Japonicone C的提取、分离纯化和结构鉴定
(1)药材的提取：称取益母草药材50kg，粉碎，加20倍量80％v/v 乙醇回流提取2次，每次3h，提取液减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.5 kg；
(2)化合物的分离纯化：
a.将乙醇浸膏用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并乙酸乙酯部分，减压回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏500g；
b.采用硅胶柱色谱对乙酸乙酯浸膏进行分离，石油醚:乙酸乙酯＝ (100:0)～(0:100)梯度洗脱，并按体积收集每个梯度冲洗8个柱体积收集所得流份并进行浓缩，得16个极性段。
c.取石油醚-乙酸乙酯＝85:15洗脱部分上MCI柱，分别采用纯水、30％甲醇、60％甲醇、90％甲醇、100％甲醇溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱8个柱体积，浓缩得到各个极性段，即即纯水段、30％甲醇水段、60％甲醇水段、90％甲醇水段、纯甲醇段。纯甲醇段再次使用硅胶柱色谱进行分离，使用石油醚-丙酮(5:1)进行洗脱，收集洗脱液，即可到本发明的Japonicone D，采用制备薄层色谱分离，二氯甲烷-甲醇(6:1)展开，刮取目标产物色谱带，以甲醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得Japonicone C 18.3mg。
(3)化合物的结构鉴定：白色粉末，可溶于甲醇、丙酮、氯仿、DMSO 等溶剂；由高分辨质谱正离子模式检测m/z 349.2017[M+H]+可确定分子式为C20H28O5；化合物的氢谱和碳谱与Japonicone A氢谱和碳谱的非常接近，主要区别在于化合物Japonicone A的C-5酮羰基位置转移到了 Japonicone C的C-7,这是通过H-5,H-6,H-8,H3-17都与C-7相关推断，并且1H-1H COSY谱中存在δH 2.68(d,J＝11.5Hz,H-5)and 4.31(dd,J ＝11.5,0.8Hz,H-6)相关信号。化合物的相对构型通过NOESY谱进行推断，H-8，H2-18，H3-20与H-6相关，H3-20与H2-11相关，表明H-6，H-8， H2-11，H3-18，H3-20在环的同侧(β方向)，同理，H-5与H3-19相关, 表明它们位于另一侧(α方向)。具体波谱数据见表1。
(4)核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AV-400spectrometer测定，数据见表1。
(5)核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AV-100spectrometer测定，数据见表2。
实施例4化合物Japonicone D的提取、分离纯化和结构鉴定
(1)药材的提取：称取益母草药材50kg，粉碎，加20倍量80％v/v 乙醇回流提取2次，每次3h，提取液减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.5 kg；
(2)化合物的分离纯化：
a.将乙醇浸膏用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并乙酸乙酯部分，减压回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏500g；
b.采用硅胶柱色谱对乙酸乙酯浸膏进行分离，石油醚:乙酸乙酯＝ (100:0)～(0:100)梯度洗脱，并按体积收集每个梯度冲洗8个柱体积收集所得流份并进行浓缩，得16个极性段。
c.取石油醚-乙酸乙酯＝85:15洗脱部分上MCI柱，分别采用纯水、30％甲醇、60％甲醇、90％甲醇、100％甲醇溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱8个柱体积，浓缩得到各个极性段，即即纯水段、30％甲醇水段、60％甲醇水段、90％甲醇水段、纯甲醇段。纯甲醇段再次使用硅胶柱色谱进行分离，使用石油醚-丙酮(4:1)进行洗脱，收集洗脱液，即可到本发明的Japonicone D，采用制备薄层色谱分离，二氯甲烷-甲醇(5:1)展开，刮取目标产物色谱带，以甲醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得Japonicone D 12.9mg。
(3)化合物的结构鉴定：白色粉末，可溶于甲醇、丙酮、氯仿、DMSO 等溶剂；由高分辨质谱正离子模式检测m/z 331.1908[M+H]+可确定分子式为C20H27O4；化合物的氢谱和碳谱与Japonicone C氢谱和碳谱的非常接近，所不同的是，化合物Japonicone C 1H-NMR谱中归属的H-8【δH 3.09 (q,J＝6.6Hz,1H)】质子信号和13C-NMR谱中归属的C-8(δC48.7)和 C-9(δC 82.6)两个碳信号在化合物Japonicone D的核磁共振谱中消失，而化合物JaponiconeD的13C-NMR多出两个芳香碳(δC129.5和165.7)信号，结合MS给出的分子式，表明JaponiconeC中的H-8和9-OH被双键取代。化合物的相对构型通过NOESY谱进行推断，H3-18与H3-20相关，表明 H3-18，H3-20在环的同侧(β方向)，同理，H-5，H-6与H3-19相关，表明它们位于另一侧(α方向)。具体波谱数据见表1。
(4)核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AV-400spectrometer测定，数据见表1。
(5)核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AV-100spectrometer测定，数据见表2。
实施例5化合物Japonicone E的提取、分离纯化和结构鉴定
(1)药材的提取：称取益母草药材50kg，粉碎，加20倍量80％v/v 乙醇回流提取2次，每次3h，提取液减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.5 kg；
(2)化合物的分离纯化：
a.将乙醇浸膏用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并乙酸乙酯部分，减压回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏500g；
b.采用硅胶柱色谱对乙酸乙酯浸膏进行分离，石油醚:乙酸乙酯＝(100:0)～(0:100)梯度洗脱，并按体积收集每个梯度冲洗8个柱体积收集所得流份并进行浓缩，得16个极性段。
c.取石油醚-乙酸乙酯＝90:10洗脱部分上MCI柱，分别采用纯水、30％甲醇、60％甲醇、90％甲醇、100％甲醇溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱8个柱体积，浓缩得到各个极性段，即即纯水段、30％甲醇水段、60％甲醇水段、90％甲醇水段、纯甲醇段。纯甲醇段再次使用硅胶柱色谱进行分离，使用石油醚-丙酮(10:1)进行洗脱，收集洗脱液，即可到本发明的Japonicone E，采用制备薄层色谱分离，二氯甲烷-甲醇(8:1)展开，刮取目标产物色谱带，以甲醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得Japonicone E 19.1mg。
(3)化合物的结构鉴定：白色粉末，可溶于甲醇、丙酮、氯仿、DMSO 等溶剂；由高分辨质谱正离子模式检测m/z 363.1801[M+H]+可确定分子式为C20H27O6；化合物的核磁数据与Japonicone D的非常接近，唯一显著差异在Japonicone E 1H-NMR谱中Japonicone D中的β-单取代呋喃环信号消失，而从13C-NMR谱中出现δC 100.8(C-16)，118.1(C-14)，170.9(C-13)，和173.3(C-15)信号，确认为α，β-不饱和γ-内酯信号，羰基连接在C-15上，并与结构类似物Sibiricinone A的13C-NMR谱比较，进一步确认了Japonicone E的结构。化合物的相对构型通过NOESY谱进行推断，H3-18与H3-20相关，表明H3-18，H3-20在环的同侧(β方向)，同理，H-5，H-6与H3-19相关，表明它们位于另一侧(α方向)。具体波谱数据见表1。
(4)核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AV-400spectrometer测定，数据见表1。
(5)核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AV-100spectrometer测定，数据见表2。
实施例6化合物Japonicone F的提取、分离纯化和结构鉴定
(1)药材的提取：称取益母草药材50kg，粉碎，加20倍量80％v/v 乙醇回流提取2次，每次3h，提取液减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.5 kg；
(2)化合物的分离纯化：
a.将乙醇浸膏用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并乙酸乙酯部分，减压回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏500g；
b.采用硅胶柱色谱对乙酸乙酯浸膏进行分离，石油醚:乙酸乙酯＝ (100:0)～(0:100)梯度洗脱，并按体积收集每个梯度冲洗8个柱体积收集所得流份并进行浓缩，得16个极性段。
c.取石油醚-乙酸乙酯＝90:10洗脱部分上MCI柱，分别采用纯水、30％甲醇、60％甲醇、90％甲醇、100％甲醇溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱8个柱体积，浓缩得到各个极性段，即即纯水段、30％甲醇水段、60％甲醇水段、90％甲醇水段、纯甲醇段。纯甲醇段再次使用硅胶柱色谱进行分离，使用石油醚-丙酮(8:1)进行洗脱，收集洗脱液，即可到本发明的Japonicone F，采用制备薄层色谱分离，二氯甲烷-丙酮(6:1)展开，刮取目标产物色谱带，以甲醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得Japonicone F 14.7mg。
(3)化合物的结构鉴定：白色粉末，可溶于甲醇、丙酮、氯仿、DMSO 等溶剂；由高分辨质谱正离子模式检测m/z 377.1967[M+H]+可确定分子式为C21H29O6；化合物的核磁数据与Japonicone E比较，多出了一个碳信号，通过核磁数据分析，发现明显的甲氧基δH 3.55(3H,s)信号，通过HMBC谱可知与C-16相连。13C-NMR谱中出现α,β-不饱和γ-内酯信号【δC104.5(C-15),138.1(C-13),145.5(C-13)，和173.1(C-16)】，并与结构类似物SibiricinoneC的13C-NMR谱比较，进一步确认了 Japonicone F的结构。化合物的相对构型通过NOESY谱进行推断，H-5 【δH 2.02(1H,d,J＝2.4Hz)】，H-6【δH 4.19(1H,d,J＝2.4Hz)】与H3-19相关，表明它们位于同一侧(α方向)，OH-6则在环的另一侧(β方向)。具体波谱数据见表1。
(4)核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AV-400spectrometer测定，数据见表1。
(5)核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AV-100spectrometer测定，数据见表2。
实施例7化合物Japonicone G的提取、分离纯化和结构鉴定
(1)药材的提取：称取益母草药材50kg，粉碎，加20倍量80％v/v 乙醇回流提取2次，每次3h，提取液减压回收溶剂后，得到乙醇浸膏1.5 kg；
(2)化合物的分离纯化：
a.将乙醇浸膏用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，合并乙酸乙酯部分，减压回收溶剂，得乙酸乙酯浸膏500g；
b.采用硅胶柱色谱对乙酸乙酯浸膏进行分离，石油醚:乙酸乙酯＝ (100:0)～(0:100)梯度洗脱，并按体积收集每个梯度冲洗8个柱体积收集所得流份并进行浓缩，得16个极性段。
c.取石油醚-乙酸乙酯＝90:10洗脱部分上MCI柱，分别采用纯水、30％甲醇、60％甲醇、90％甲醇、100％甲醇溶液梯度洗脱，每个梯度洗脱8个柱体积，浓缩得到各个极性段，即即纯水段、30％甲醇水段、60％甲醇水段、90％甲醇水段、纯甲醇段。纯甲醇段再次使用硅胶柱色谱进行分离，使用石油醚-丙酮(6:1)进行洗脱，收集洗脱液，即可到本发明的Japonicone F，采用制备薄层色谱分离，二氯甲烷-甲醇(6:1)展开，刮取目标产物色谱带，以甲醇洗脱，收集洗脱液，回收溶剂，得Japonicone G 15.4mg。
(3)化合物的结构鉴定：白色粉末，可溶于甲醇、丙酮、氯仿、DMSO 等溶剂；由高分辨质谱正离子模式检测m/z 361.1656[M+H]+可确定分子式为C20H24O6；化合物的核磁数据与Japonicone F接近，区别在 Japonicone F 1H NMR中的甲氧基δH 3.55(3H,s)和两个质子【2.02(d,J ＝2.4Hz,H-5),4.19(1H,d,J＝2.4Hz,H-6)】，和13C NMR谱中C-5 (δC 44.2)和C-8(δC34.9)的信号消失，而化合物Japonicone G的13C-NMR 多出两个芳香碳(δC 140.5，127.8)信号,推测化合物有一个△5,6双键。具体波谱数据见表1。
(4)核磁共振氢谱(1H-NMR)：Bruker-AV-400spectrometer测定，数据见表1。
(5)核磁共振碳谱(13C-NMR)：Bruker-AV-100spectrometer测定，数据见表2。
表1化合物JaponiconeA-G(1a-7a)的氢谱数据
Figure RE-GDA0002116860610000141
Figure RE-GDA0002116860610000151
表2化合物Japonicone A-G的碳谱数据
Figure RE-GDA0002116860610000152
试验例1：体外PGE2抑制活性筛选
1.实验材料
1.1.细胞株
小鼠巨噬细胞系RAW 264.7，来源于中医科学院。
1.2.药品与试剂
Japonicone A–G(根据实施例1-7的方法制备)
脂多糖(LPS)：南京大治生物科技有限公司
DMSO，阿拉丁，批号：D1712055
FBS：FoundationTM，GEMINI，Cat:900-108，批号：A80E00G
前列腺素E2(PGE2)ELISA试剂盒，恩佐生命科学，批号：03181616C
2.实验仪器
Thermo Scientific BB15型CO2细胞培养箱，美国热电
Nikon TS100型倒置显微镜
超净工作台，AIRTECH，型号：A10051560
ZW-A型微量振荡器，常州国华仪器有限公司
Therom VarioSkan Flash多功能读数仪
移液器，Therom公司
离心机，湘仪，型号：L530
3.试验方法
3.1.试剂配制
受试物用DMSO配制成所需浓度的母液，取1μL加入1mL无血清DMEM，混匀后24孔板每孔加入495μL，所有样品做2复孔进行复筛。
3.2.实验方法
将细胞以0.25％胰酶(含0.02％EDTA)消化，含10％FBS的DMEM培养基调整细胞密度为1×105个/ml，均匀接种至24孔板，每孔400μL，种板后放入培养箱培养24小时。
培养24小时后，取出24孔板，吸去上清液，加入无血清的DMEM培养基配制的含药培养基：
1组：空白对照组：每孔加入495mL无血清的DMEM培养基；
2组：溶媒组：每孔加入495μL含千分之一DMSO的无血清DMEM培养基；
3组：模型组：每孔加入495μL无血清的DMEM培养基；
4组：Japonicone A组：每孔加495μL含25ug/ml Japonicone A的培养基；
5组：Japonicone B组：每孔加495μL含25ug/ml Japonicone B的培养基；
6组：Japonicone C组：每孔加495μL含25ug/ml Japonicone C的培养基；
7组：Japonicone D组：每孔加495μL含25ug/ml Japonicone D的培养基；
8组：Japonicone E组：每孔加495μL含25ug/ml Japonicone E的培养基；
9组：Japonicone F组：每孔加495μL含25ug/ml Japonicone F的培养基；
10组：Japonicone G组：每孔加495μL含25ug/ml Japonicone G的培养基；
所有样品均只做单孔进行初筛，加药完毕后将24孔板放入CO2细胞培养箱培养1小时。
1小时后，除空白对照和溶媒组外，其余每孔加入5μL的100μg/ml 的LPS(终浓度为1μg/mL)，空白对照和溶媒组每孔加入5μL的无血清的 DMEM培养基，加药完毕后将24孔板放入CO2细胞培养箱继续培养18小时。
18小时后，显微镜下观察细胞状态，并拍照记录。
收集细胞培养液，所有孔上清用无血清DMEM稀释3倍，按Elisa试剂盒说明书检测PGE2含量。
4.实验结果
所有计量资料采用x±s表示，采用下列公式计算抑制率：
Figure RE-GDA0002116860610000171
表3益母草半日花烷型二萜JaponiconeA–G对小鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞上清PGE2的影响(x±s,n＝6)
Figure RE-GDA0002116860610000172
Figure RE-GDA0002116860610000181
如表3所示，益母草半日花烷型二萜Japonicone A–G分别在25.00ug/ml 时，对小鼠巨噬细胞的抑制率分别为65.38-86.43％，益母草半日花烷型二萜Japonicone A–G可以抑制PGE2的活性，其中Japonicone G显示出最强的抗炎作用。
试验例2：体外IL-6抑制活性筛选
1.实验材料
1.1.细胞株
小鼠巨噬细胞系RAW 264.7，来源于中医科学院。
1.2.药品与试剂
Japonicone A–G(根据实施例1-7的方法制备)
脂多糖(LPS)：南京大治生物科技有限公司
DMSO，阿拉丁，批号：D1712055
FBS：Lonsera，Cat:S711-001S，Lot：NR06611
Mouse IL-6 ELISA kit，Invitrogen，Cat:BMS603-2批号：146053017
2.实验仪器：
Thermo Scientific BB15型CO2细胞培养箱，美国热电
Nikon TS100型倒置显微镜
超净工作台，AIRTECH，型号：A10051560
ZW-A型微量振荡器，常州国华仪器有限公司
Therom VarioSkan Flash多功能读数仪
移液器，Therom公司
离心机，湘仪，型号：L530
3.试验方法
3.1.试剂配制
受试物用DMSO配制成所需浓度的母液，取1μL加入1mL无血清DMEM，混匀后24孔板每孔加入495μL，所有样品做2复孔进行复筛。
3.2.实验方法
将细胞以0.25％胰酶(含0.02％EDTA)消化，含10％FBS的DMEM培养基调整细胞密度为1×105个/ml，均匀接种至24孔板，每孔400μL，种板后放入培养箱培养24小时。
培养24小时后，取出24孔板，吸去上清液，加入无血清的DMEM培养基配制的含药培养基：
1组：空白对照组：每孔加入495mL无血清的DMEM培养基；
2组：溶媒组：每孔加入495μL含千分之一DMSO的无血清DMEM培养基；
3组：模型组：每孔加入495μL无血清的DMEM培养基；
4组：Japonicone A组：每孔加495μL含25ug/ml Japonicone A的培养基；
5组：Japonicone B组：每孔加495μL含25ug/ml Japonicone B的培养基；
6组：Japonicone C组：每孔加495μL含25ug/ml Japonicone C的培养基；
7组：Japonicone D组：每孔加495μL含25ug/ml Japonicone D的培养基；
8组：Japonicone E组：每孔加495μL含25ug/ml Japonicone E的培养基；
9组：Japonicone F组：每孔加495μL含25ug/ml Japonicone F的培养基；
10组：Japonicone G组：每孔加495μL含25ug/ml Japonicone G的培养基；
加药完毕后将24孔板放入CO2细胞培养箱培养1小时。
1小时后，除空白对照组和溶媒组外，其余每孔加入5μL的100μg/ml 的LPS(终浓度为1μg/mL)，溶媒组每孔加入5μL的无血清的DMEM培养基，加药完毕后将24孔板放入CO2细胞培养箱继续培养18小时。
18小时后收集细胞培养液，按Elisa试剂盒说明书检测IL-6含量。
4.实验结果
所有计量资料采用x±s表示，采用下列公式计算抑制率：
Figure RE-GDA0002116860610000201
表4益母草半日花烷型二萜JaponiconeA–G对小鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞上清IL-6的影响(x±s,n＝6)
Figure RE-GDA0002116860610000202
通过研究发现：在终浓度为25ug/mL时，受试化合物均有一定的抗炎活性，其中Japonicone G活性最强。
由以上试验例可知，益母草中分离获得的半日花烷型二萜有一定的抗炎活性，为新颖的天然抗炎药物的开发提供了新的选择。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (1)

1.一种半日花烷型化合物或其药学上可接受的盐在制备抗炎药物中的应用，其特征在于，该化合物具有以下结构：
Figure FDA0003929209170000011
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Yao Peng et al.."Novel labdane diterpenoids from the aerial parts of Leonurus japonicus".《Phytochemistry Letters》.2017, *

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