CN114853712B - 一种色烷型或色烯型杂萜类化合物及其提取方法和应用 - Google Patents
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- C07D311/70—Benzo[b]pyrans, not hydrogenated in the carbocyclic ring other than with oxygen or sulphur atoms in position 2 or 4 with two hydrocarbon radicals attached in position 2 and elements other than carbon and hydrogen in position 6
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- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
一种色烷型或色烯型杂萜类化合物及其提取方法和应用，属于中药提取领域，具体涉及一种从兴安杜鹃中分离的如通式(Ⅰ)，(Ⅱ)和(Ⅲ)所示的色烷型或色烯型杂萜类化合物、该色烷型或色烯型杂萜类的异构体，或该色烷型或色烯型杂萜类化合物在药学上可接受的盐，同时还提供了其提取方法，还包括该化合物或包含的药物组合物对炎症有抑制作用，可以用于制备抗炎药物。其丰富兴安杜鹃活性物质的结构多样性，在此基础上，为后续得到的单体化合物进行相关生物活性测试奠定基础，为新药开发提供活性先导化合物，同时也为兴安杜鹃药材的深层次研究与开发提供理论依据。
Description
技术领域
本发明属于中药提取领域，具体涉及一种色烷型或色烯型杂萜类化合物及其提取方法和应用，特别涉及一种从兴安杜鹃中分离的色烷型或色烯型杂萜类化合物及其提取方法和在制备抗炎的药物中的应用。
背景技术
兴安杜鹃(Rhododendron dauricum L.)为杜鹃花科(Ericaceae)杜鹃花属(Rhododendron)半常绿灌木，不仅具有很高的观赏价值和园林应用价值，也具有较高的药用价值，主要分布在黑龙江、辽宁、吉林、内蒙古等地。2020版《中国药典》中记载：兴安杜鹃干燥叶为“满山红”，味辛，性寒；归肺、脾经，具有止咳祛痰的功效，主要用于治疗咳嗽气喘痰多(国家药典委员会.中华人民共和国药典:一部[M].北京:中国医药科技出版社,2020:387.)，国内外学者对兴安杜鹃的化学成分以及药理作用的研究较少，主要含有三萜类、黄酮类以及色烷/色烯型杂萜类化学成分(谢阳阳.兴安杜鹃的化学成分研究[D].华中科技大学,2014.；Ye C,Jin M,Li R,Sun J,Li G.Phytochemical and chemotaxonomic study onthe leaves of Rhododendron dauricum L[J].Biochemical Systematics and Ecology,2020,90:104038.)，并且通过实验证明兴安杜鹃具有抗HIV的活性(Kashiwada Y,YamazakiK,Ikeshiro Y,Yamagishi T,Fujioka T,Mihashi K,Mizuki K,Cosentino L M,Fowke K,Morris-Natschke S L,Lee K H.Isolation of rhododaurichromanic acid B and theanti-HIV principles rhododaurichromanic acid A and rhododaurichromenic acidfrom Rhododendron dauricum[J].Tetrahedron,2001,57(8):1559-1563.)，以及抑制血管生成的作用(Dai F J,Gao L,Zhao Y,Wang C J,Xie S Q.Farrerol inhibitedangiogenesis through Akt/mTOR,Erk and Jak2/Stat3 signal pathway[J].Phytomedicine,2016,23:686-693.)。但是并没有发现其能够对脂多糖(LPS)诱导的RAW264.7细胞中一氧化氮(NO)产生的抑制作用。
过量的LPS会诱导巨噬细胞中一氧化氮合酶(NOS)的激活并表达产生NO。NO是多种细胞系统的胞内信使，在许多生理与病理过程中发挥着重要的作用。研究表明，在炎症反应发生的过程中，NO的含量会有明显的升高，这一过程证实了NO与炎症反应密切相关。如果能有效地抑制NO过量生成，则对炎症相关的疾病具有潜在的治疗作用。
发明内容
本发明为了将兴安杜鹃的药用价值发挥到最大，对兴安杜鹃枝叶进行了系统的成分研究，提取了新的色烷型或色烯型杂萜类化合物，利用核磁、红外、质谱等手段对色烷型或色烯型杂萜类化合物的结构进行了确证，并检测提取到的色烷型或色烯型杂萜类化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO产生的抑制作用。
本发明的首要目的是提供一种色烷型或色烯型杂萜类化合物。
本发明的第二个目的是提供一种色烷型或色烯型杂萜类化合物的提取方法。
本发明的第三个目的是提供一种含有色烷型或色烯型杂萜类化合物的药物组合物。
本发明的第四个目的是提供一种色烷型或色烯型杂萜类化合物或该色烷型或色烯型杂萜类化合物的异构体、该色烷型或色烯型杂萜类化合物在药学上可接受的盐或包含该色烷型或色烯型杂萜类化合物的药物组合物在制备抗炎药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案概述如下：
本发明的一种色烷型或色烯型杂萜类化合物，分为色烷型杂萜类化合物或色烯型杂萜类化合物；
其中，所述的色烷型杂萜类化合物，其为结构通式(Ⅰ)或结构通式(Ⅱ)所示的色烷型杂萜类化合物或该色烷型杂萜类化合物的异构体、或该色烷型杂萜类化合物在药学上可接受的盐；
其中，结构通式(Ⅰ)或结构通式(Ⅱ)如下：
所述的色烯型杂萜类化合物，其为结构通式(Ⅲ)所示的色烯型杂萜类化合物或该色烯型杂萜类化合物的异构体、或该色烯型杂萜类化合物在药学上可接受的盐；
其中，结构通式(Ⅲ)如下：
以上结构通式中：R1，R2和R4各自独立的为α-H或β-H，R3，R5和R11各自独立的为α-甲基或β-甲基，R6选自H或羧基的一种，R7选自羟基，甲氧基，乙酰氧基中的一种，R8选自H或＝O的一种，R9选自H,α-羟基，α-甲氧基，α-乙酰氧基或β-羟基，β-甲氧基，β-乙酰氧基的一种，R10选自H，羟基，甲氧基，乙酰氧基的一种，R12选自甲基或异戊稀基的一种。
进一步的，所述的色烷型或色烯型杂萜类化合物，其为如下结构式1～8所示的色烷型或色烯型杂萜类化合物中的任一种或该色烷型或色烯型杂萜类化合物的异构体、该色烷型或色烯型杂萜类化合物在药学上可接受的盐；
所述的色烷型杂萜类化合物在药学上可接受的盐，为色烷型杂萜类化合物和药学上可接受的盐形成的混合物，其中，药学上可接受的盐选自钠盐、钾盐、氨盐、盐酸盐及硫酸盐中的一种或几种。
所述的色烯型杂萜类化合物在药学上可接受的盐，为色烯型杂萜类化合物和药学上可接受的盐形成的混合物，其中，药学上可接受的盐选自钠盐、钾盐、氨盐、盐酸盐及硫酸盐中的一种或几种。
所述的色烷型杂萜类化合物的异构体，选自：光学异构体、外消旋体以及它们的混合物。
本发明还提供了色烷型或色烯型杂萜类化合物的提取方法，包括如下步骤：
(1)以兴安杜鹃枝叶为原料，加入体积浓度70％～95％乙醇水溶液，回流提取2～4次，每次提取2～4小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到总浸膏；其中，按固液比，兴安杜鹃枝叶：乙醇水溶液＝1g：(8～15)mL；
(2)将总浸膏分散到5～10质量倍的水中，依次用5～10质量倍体积的石油醚、乙酸乙酯萃取，回收溶剂，分别得到石油醚萃取浓缩液、乙酸乙酯萃取浓缩液和水相；
(3)乙酸乙酯萃取浓缩液经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:0、100:1、90:1、80:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1和0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比80:1的馏分E3、体积比50:1的馏分E4、体积比30:1的馏分E5；
(4)馏分E3浓缩后，浓缩液E3经过MCI柱色谱分离，以体积比为60:40～0:100的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，进一步纯化得到色烯型杂萜类化合物7和色烯型杂萜类化合物8；
馏分E4浓缩后，浓缩液E4经过凝胶柱色谱分离，进一步纯化得到色烷型杂萜类化合物1和色烷型杂萜类化合物2；
馏分E5浓缩后，浓缩液E5经过硅胶柱色谱分离，以体积比为100:0～0:100的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，进一步纯化得到色烷型杂萜类化合物3～色烷型杂萜类化合物6。
上述提取方法中，所述的质量倍为加入的固态物质和液态物质的质量体积比。
上述提取方法中，所述步骤(4)对馏分E3、馏分E4和馏分E5具体分离纯化过程为：
馏分E3浓缩后经过MCI柱色谱分离，以体积比为60:40、70:30、80:20和0:100的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为60:40的馏分，记为E32；
馏分E32浓缩后经硅胶柱色谱分离，以体积比为30:1、20:1、15:1、10:1、5:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为20:1的馏分，记为E322；
馏分E322浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积比为65:55的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到色烯型杂萜类化合物7和色烯型杂萜类化合物8的混合物，色烯型杂萜类化合物7和色烯型杂萜类化合物8的混合物经手性HPLC色谱柱拆分，以体积比为10:1的正己烷：异丙醇为流动相，进行纯化，得到色烯型杂萜类化合物7和色烯型杂萜类化合物8；
馏分E4浓缩后经过凝胶柱色谱分离，以体积比为1:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂洗脱，收集中间馏分，记为E42；
馏分E42浓缩后经MCI柱色谱分离，依次以体积比为60:40、70:30、80:20、90:10和100:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为60:40的馏分，记为E422；
馏分E422浓缩后经硅胶柱色谱，以体积比为30:1、20:1、15:1、10:1、5:1和0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为10:1的馏分，记为E4223；
馏分E4223浓缩后经ODS柱色谱分离，依次以体积比为20:80、40:60、50:50、70:30、100:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为50:50的馏分，记为E42233；
馏分E42233浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积比为45:55的乙腈-水为流动相，进行纯化，得到色烷型杂萜类化合物1和色烷型杂萜类化合物2的混合物，色烷型杂萜类化合物1和色烷型杂萜类化合物2的混合物经手性HPLC色谱柱拆分，以10:1的正己烷：异丙醇为流动相，进行纯化，得到色烷型杂萜类化合物1和色烷型杂萜类化合物2。
馏分E5浓缩后经过硅胶柱色谱分离，以体积比为100:0、80:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1和0:100的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集二氯甲烷和甲醇的体积比为20:1的馏分，记为E54；
馏分E54浓缩后经过凝胶柱色谱分离，以体积比为1:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂洗脱，收集中间馏分，记为E542；
馏分E542浓缩后经硅胶柱色谱，以体积比为50:1、30:1、20：1、15:1、10:1、5:1和0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为5:1的馏分，记为E5422；
馏分E5422浓缩后经硅胶柱色谱，以体积比为30:1、20:1、15:1、10:1、5:1和0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为5:1的馏分，记为E54229；
馏分E54229浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积比为75:25的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到色烷型杂萜类化合物3和色烷型杂萜类化合物4的混合物以及色烷型杂萜类化合物5和色烷型杂萜类化合物6的混合物，色烷型杂萜类化合物3和色烷型杂萜类化合物4的混合物经手性HPLC色谱柱拆分，以10:1的正己烷：异丙醇为流动相，进行纯化，得到色烷型杂萜类化合物3和色烷型杂萜类化合物4；色烷型杂萜类化合物5和色烷型杂萜类化合物6的混合物经手性HPLC色谱柱拆分，以50:50的乙腈：水为流动相进行纯化，得到色烷型杂萜类化合物5和色烷型杂萜类化合物6。
所述色烷型或色烯型杂萜类化合物为来自兴安杜鹃枝叶部分提取物。
所述兴安杜鹃枝叶部分提取物在制备抗炎药物中的应用。
一种药物组合物，其包括所述的色烷型或色烯型杂萜类化合物、该色烷型或色烯型杂萜类化合物的异构体、该色烷型或色烯型杂萜类化合物在药学上可接受的盐中的一种或多种；还包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂中的一种或它们的组合。所述药物组合物，根据给药途径，分为口服药物组合物或注射给药药物组合物，所述的药物组合物的剂型选自：片剂、胶囊剂、粉剂、糖浆剂和针剂中的一种。
本发明还提供了所述的色烷型或色烯型杂萜类化合物、该色烷型或色烯型杂萜类化合物的异构体、该色烷型或色烯型杂萜类化合物在药学上可接受的盐或所述的药物组合物在制备抗炎药物中的应用。
本发明的一种色烷型或色烯型杂萜类化合物及其提取方法和应用，其优点在于：
本发明的色烷型或色烯型杂萜类化合物或其异构体、在药学上可接受的盐或包含该色烷型或色烯型杂萜类化合物的药物组合物对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO产生的抑制作用，应用于制备抗炎药物。本发明方法进一步丰富兴安杜鹃活性物质的结构多样性，在此基础上，为后续得到的单体化合物进行相关生物活性测试奠定基础，为新药开发提供活性先导化合物，同时也为兴安杜鹃药材的深层次研究与开发提供理论依据。
附图说明
图1为色烷型杂萜类化合物化合物1～6和色烯型杂萜类化合物7-8对LPS诱导的RAW264.7中NO生成的抑制活性。
图2为不同浓度的色烯型杂萜类化合物化合物8对RAW264.7细胞的存活率。
图3为色烯型杂萜类化合物化合物8对iNOS的抑制作用。
图4为色烯型杂萜类化合物化合物8对NF-κB、磷酸化的NF-κB及其通路蛋白IκBα和磷酸化水平P-IκBα表达的情况。
图5为色烯型杂萜类化合物化合物8对NF-κB核转位的影响。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行进一步描述。
实施例1
兴安杜鹃中色烷型或色烯型杂萜类化合物的提取方法，包括如下步骤：
(1)以总干重为12.9kg的兴安杜鹃枝叶为原料，加入体积浓度95％乙醇水溶液(110L)，回流提取2次，每次提取2小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到95％乙醇层总浸膏(2.3kg)；
(2)将得到的总浸膏分散到5.2质量倍的水(12L)中，依次用5质量倍体积的石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩回收溶剂，分别得到石油醚萃取浓缩液、乙酸乙酯萃取浓缩液(560g)和水相；
(3)乙酸乙酯萃取浓缩液经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:0、100:1、90:1、80:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1和0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比80:1的馏分E3，体积比50:1的馏分E4和体积比30:1的馏分E5；
(4)馏分E3浓缩后得到20.8g浓缩液，经过MCI柱色谱分离，以体积比为60:40～0:100的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，进一步纯化得到0.9mg色烯型杂萜类化合物7和4.3mg色烯型杂萜类化合物8。
馏分E4浓缩后得到58.0g浓缩液，经过凝胶柱色谱分离，进一步纯化得到0.9mg色烷型杂萜类化合物1和4.3mg色烷型杂萜类化合物2。
馏分E5浓缩后得到70.0g浓缩液，浓缩液经过硅胶柱色谱分离，进一步纯化得到0.6mg色烷型杂萜类化合物3、3.9mg色烷型杂萜类化合物4、1.3mg色烷型杂萜类化合物5和3.9mg色烷型杂萜类化合物6。
具体分离纯化过程为：
(1)馏分E3浓缩后经过MCI柱色谱分离，以体积比为60:40、70:30、80:20和0:100的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为60:40的馏分，记为E32；
馏分E32浓缩后经硅胶柱色谱分离，以体积比为30:1、20:1、15:1、10:1、5:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为20:1的馏分，记为E322；
馏分E322浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积比为65:55的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到色烯型杂萜类化合物7和色烯型杂萜类化合物8的混合物。色烯型杂萜类化合物7和色烯型杂萜类化合物8的混合物经手性HPLC色谱柱拆分，以体积比为10:1的正己烷：异丙醇为流动相，进行纯化，得到色烯型杂萜类化合物7和色烯型杂萜类化合物8。
(2)馏分E4浓缩后经过凝胶柱色谱分离，以体积比为1:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂洗脱，收集中间馏分，记为E42；
馏分E42浓缩后经MCI柱色谱分离，依次以体积比为60:40、70:30、80:20、90:10和100:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为60:40的馏分，记为E422；
馏分E422浓缩后经硅胶柱色谱，以体积比为30:1、20:1、15:1、10:1、5:1和0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为10:1的馏分，记为E4223；
馏分E4223浓缩后经ODS柱色谱分离，依次以体积比为20:80、40:60、50:50、70:30、100:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为50:50的馏分，记为E42233；
馏分E42233浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积比为45:55的乙腈-水为流动相，进行纯化，得到色烷型杂萜类化合物1和色烷型杂萜类化合物2的混合物，色烷型杂萜类化合物1和色烷型杂萜类化合物2的混合物经手性HPLC色谱柱拆分，以10:1的正己烷：异丙醇为流动相，进行纯化，得到色烷型杂萜类化合物1和色烷型杂萜类化合物2。
(3)馏分E5浓缩后经过硅胶柱色谱分离，以体积比为100:0、80:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1和0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集二氯甲烷和甲醇的体积比为20:1的馏分，记为E54；
馏分E54浓缩后经过凝胶柱色谱分离，以体积比为1:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂洗脱，收集中间馏分，记为E542；
馏分E542浓缩后经硅胶柱色谱，以体积比为50:1、30:1、20:1、15:1、10:1、5:1和0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为5:1的馏分，记为E5422；
馏分E5422浓缩后经硅胶柱色谱，以体积比为30:1、20：1、15:1、10:1、5:1和0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为5:1的馏分，记为E54229；
馏分E54229浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积比为75:25的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到色烷型杂萜类化合物3和色烷型杂萜类化合物4的混合物以及色烷型杂萜类化合物5和色烷型杂萜类化合物6的混合物，色烷型杂萜类化合物3和色烷型杂萜类化合物4的混合物经手性HPLC色谱柱拆分，以10:1的正己烷：异丙醇为流动相，进行纯化，得到色烷型杂萜类化合物3和色烷型杂萜类化合物4；色烷型杂萜类化合物5和色烷型杂萜类化合物6的混合物经手性HPLC色谱柱拆分，以50:50的乙腈：水为流动相进行纯化，得到色烷型杂萜类化合物5和色烷型杂萜类化合物6。对提取到的色烷型杂萜类化合物1-6和色烯型杂萜类化合物7-8进行结构鉴定，具体的物理化学数据如下：
色烷型杂萜类化合物1：无色油状物， 确定色烷型杂萜类化合物1的分子式为C23H32O4，1H-NMR(600MHz,CDCl3)和13C-NMR(150MHz,CDCl3)数据见表1。
色烷型杂萜类化合物2：无色油状物， 确定色烷型杂萜类化合物2的分子式为分子式C23H32O4，1H-NMR(600MHz,CDCl3)和13C-NMR(150MHz,CDCl3)数据见表1。
色烷型杂萜类化合物3：无色油状物， 确定色烷型杂萜类化合物3的分子式为分子式C22H32O4，1H-NMR(600MHz,CDCl3)和13C-NMR(150MHz,CDCl3)数据见表2。
色烷型杂萜类化合物4：无色油状物， 确定色烷型杂萜类化合物4的分子式为分子式C22H32O4，1H-NMR(600MHz,CDCl3)和13C-NMR(150MHz,CDCl3)数据见表2。
色烷型杂萜类化合物5：无色油状物， 确定色烷型杂萜类化合物5的分子式为分子式C22H32O4，1H-NMR(600MHz,CDCl3)和13C-NMR(150MHz,CDCl3)数据见表3。
色烷型杂萜类化合物6：无色油状物， 确定色烷型杂萜类化合物6的分子式为分子式C22H32O4，1H-NMR(600MHz,CDCl3)和13C-NMR(150MHz,CDCl3)数据见表3。
色烯型杂萜类化合物7：黄色油状物， 确定色烯型杂萜类化合物7的分子式C16H18O3，1H-NMR(600MHz,CDCl3)和13C-NMR(150MHz,CDCl3)数据见表4。
色烯型杂萜类化合物8：黄色油状物， 确定色烯型杂萜类化合物8的分子式C16H18O3，1H-NMR(600MHz,CDCl3)和13C-NMR(150MHz,CDCl3))数据见表4。
表1色烷型杂萜类化合物1和色烷型杂萜类化合物2的碳谱和氢谱数据
表2色烷型杂萜类化合物3和色烷型杂萜类化合物4的碳谱和氢谱数据
表3色烷型杂萜类化合物5和色烷型杂萜类化合物6的碳谱和氢谱数据
表4色烯型杂萜类化合物7和色烯型杂萜类化合物8的碳谱和氢谱数据
通过理化数据和现代波谱学手段(HRESIMS和NMR)，结合公开文献相关数据，鉴定上述色烷型杂萜类化合物1-6和色烯型杂萜类化合物7-8的结构，确定化合物1～8均为未见文献报道的新化合物，如下所示：
实施例2
兴安杜鹃中色烷型或色烯型杂萜类化合物的提取方法，包括如下步骤：
(1)以总干重为15kg的兴安杜鹃枝叶为原料，加入体积浓度95％乙醇水溶液(120L)，回流提取2次，每次提取2小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到95％乙醇层总浸膏(2.5kg)；
(2)将得到的总浸膏分散到5.2质量倍的水(13L)中，依次用5质量倍体积的石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩回收溶剂，分别得到石油醚萃取浓缩液、乙酸乙酯萃取浓缩液(600g)和水相；
(3)乙酸乙酯萃取浓缩液经硅胶柱色谱分离，依次以体积比为100:0、100:1、90:1、80:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1和0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比80:1的馏分E3、体积比50:1的馏分E4和体积比30:1的馏分E5；
(4)馏分E3浓缩后得到30.0g浓缩液，经过MCI柱色谱分离，依次以体积比为60:40、70:30、80:02和0:100的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，进一步纯化得到1.3mg色烯型杂萜类化合物7和6.2mg色烯型杂萜类化合物8。
馏分E4浓缩后得到72.3g浓缩液，经过凝胶柱色谱分离，进一步纯化得到1.1mg色烷型杂萜类化合物1和5.4mg色烷型杂萜类化合物2。
浓缩馏分E5得到87.0g浓缩液，浓缩液经过硅胶柱色谱分离，进一步纯化得到0.75mg色烷型杂萜类化合物3、4.8mg色烷型杂萜类化合物4、1.6mg色烷型杂萜类化合物5和4.9mg色烷型杂萜类化合物6。具体分离纯化过程同实施例1。
实施例3
兴安杜鹃中色烷型或色烯型杂萜类化合物的提取方法，包括如下步骤：
(1)以总干重为20kg的兴安杜鹃枝叶为原料，加入体积浓度95％乙醇水溶液(160L)，回流提取2次，每次提取2小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到95％乙醇层总浸膏(3.125kg)；
(2)将得到的总浸膏分散到5质量倍的水(16L)中，依次用5质量倍体积的石油醚、乙酸乙酯萃取，萃取液浓缩回收溶剂，分别得到石油醚萃取浓缩液、乙酸乙酯萃取浓缩液(750g)和水相；
(3)乙酸乙酯萃取浓缩液经硅胶柱色谱分离，依次以体积比为100:0、100:1、90:1、80:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1和0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为80:1的馏分E3、体积比50:1的馏分E4和体积比30:1的馏分E5；
(4)馏分E3浓缩后得到45.0g浓缩液，经过MCI柱色谱分离，依次以体积比为60:40、70:30、80:02和0:100的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，进一步纯化得到2.0mg色烯型杂萜类化合物7和9.3mg色烯型杂萜类化合物8。
馏分E4浓缩后得到81.3g浓缩液，浓缩液经过凝胶柱色谱分离，进一步纯化得到1.3mg色烷型杂萜类化合物1和6.0mg色烷型杂萜类化合物2。
浓缩馏分E5得到93.0浓缩液，浓缩液经过硅胶柱色谱分离，进一步纯化得到0.8mg色烷型杂萜类化合物3、5.2mg色烷型杂萜类化合物4、1.7mg色烷型杂萜类化合物5和5.2mg色烷型杂萜类化合物6。具体分离纯化过程同实施例1。
实验例
上述实施例提取得到的色烷型杂萜类化合物1～6和色烯型杂萜类化合物7-8具有对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO产生的抑制作用具体如下：
取对数期生长的小鼠单核巨噬细胞RAW264.7，将细胞浓度调至3.5×104cells/well接种于96孔板中，每孔加入100μL细胞悬浮液，用浓度为20μM的色烷型杂萜类化合物1～6和色烯型杂萜类化合物7-8处理3小时，在5％CO2、37℃恒温培养箱中与LPS(1μg/mL)一起培养孵育24h。实验中同时设立对照组(RAW264.7细胞、DMSO)、模型组(RAW264.7细胞、DMSO、0.5μg/mL的LPS)、阳性药组(RAW264.7细胞、地塞米松(20μM)、0.5μg/mL的LPS)以及待测药物组(RAW264.7细胞、待测各化合物(20μM)、0.5μg/mL的LPS)。之后再吸取40μL细胞上清液放置于酶标板内，加入等体积的Griess试剂在540nm下用酶标仪测量培养基中的亚硝酸盐积累。结果如图1所示，根据图1可以看出色烷型杂萜类化合物2，色烷型杂萜类化合物4和色烷型杂萜类化合物5具有轻微的抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中NO释放活性，色烯型杂萜类化合物7和色烯型杂萜类化合物8具有对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO的产生具有很好的抑制作用。
本发明方法制备得到的色烯型杂萜类化合物8在RAW264.7细胞中的抗炎作用与机制的研究
(1)CCK8法检测色烯型杂萜类化合物8对细胞存活率的影响
对数生长期的RAW264.7细胞以35000个/孔接种于96孔板中培养至细胞汇合度为60％。换不同浓度的化合物8(0.625、1.25、2.5、5、10、20、40和80μmol/L)处理细胞。以加入相应体积的DMSO的细胞孔作为空白对照。每孔均加入10μL的含10％CCK8的培养基，培养45min后，酶标仪检测450nm处各孔的OD值计算实验组细胞存活率(以空白对照组细胞存活率为100％)。结果如图2所示，由图2可知，色烯型杂萜类化合物8对RAW264.7细胞的存活率没有显著影响。
(2)Western Blot检测色烯型杂萜类化合物8对炎症相关蛋白的表达的作用
RAW264.7细胞接种于6孔板培养至细胞汇合度为60％。实验组加入含不同浓度化合物8(2.5、5、10和20μmol/L)的培养基，模型组和对照组分别加入含有和不含有等体积DMSO的培养基处理3h后，模型组和实验组加入一定量的LPS使终浓度为0.5μg/mL，继续培养24h。弃掉培养基，清洗并收集细胞进行Western Blot实验，测定蛋白iNOS、NF-κB和磷酸化NF-κB及其通路蛋白IκBα和磷酸化IκBα的表达情况，曝光条带用Gel-Pro analyzer进行灰度分析。结果如图3所示，色烯型杂萜类化合物8可以剂量依赖性的降低iNOS的表达；结果如图4所示，同时p-NF-κB/NF-κB和p-IκBα/IκBα的比率显著降低，表明NF-κB信号通路受到抑制。
(3)色烯型杂萜类化合物8对NF-κB核易位的影响
将RAW264.7细胞接种到每孔8×104细胞的24孔板中，培养12h，然后用DMSO或2(20μM)预处理3h，并用0.5μg/mL LPS激活12h。用新鲜制备的4％多聚甲醛固定细胞10min，用PBS洗涤3次，接着用0.2％Triton X-100通透10分钟。在室温下用5％牛血清白蛋白(BSA)封闭1h后，加入1:400稀释的NF-κB(Proteintech，Cat#10745-1-AP)抗体，并在4℃下孵育过夜。通过PBS洗涤后，在室温下和暗处以1:400的稀释度添加二抗孵育1h。最后，在室温和暗处下用DAPI染色5min。然后PBS清洗并加入抗荧光淬灭封片液，在免疫荧光显微镜下观察并拍照，并获取图像。结果如图5所示。色烯型杂萜类化合物8(20μM)可以显著抑制LPS激活的RAW264.7细胞中NF-κB的p65亚基的核易位。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。
Claims (7)
1.一种色烯型杂萜类化合物，其特征在于，所述的色烯型杂萜类化合物，其为如下结构式7～8所示化合物中的任一种或该色烯型杂萜类化合物在药学上可接受的盐中任一种；
2.根据权利要求1所述的色烯型杂萜类化合物，其特征在于，所述的色烯型杂萜类化合物在药学上可接受的盐，为色烯型杂萜类化合物和药学上可接受的盐形成的混合物，其中，药学上可接受的盐选自钠盐、钾盐、氨盐、盐酸盐及硫酸盐中的一种或几种。
3.权利要求1所述的色烯型杂萜类化合物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以兴安杜鹃枝叶为原料，加入体积浓度70％～95％乙醇水溶液，回流提取2～4次，每次提取2～4小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到总浸膏；其中，按固液比，兴安杜鹃枝叶：乙醇水溶液＝1g:(8～15)mL；
(2)将总浸膏分散到水中，依次用石油醚、乙酸乙酯萃取，回收溶剂，分别得到石油醚萃取浓缩液、乙酸乙酯萃取浓缩液和水相；
(3)乙酸乙酯萃取浓缩液经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:0～0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比80:1的馏分E3；
(4)馏分E3浓缩后，浓缩液E3经过MCI柱色谱分离，以体积比为60:40～0:100的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，进一步纯化得到色烯型杂萜类化合物7和色烯型杂萜类化合物8；
对馏分E3具体分离纯化过程为：
馏分E3浓缩后经过MCI柱色谱分离，以体积比为60:40、70:30、80:20和0:100的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为60:40的馏分，记为E32；
馏分E32浓缩后经硅胶柱色谱分离，以体积比为30:1、20:1、15:1、10:1、5:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为20:1的馏分，记为E322；
馏分E322浓缩后经制备型HPLC色谱，以体积比为65:55的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到色烯型杂萜类化合物7和色烯型杂萜类化合物8的混合物，色烯型杂萜类化合物7和色烯型杂萜类化合物8的混合物经手性HPLC色谱柱拆分，以体积比为10:1的正己烷：异丙醇为流动相，进行纯化，得到色烯型杂萜类化合物7和色烯型杂萜类化合物8。
4.一种药物组合物，其包括权利要求1所述的色烯型杂萜类化合物或该色烯型杂萜类化合物在药学上可接受的盐中的一种或多种；还包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂中的一种或它们的组合。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，根据给药途径，药物组合物分为口服药物组合物或注射给药药物组合物，所述的药物组合物的剂型选自：片剂、胶囊剂、粉剂、糖浆剂和针剂中的一种。
6.权利要求1所述的色烯型杂萜类化合物或该色烯型杂萜类化合物在药学上可接受的盐在制备抗炎药物中的应用。
7.权利要求4或5所述的药物组合物在制备抗炎药物中的应用。
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