CN115772076B - 大果大戟中具有抗炎活性的二萜化合物及其提取方法和应用 - Google Patents
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Abstract
大果大戟中具有抗炎活性的二萜化合物及其提取方法和应用，属于中药提取技术领域，具体涉及从大果大戟中分离的结构式如下(I)、(II)所示的两种二萜类化合物或该化合物的在药学上可接受的盐，或包含该化合物的药物组合物对LPS诱导的RAW264.7细胞中生成NO的抑制作用，所述化合物能够用于制备抗炎药物，所述化合物中基团如权利要求书与说明书所述。
Description
技术领域
本发明属于中药提取技术领域，具体涉及大果大戟中具有抗炎活性的对映-贝壳杉烷型及对映-阿替生烷型二萜化合物及其提取方法和应用。
背景技术
大果大戟(Euphorbia wallichii Hook.f.)是大戟科(Euphorbiaceae)大戟属(Euphorbia)植物。主要分布在中国青藏高原地区以及印度、尼泊尔、克什米尔等地区。伴随着藏药的发展，大果大戟的药用价值逐渐得到发掘。常见用以治疗水肿和疗疮及皮肤炭疽等皮肤病。(中国科学院西北高原生物研究所.藏药志.西宁:青海人民出版社,1991:145-146.)根据已有的研究表明，大果大戟中主要含有二萜类化学成分，包括对映-阿替生烷型、对映-贝壳杉烷型、对映-松香烷型、千金烷型、巴豆烷型和rhamnofolane型等。(Kuang Y,FuS Y,Wang F,Ren FC,Yang D F,Yang S X,Gao Y.Two new ent-atisane diterpenoidsfrom the whole plants of Euphorbia wallichii[J].Natural product research,2017,31(7):849-852.；Huan W,Xiaofeng Z,Xiaodong L.An ent-Kaurane Diterpenefrom Euphorbia wallichii[J].2006,18(1):53-54.；Wang H,Zhang X F,Cai X H,Ma YB,Luo X D.Three new diterpenoids from Euphorbia wallichii[J].Chinese Journalof Chemistry,2004,22(2):199-202.；Yuan F Y,Tang Z Y,Huang D,Li W,Wu S Q,HuangJ L,Yan XL,Fan R Z,Tang G H,Yin S.Tigliane and rhamnofolane glycosides fromEuphorbia wallichii prevent oxidative stress-induced neuronal death in PC-12cells[J].Bioorganic Chemistry,2022,128:106103.)现代药理学研究表明，大戟属植物具有抗炎，抗多药耐药，抗肿瘤，抗病毒等作用。(Vasas A,Hohmann J.Euphorbiaditerpenes:isolation,structure,biological activity,and synthesis(2008-2012)[J].Chemical reviews,2014,114(17):8579-8612)目前对大果大戟化学成分和药理活性的研究较少，为了将大果大戟的药用价值发挥到最大，对大果大戟进行了系统的成分研究，提取了新的二萜类化合物，利用核磁、质谱等手段对化合物的结构进行了确证，并检测提取到的化合物对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO产生的抑制作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种大果大戟中具有抗炎活性的二萜化合物及其提取方法和其在制备抗炎药物中的应用，所述二萜化合物具体包括对映-贝壳杉烷型及对映-阿替生烷型二萜类化合物或其在药学上可接受的盐。本发明是为了将大果大戟的药用价值发挥到最大，对大果大戟的全草进行了系统的成分研究，提取到了新的对映-贝壳杉烷型及对映-阿替生烷型二萜类化合物，并利用核磁、质谱等手段对化合物进行了结构确证，检测其对LPS诱导的RAW264.7细胞中NO产生的抑制作用。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
如结构通式(I)或结构通式(II)所示的二萜类化合物或该二萜类化合物在药学上可接受的盐；
所述的通式如下：
其中：A1环或存在Δ1,2双键；R1为H、羟基或羰基；R2为H、羟基或羰基；R3为H或羟基；R4为H、羟甲基或甲基；
其中：A2环或存在Δ1,2双键；R5、R6、R7、R8各自独立的为H或羟基。
进一步的，所述大果大戟中具有抗炎活性的二萜化合物，其为如下结构式1-8所示的化合物中的任一种或该二萜化合物在药学上可接受的盐；
本发明中所述的“在药学上可接受的盐”，是指所述大果大戟中具有抗炎活性的二萜化合物的有机盐或无机盐，包括：钠盐、钾盐、氨盐、盐酸盐及硫酸盐。
本发明中所述的“异构体”，包括：立体异构体、几何异构体和互变异构体。
本发明还提供所述的大果大戟中具有抗炎活性的二萜化合物1-8的提取方法，包括如下步骤：
(1)以大果大戟全草为原料，加入原料1-5质量倍的乙醇水溶液，浸泡3-5次，提取原料中含有的二萜类化合物；将浸泡液合并后过滤，减压回收溶剂；滤渣用乙醇水溶液，回流提取1-3次，每次1.5-3小时，获得提取液，合并后减压回收溶剂，浓缩后得到总浸膏；
(2)将总浸膏分散到1-5质量倍的水中形成混悬液，用乙酸乙酯萃取，回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取浓缩液，即乙酸乙酯层浸膏；
(3)乙酸乙酯层浸膏经硅胶柱色谱分离，以100:0-0:1的二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，分别收集洗脱剂比为30:1的流分，记为E5；洗脱剂比为10:1的流分，记为E6；洗脱剂比为5:1的流分，记为E7；
(4)将流分E5、E6和E7分别浓缩后进一步纯化，得到化合物1-8。
所述步骤(1)中，所述乙醇水中，乙醇的体积分数为70％～95％。乙醇水与原料的体积质量比以mL/g计为(1-5):1。所述步骤(4)中，浓缩纯化过程如下：
流分E5浓缩后，经过ODS柱色谱分离，以10:90-100:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱剂比为40:60的流分，记为E54，收集洗脱剂比为50:50的流分，记为E55；
流分E54浓缩后，经硅胶柱色谱分离，以8:1-0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱剂比为7:1的流分，记为E545；
流分E545浓缩后，经制备型HPLC色谱，以50:50-80:20的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物2；
流分E55浓缩后，经硅胶柱色谱分离，以8:1-0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱剂比为6:1的流分，记为E556；
流分E556浓缩后，溶于甲醇，收集析出产品，得到化合物3；
流分E6浓缩后，经过ODS柱色谱分离，以10:90-100:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱剂比为40:60的流分，记为E64；
流分E64浓缩后，经硅胶柱色谱分离，以8:1-1:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱剂比为6:1的流分，记为E643；
流分E643浓缩后，经制备型HPLC色谱，以40:60-70:30的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物1；
流分E7浓缩后，经过ODS柱色谱分离，以5:95-100:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱剂比为10:90的流分，记为E72；收集洗脱剂比为25:75的流分，记为E74；
流分E72浓缩后，经硅胶柱色谱分离，以8:1-1:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱剂比为6:1的流分，记为E722；
流分E722浓缩后，经制备型HPLC色谱，以30:70-60:40的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物4和6。
流分E74浓缩后，经硅胶柱色谱分离，以7:1-1:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱剂比为6:1的流分，得到化合物7，收集洗脱剂比为5:1的流分，记为E746；
流分E746浓缩后，经制备型HPLC色谱，以40:60-70:30的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物5和8。
一种药物组合物，其包含所述的大果大戟中具有抗炎活性的二萜类化合物或该化合物在药学上可接受的盐中的一种或多种；还包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂中的一种或它们的组合。所述的药物组合物，根据给药途径，分为口服药物组合物或注射给药药物组合物，所述的药物组合物的剂型选自：片剂、胶囊剂、粉剂、糖浆剂和针剂中的一种。
本发明还提供了所述的大果大戟中具有抗炎活性的二萜类化合物或该对化合物在药学上可接受的盐或所述的药物组合物在制备抗炎药物中的应用。
本发明的有益效果：
本发明的大果大戟中具有抗炎活性的二萜类化合物或其在药学上可接受的盐或包含所述二萜化合物的药物组合物对LPS诱导的RAW264.7细胞产生NO的抑制作用，能够应用于制备抗炎药物。
本发明方法进一步丰富大果大戟活性物质的结构多样性，在此基础上，为后续得到的单体化合物进行相关生物活性测试奠定基础，为新药开发提供活性先导化合物，同时也为大果大戟药材的深层次研究与开发提供理论依据。
附图说明
图1不同浓度化合物1对RAW264.7细胞的存活率的影响；
图2化合物1对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7分泌的细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的抑制作用；
图3化合物1对iNOS、COX-2、NF-κB、p-NF-κB、IKBKB、p-IKBKB、IκBα、p-IκBα、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3表达的情况；
图4化合物1对NF-κB及STAT3核转位的影响。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行进一步描述。
实施例1
大果大戟中具有抗炎活性的二萜化合物的提取方法，包括如下步骤：
(1)以总干重为10.8kg的大果大戟全草为原料，加入20L体积浓度95％乙醇水溶液，室温下浸泡3次，每次一周，合并得到提取液，减压回收溶剂；滤渣用95％乙醇水溶液(20L)回流提取1次，每次3小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，合并后得到总浸膏(1.5kg)；
(2)将总浸膏分散到3L水中，用乙酸乙酯萃取，回收溶剂，得到乙酸乙酯萃层浸膏(812.0g)；
(3)乙酸乙酯萃取层浸膏经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:0、100:1、90:1、80:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1和0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为30:1的流分，记为E5(48.0g)；体积比为10:1，记为E6(58.7g)；体积比为5:1，记为E7(65.1g)；
(4)E5、E6和E7浓缩后进一步纯化，得到化合物1-8。具体步骤：
流分E5浓缩后，经过ODS柱色谱分离，依次以体积比为10:90、30:70、40:60、50:50、70:30、90:10和100:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为40:60的流分，记为E54，收集体积比为50:50的流分，记为E55；
流分E54浓缩后，经硅胶柱色谱分离，依次以体积比为8:1、6:1、5:1、3:1、1:1和0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为7:1的流分，记为E545；
流分E545浓缩后，经制备型HPLC色谱，以体积比为75:25的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到13.1mg化合物2；
流分E55浓缩后，经硅胶柱色谱分离，依次以体积比为8:1、6:1、5:1、3:1、1:1和0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为6:1的流分，记为E556；
流分E556浓缩后，溶于甲醇，收集析出样品，得到3.2mg化合物3；
流分E6浓缩后，经过ODS柱色谱分离，依次以体积比为10:90、20:80、30:70、40:60、50:50、60:40、70:30、80:20、90:10和100:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为40:60的流分，记为E64；
流分E64浓缩后，经硅胶柱色谱分离，依次以体积比为8:1、6:1、5:1、3:1和1:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为6:1的流分，记为E643；
流分E643浓缩后，经制备型HPLC色谱，以体积比为60:40的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到7.9mg化合物1；
流分E7浓缩后，经过ODS柱色谱分离，依次以体积比为5:95、15:85、25:75、35:65、45:55、55:45、70:30、90:10和100:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为10:90的流分，记为E72；收集体积比为25:75的流分，记为E74；
流分E72浓缩后，经硅胶柱色谱分离，依次以体积比为8:1、6:1、5:1、3:1和1:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为6:1的流分，记为E722；
流分E722浓缩后，经制备型HPLC色谱，以体积比为50:50的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到3.2mg化合物4和10.9mg化合物6。
流分E74浓缩后，经硅胶柱色谱分离，依次以体积比为7:1、6:1、5:1、3:1和1:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为6:1的流分，处理析出，得到15.2mg化合物7，收集体积比为5:1的流分，记为E746；
流分E746浓缩后，经制备型HPLC色谱，以体积比为60:40的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到8.2mg化合物5和5.9mg化合物8。
化合物的物理化学和常数如下：
化合物1:白色无定型粉末，HRESIMS m/z:357.2046[M+Na]+(calcd forC20H30O4Na,357.2042)，确定化合物1的分子式为C20H30O4；(c 0.39,MeOH)；1H-NMR(600MHz,CDCl3)和13C-NMR(150MHz,CDCl3)，数据见表1。
化合物2:白色无定型粉末，HRESIMS m/z:335.2218[M+H]+(calcd for C20H31O4,335.2222),确定化合物2的分子式C20H30O4；(c 0.40,MeOH)；1H-NMR(600MHz,CDCl3)和13C-NMR(150MHz,CDCl3)，数据见表2。
化合物3:白色无定型粉末，HRESIMS m/z:335.2210[M+H]+(calcd for C20H31O4,335.2217),确定化合物3的分子式C20 H30O4；(c 0.22,MeOH)；1H-NMR(600MHz,DMSO-d6)和13C-NMR(150MHz,DMSO-d6)，数据见表3。
化合物4:白色无定型粉末，HRESIMS m/z:343.1875[M+Na]+(calcd forC19H28O4Na,343.1885),确定化合物4的分子式C19H28O4；(c 0.50,MeOH)；1H-NMR(600MHz,Methanol-d4)和13C-NMR(150MHz,Methanol-d4)，数据见表4。
化合物5:白色无定型粉末，HRESIMS m/z:335.2210[M+H]+(calcd for C20H31O4,335.2217),确定化合物5的分子式C20H30O4；(c 0.46,MeOH)；1H-NMR(600MHz,CDCl3)和13C-NMR(150MHz,CDCl3)，数据见表5。
化合物6:白色无定型粉末，HRESIMS m/z:375.2134[M+H]+(calcd for C20H33O5,375.2142),确定化合物6的分子式C20H32O5；(c 0.50,MeOH)；1H-NMR(600MHz,Methanol-d4)和13C-NMR(150MHz,Methanol-d4)，数据见表6。
化合物7:淡黄色固体，HRESIMS m/z:353.2323[M+H]+(calcd for C20H33O5,353.2328),确定化合物7的分子式C20H32O5；(c 0.50,MeOH)；1H-NMR(600MHz,Methanol-d4)和13C-NMR(150MHz,Methanol-d4)，数据见表7。
化合物8:无色油状，HRESIMS m/z:337.2365[M+H]+(calcd for C20H33O4,337.2373),确定化合物8的分子式C20H32O4；(c 0.31,MeOH)；1H-NMR(600MHz,Methanol-d4)和13C-NMR(150MHz,Methanol-d4)，数据见表8。
表1化合物1的碳谱和氢谱数据
注：1H-NMR，600MHz，CDCl3；13C-NMR，150MHz，CDCl3。
表2化合物2的碳谱和氢谱数据
注：1H-NMR，600MHz，CDCl3；13C-NMR，150MHz，CDCl3。
表3化合物3的碳谱和氢谱数据
注：1H-NMR，600MHz，DMSO-d6；13C-NMR，150MHz，DMSO-d6。
表4化合物4的碳谱和氢谱数据
注：1H-NMR，600MHz，Methanol-d4；13C-NMR，150MHz，Methanol-d4。
表5化合物5的碳谱和氢谱数据
注：1H-NMR，600MHz，CDCl3；13C-NMR，150MHz，CDCl3。
表6化合物6的碳谱和氢谱数据
注：1H-NMR，600MHz，Methanol-d4；13C-NMR，150MHz，Methanol-d4。
表7化合物7的碳谱和氢谱数据
注：1H-NMR，600MHz，Methanol-d4；13C-NMR，150MHz，Methanol-d4。
表8化合物8的碳谱和氢谱数据
注：1H-NMR，600MHz，Methanol-d4；13C-NMR，150MHz，Methanol-d4。
通过理化常数和现代波谱学手段(HRESIMS和NMR)，结合文献相关数据，鉴定化合物结构，化合物1-8均为未见文献报道的新化合物，结构如下：
实施例2
大果大戟中具有抗炎活性的二萜化合物的提取方法，包括如下步骤：
(1)以总干重为30kg的大果大戟全草为原料，加入60L体积浓度95％乙醇水溶液，室温下浸泡3次，每次一周，合并得到提取液，减压回收溶剂；滤渣用95％乙醇水溶液(60L)回流提取1次，每次2小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，合并后得到总浸膏(4.2kg)；
(2)将总浸膏分散到8L水中，用乙酸乙酯萃取，回收溶剂，得到乙酸乙酯萃层浸膏(2.2kg)；
(3)乙酸乙酯萃层浸膏经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:0、100:1、90:1、80:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1和0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为30:1的流分，记为E5(135.7g)；体积比为10:1的流分，记为E6(169.5g)；体积比为5:1的流分，记为E7(182.5g)；
(4)E5、E6和E7浓缩后进一步分离纯化，得到22.1mg化合物1、35.7mg化合物2、8.9mg化合物3、9.2mg化合物4、23.9mg化合物5、30.5mg化合物6、40.6mg化合物7、8.5mg化合物8。具体分离纯化过程同实施例1。
实施例3
大果大戟中具有抗炎活性的二萜化合物的提取方法，包括如下步骤：
(1)以总干重为5kg的大果大戟全草为原料，加入15L体积浓度95％乙醇水溶液，室温下浸泡5次，每次5天，合并得到提取液，减压回收溶剂；滤渣用95％乙醇水溶液(15L)回流提取2次，每次2小时，合并得到提取液，减压回收溶剂，合并后得到总浸膏(570g)；
(2)将总浸膏分散到1.2L水中，用乙酸乙酯萃取，回收溶剂，得到乙酸乙酯萃层浸膏(310.7g)；
(3)乙酸乙酯萃取萃层浸膏经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:0、100:1、90:1、80:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1和0:1的二氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，收集体积比为30:1的流分，记为E5(18.7g)；体积比为10:1萃层浸膏，记为E6(22.5g)；体积比为5:1萃层浸膏，记为E7(24.5g)；
(4)E5、E6和E7浓缩后进一步分离纯化，得到3.1mg化合物1、5.7mg化合物2、1.0mg化合物3、1.2mg化合物4、3.2mg化合物5、4.2mg化合物6、5.6mg化合物7、2.2mg化合物8。具体分离纯化过程同实施例1。
实施例4
本发明产物对RAW264.7细胞生成NO的影响研究
将RAW264.7细胞接种在96孔板中，并用20μM的化合物处理3小时，然后与LPS(0.5μg/mL)一起温育24小时。将具有或不具有LPS的DMSO作为媒介物对照或模型对照处理。使用Griess试剂在540nm下用酶标仪测量培养基中的亚硝酸盐积累。计算化合物处理组的抑制率(％)以评价NO抑制活性。
表9化合物抑制RAW264.7细胞NO生成抑制率(％)值表
| 化合物 | 抑制率(％) | 化合物 | 抑制率(％) |
| 化合物1 | 90.1 | 化合物5 | 32.7 |
| 化合物2 | 14.4 | 化合物6 | -48.3 |
| 化合物3 | 43.2 | 化合物7 | 36.6 |
| 化合物4 | 17.7 | 化合物8 | 6.7 |
从表9中可以发现，化合物1有较强的抑制活性。
本发明产物化合物1在RAW264.7细胞中抗炎作用与机制研究
(1)CCK8法检测化合物1对细胞存活率的影响
对数生长期的RAW264.7细胞以25000个/孔接种于96孔板中培养12小时。换不同浓度的化合物1(100、50、25、12.5、6.25、3.125和1.5625μmol/L)处理细胞。以加入相应体积的DMSO的细胞孔作为空白对照。24小时后弃掉培养基，每孔均加入100μL的含10％CCK8的培养基，培养20分钟后，酶标仪检测450nm处各孔的OD值计算实验组细胞存活率(以空白对照组细胞存活率为100％)。结果图1所示，化合物1对RAW264.7细胞的存活率没有显著影响。
(2)荧光定量PCR法检测化合物1对白介素1β(IL-1β)、白介素6(IL-6)和TNF-α的生成的抑制作用
根据制造商的说明，用TRIzol收集细胞并提取总mRNA。用PrimeScriptTM RT试剂试剂盒从1μg mRNA合成cDNA。然后使用TB Green Premix Ex TaqTM II进行实时定量PCR(qRT-PCR)。β-Actin基因(ACTB)用于规范化相对mRNA水平。引物序列如下:
Mouse-IL-6-Forward:5’-GCTACCAAACTGGATATAATCAGGA-3’
Mouse-IL-6-Reverse:5’-CCAGGTAGCTATGGTACTCCAGAA-3’
Mouse-IL-1β-Forward:5’-AGCTTCAGGCAGGCAGTATC-3’
Mouse-IL-1β-Reverse:5’-GTCACAGAGGATGGGCTCTT-3’
Mouse-TNF-α-Forward:5’-TCTTCTCATTCCTGCTTGTGG-3’
Mouse-TNF-α-Reverse:5’-GGTCTGGGCCATAGAACTGA-3’
Mouse-ACTB-Forward:5’-AAGGCCAACCGTGAAAAGAT-3’
Mouse-ACTB-Reverse:5’-GTGGTACGACCAGAGGCATAC-3’
结果如图2所示，化合物1对LPS诱导的巨噬细胞RAW264.7分泌的细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α有显著的抑制作用。
由图2可知，化合物1可以抑制LPS引起的巨噬细胞RAW264.7分泌的细胞因子含量，并且其抑制作用呈现剂量依赖性。
(3)Western Blot检测化合物1对炎症相关蛋白的表达的抑制作用
RAW264.7细胞接种于96孔板培养12小时。实验组用不同浓度化合物1(5、10和20μmol·L-1)处理。3小时后，模型对照组和实验组加入LPS，使其终浓度为1μg/mL，而空白对照组加入等体积的DMEM培养基，继续培养24小时。弃掉培养基，清洗并收集细胞进行WesternBlot实验，测定蛋白iNOS、COX-2、NF-κB、p-NF-κB、IKBKB、p-IKBKB、IκBα、p-IκBα、JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的表达情况，曝光条带用Gel-Pro analyzer进行灰度分析。结果图3。
由图3可知，化合物1可以抑制iNOS和COX-2的表达，也降低了NF-κB、IKBKB、IκBα的表达，以及它们的磷酸化水平，同时也抑制了JAK2和STAT3的表达。
(4)化合物1对NF-κB及STAT3核转位的影响
将RAW264.7细胞接种到每孔8×104细胞的24孔板中，培养12小时，然后用DMSO或1(40μM)预处理2小时，并用0.5μg/mL LPS激活12小时。用新鲜制备的4％多聚甲醛固定细胞10分钟，用PBS洗涤3次，接着用0.2％Triton X-100通透10分钟。在室温下用5％牛血清白蛋白(BSA)封闭1小时后，加入1：500稀释的NF-κB(Proteintech，#10745-1-AP)抗体或1：400稀释的STAT3(Abmart,#T55292)抗体，并在4℃下孵育过夜。通过PBS洗涤后，在室温下和暗处以1：400的稀释度添加二抗孵育1小时。最后，在室温和暗处下用DAPI染色5分钟。然后PBS清洗并加入抗荧光淬灭封片液，在免疫荧光显微镜下观察并拍照，并获取图像。结果如图4。
从图4可知，化合物1可以显着防止LP-激活的RAW264.7细胞中NF-κB的p65亚基和STAT3从胞浆转移到细胞核。
Claims (7)
1.大果大戟中具有抗炎活性的二萜化合物或其在药学上可接受的盐，其特征在于，其为如下结构式所示的化合物中的任一种或该二萜化合物在药学上可接受的盐；
2.根据权利要求1所述的大果大戟中具有抗炎活性的二萜化合物或其在药学上可接受的盐，其特征在于，所述的在药学上可接受的盐，是指所述大果大戟中具有抗炎活性的二萜化合物的有机盐或无机盐，选自钠盐、钾盐、氨盐、盐酸盐及硫酸盐。
3.一种权利要求1所述的大果大戟中具有抗炎活性的二萜化合物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以大果大戟全草为原料，加入原料1-5质量倍的乙醇水溶液，浸泡3-5次，提取原料中含有的二萜类化合物；将浸泡液合并后过滤，减压回收溶剂；滤渣用乙醇水溶液，回流提取1-3次，获得提取液，合并后减压回收溶剂，浓缩后得到总浸膏；所述乙醇水中乙醇的体积分数为70％～95％；乙醇水与原料的体积质量比以mL/g计为(1-5):1；
(2)将总浸膏分散到1-5质量倍的水中形成混悬液，用乙酸乙酯萃取，回收溶剂，得到乙酸乙酯层浸膏；
(3)乙酸乙酯层浸膏经硅胶柱色谱分离，以100:0-0:1的二氯甲烷-甲醇或三氯甲烷-甲醇为洗脱剂梯度洗脱，分别收集洗脱剂比为30:1的流分，记为E5；洗脱剂比为10:1的流分，记为E6；洗脱剂比为5:1的流分，记为E7；
(4)将流分E5、E6和E7分别浓缩后进一步纯化，得到化合物1-8；
浓缩纯化过程如下：
流分E5浓缩后，经过ODS柱色谱分离，以10:90-100:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱剂比为40:60的流分，记为E54，收集洗脱剂比为50:50的流分，记为E55；
流分E54浓缩后，经硅胶柱色谱分离，以8:1-0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱剂比为7:1的流分，记为E545；
流分E545浓缩后，经制备型HPLC色谱，以50:50-80:20的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物2；
流分E55浓缩后，经硅胶柱色谱分离，以8:1-0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱剂比为6:1的流分，记为E556；
流分E556浓缩后，溶于甲醇，收集析出产品，得到化合物3；
流分E6浓缩后，经过ODS柱色谱分离，以10:90-100:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱剂比为40:60的流分，记为E64；
流分E64浓缩后，经硅胶柱色谱分离，以8:1-1:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱剂比为6:1的流分，记为E643；
流分E643浓缩后，经制备型HPLC色谱，以40:60-70:30的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物1；
流分E7浓缩后，经过ODS柱色谱分离，以5:95-100:0的甲醇-水为洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱剂比为10:90的流分，记为E72；收集洗脱剂比为25:75的流分，记为E74；
流分E72浓缩后，经硅胶柱色谱分离，以8:1-1:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱剂比为6:1的流分，记为E722；
流分E722浓缩后，经制备型HPLC色谱，以30:70-60:40的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物4和6；
流分E74浓缩后，经硅胶柱色谱分离，以7:1-1:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，收集洗脱剂比为6:1的流分，得到化合物7，收集洗脱剂比为5:1的流分，记为E746；
流分E746浓缩后，经制备型HPLC色谱，以40:60-70:30的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物5和8。
4.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1所述的大果大戟中具有抗炎活性的二萜类化合物或该化合物在药学上可接受的盐中的一种或多种；还包括药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂中的一种或它们的组合。
5.根据权利要求4所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物，分为口服药物组合物或注射给药药物组合物，所述的药物组合物的剂型选自：片剂、胶囊剂、粉剂、糖浆剂和针剂中的一种。
6.权利要求1所述的大果大戟中具有抗炎活性的二萜类化合物或该化合物在药学上可接受的盐在制备抗炎药物中的应用。
7.权利要求4或5所述的药物组合物在制备抗炎药物中的应用。
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