CN111454154A - 一种千金二萜烷型化合物及其提取方法和用途 - Google Patents

一种千金二萜烷型化合物及其提取方法和用途 Download PDF

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Abstract

本发明属于中药提取技术领域，公开了一种千金二萜烷型化合物及其提取方法和用途，所述的化合物具有(I)的结构；R1、R2如权利要求书和说明书所述。本发明所述化合物及其组合物对LPS诱导的人巨噬细胞(RAW264.7)产生一氧化氮的抑制作用，表明本发明化合物具有抗炎作用，可以用于制备抗炎、治疗自身免疫性疾病或免疫损伤药物。

Description

一种千金二萜烷型化合物及其提取方法和用途
技术领域
本发明涉及中药提取领域，涉及一种千金二萜烷型化合物及其提取方法和用途。
背景技术
千金子为大戟科植物续随子Euphorbia lathyris的干燥成熟种子，其地域分布广泛，主产地为河南、河北、浙江、四川、吉林等省。夏、秋二季果实成熟时采收，除去杂质，干燥。千金子是一种民间的传统中药。性温味辛(有毒)，归肝、肾、大肠经。其具有泻下逐水，破血消癥；外用疗癣蚀疣的功能。可用于二便不通，水肿，痰饮，积滞胀满，血瘀经闭等症的治疗；外治顽癣，赘疣。国内外学者通过体内、体外实验证实了千金子的抗癌、多药耐药逆转、抗病毒和抗炎等作用。千金二萜烷型化合物是其中含有的主要成分，目前对其抗肿瘤及抗肿瘤多药耐药的研究较多，而对于千金子中提取物及千金二萜烷型化合物的抗炎用途及治疗自身免疫性疾病和免疫损伤作用未见报道。
发明内容
本发明的目的是提供千金二萜烷型化合物。
本发明的第二个目的是提供千金二萜烷型化合物的提取方法。
本发明的第三个目的是提供千金二萜烷型化合物的用途。
本发明的第四个目的是提供包含所述的千金二萜烷型化合物的千金子提取物。
本发明的第五个目的是提供千金子提取物的用途。
本发明的第六个目的是提供含千金二萜烷型化合物的药物组合物。
本发明的第七个目的是提供上述药物组合物的用途。
本发明的技术方案概述如下：
千金二萜烷型化合物，具有式(I)的结构：
Figure BDA0001949361910000011
其中：
R1，R2为H，C2-C6酰基，苯环羟基、甲氧基取代的2′-羟基-苯乙酰基，苯环羟基、甲氧基取代的苯乙酰基，苯环羟基、甲氧基取代的肉桂酰基或C2-C10烷基。
本发明优选如下化合物：
Figure BDA0001949361910000021
本发明提供了所述千金二萜烷型化合物的提取方法，包括如下步骤：
(1)以大戟科大戟属植物续随子的干燥种子为原料，加入原料1-5质量倍的石油醚试剂，室温下浸泡过夜，脱脂，石油醚液体用体积分数为70％-85％的乙醇水溶液进行萃取，萃取液减压回收溶剂，得到70％-85％乙醇层浸膏。脱脂后的药渣则加入3-8质量倍的体积分数为90％-95％乙醇水溶液，回流提取2-4次，每次提取2-4小时，合并所得提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到90％-95％乙醇层浸膏；
(2)将90％-95％乙醇层浸膏分散到2-6质量倍的水中，用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到乙酸乙酯层浸膏，经薄层层析色谱分析，前述(1)中的70％-85％乙醇层浸膏与乙酸乙酯层浸膏的薄层色谱行为一致，故合并为总浸膏；
(3)总浸膏经硅胶柱色谱分离，以体积比分别为100:1-1:1的石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分Fr.E1、Fr.E2、Fr.E3、Fr.E4、Fr.E5、Fr.E6、Fr.E7和Fr.E8；
(4)馏分Fr.E6用石油醚-甲醇混合试剂进行重结晶依次得到部分晶体及Fr.E6母液；
(5)馏分Fr.E6母液经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1-0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分Fr.E6-6和Fr.E6-7；
(6)馏分Fr.E6-6和Fr.E6-7分别经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1-0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分Fr.E6-6-2及Fr.E6-7-4；
(7)Fr.E6-6-2和Fr.E6-7-4分别经制备HPLC色谱，以体积比为75％-85％的甲醇-水为流动相，进行分离，依次得到馏分Fr.E6-6-2-1、Fr.E6-6-2-7；Fr.E6-7-4-2、Fr.E6-7-4-4和化合物4；
(8)馏分Fr.E6-6-2-1经制备HPLC色谱，以体积比为70％-80％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物1；
(9)馏分Fr.E6-6-2-7经制备HPLC色谱，以体积比为70％-80％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物5；
(10)馏分Fr.E6-7-4-2经制备HPLC色谱，以体积比为70％-80％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物2；
(11)Fr.E6-7-4-4经制备HPLC色谱，以体积比为70％-80％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物3。
本发明提供了千金二萜烷型化合物在制备抗炎、治疗自身免疫性疾病和免疫损伤药物中的应用。
本发明提供了千金子提取物，所述的提取物包含所述的千金二萜烷型化合物中的一种或几种。
本发明提供了所述的千金子提取物在制备抗炎、治疗自身免疫性疾病或免疫损伤药物中的应用。
本发明提供了一种药物组合物，包含千金二萜烷型化合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体和/或赋形剂。并提供了所述药物组合物在制备抗炎、治疗自身免疫性疾病或免疫损伤药物中的应用。
所述的炎症、自身免疫疾病或免疫性损伤包括但不限于系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性血管炎、硬皮病、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎、感染所致的内毒素血症、败血症等。
本发明的优点：
本发明提供了千金二萜烷型化合物及其提取方法，还提供了千金二萜烷型化合物对LPS诱导的人巨噬细胞(RAW264.7)产生一氧化氮具有抑制作用，结果表明本发明化合物可作为潜在的抗炎、治疗自身免疫性疾病和免疫损伤药物，具有良好的研究开发前景。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行描述，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
千金二萜烷型化合物的提取方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)以大戟科大戟属植物续随子的干燥种子(10.0kg)为原料，粉碎后加入原料1质量倍的石油醚试剂，室温下浸泡过夜，脱脂，过滤石油醚液体并用体积分数为85％的乙醇水溶液进行萃取，萃取液减压回收溶剂，得到85％乙醇层浸膏(289g)。而药粉则加入6质量倍的体积分数为95％乙醇水溶液，回流提取3次，每次提取2小时，合并所得提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到95％乙醇层浸膏(718g)；
(2)将95％乙醇层浸膏分散到4质量倍的水中，用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到乙酸乙酯层浸膏(489g)，经薄层层析色谱分析，前述(1)中的85％乙醇层浸膏与乙酸乙酯层浸膏的薄层色谱行为一致，故合并为总浸膏(778g)；
(3)总浸膏经硅胶柱色谱分离，以体积比分别为100:1、50:1、30：1、10；1、5:1、2:1、0:1的石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分Fr.E1、Fr.E2、Fr.E3、Fr.E4、Fr.E5、Fr.E6(16.7g)、Fr.E7和Fr.E8；
(4)馏分Fr.E6用石油醚-甲醇混合试剂进行重结晶依次得到部分晶体及Fr.E6母液(9.49g)；
(5)Fr.E6母液经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:0、100:1、20:1、15:1、13:1、10:1、8:1、5:1、3:1、1:1、0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分Fr.E6-1、Fr.E6-2、Fr.E6-3、Fr.E6-4、Fr.E6-5、Fr.E6-6(1.4g)和Fr.E6-7(2.7g)；
(6)Fr.E6-6经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1、60:1、50:1、30:1、20:1、15:1、10:1、8:1、5:1、5:2、0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分Fr.E6-6-1、Fr.E6-6-2(362.4mg)、Fr.E6-6-3、Fr.E6-6-4、Fr.E6-6-5、Fr.E6-6-6和Fr.E6-6-7。
(7)Fr.E6-6-2经制备HPLC色谱，以体积比为80％的甲醇-水为流动相，进行分离，得到馏分Fr.E6-6-2-1(6.1mg)、Fr.E6-6-2-2、Fr.E6-6-2-3、Fr.E6-6-2-4、Fr.E6-6-2-5、Fr.E6-6-2-6、Fr.E6-6-2-7(24.8mg)、Fr.E6-6-2-8、Fr.E6-6-2-9、Fr.E6-6-2-10、Fr.E6-6-2-11；
(8)Fr.E6-6-2-1经制备HPLC色谱，以体积比为70％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物1(1.9mg)；
(9)Fr.E6-6-2-7经制备HPLC色谱，以体积比为80％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物5(12.7mg)；
(10)馏分Fr.E6-7经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1、60:1、50:1、30:1、20:1、15:1、10:1、8:1、5:1、5:2、0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分Fr.E6-7-1、Fr.E6-7-2、Fr.E6-7-3、Fr.E6-7-4(1.38g)、Fr.E6-7-5、Fr.E6-7-6和Fr.E6-7-7。
(11)Fr.E6-7-4经制备HPLC色谱，以体积比为80％的甲醇-水为流动相，进行分离，得到馏分Fr.E6-7-4-1、Fr.E6-7-4-2(17.0mg)、Fr.E6-7-4-3、Fr.E6-7-4-4(23.1mg)、Fr.E6-7-4-5、Fr.E6-7-4-6、Fr.E6-7-4-7、Fr.E6-7-4-8(67.4mg)、Fr.E6-7-4-9及Fr.E6-7-4-10；
(12)Fr.E6-7-4-2经制备HPLC色谱，以体积比为70％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物2(2.6mg)；
(13)Fr.E6-7-4-4经制备HPLC色谱，以体积比为70％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物3(4.3mg)；
(14)Fr.E6-7-4-8经制备HPLC色谱，以体积比为70％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物4(26.4mg)；
化合物的物理化学和常数如下：
化合物1：白色无定型粉末(MeOH)；IR(KBr)vmax：3396，2924，2851，1740，1647，1380，1231，802cm-1；HRESIMS(positive)(m/z 441.2270[M+Na]+，calcd for 441.2253)，确定化合物1的分子式为C24H34O6；1H-NMR(600MHz，CDCl3)，13C-NMR(150MHz，CDCl3)，数据见表1。
化合物2：白色无定型粉末(MeOH)；IR(KBr)vmax：3450，2957，2931，1743，1631，1452，1276，1116，1011，908，712cm-1；HRESIMS(positive)(m/z:561.2465[M+Na]+，calcdfor 561.2464)，确定化合物2的分子式为C31H38O8；1H-NMR(600MHz，CDCl3)和13C-NMR(150MHz，CDCl3)，数据见表2。
表1化合物1的碳谱和氢谱数据
Figure BDA0001949361910000051
Figure BDA0001949361910000061
注：1H-NMR，600MHz，CDCl3；13C-NMR，150MHz，CDCl3。
表2化合物2的碳谱和氢谱数据
Figure BDA0001949361910000062
注：1H-NMR，600MHz，CDCl3；13C-NMR，150MHz，CDCl3。
通过理化常数和现代波谱学手段(HRESIMS和NMR)，结合文献相关数据，鉴定它们的结构，化合物1和2均为未见文献报道的新化合物，如下所示：
Figure BDA0001949361910000063
实施例2
千金二萜烷型化合物的提取方法，包括如下步骤：
(1)以大戟科大戟属植物续随子的干燥种子为原料，加入原料1质量倍的石油醚试剂，室温下浸泡过夜，脱脂，过滤石油醚液体并用体积分数为70％的乙醇水溶液进行萃取，萃取液减压回收溶剂，得到70％乙醇层浸膏。而药粉则加入3质量倍的体积分数为95％乙醇水溶液，回流提取2次，每次提取2小时，合并所得提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到95％乙醇层浸膏；
(2)将95％乙醇层浸膏分散到2质量倍的水中，用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到乙酸乙酯层浸膏，经薄层层析色谱分析，前述(1)中的85％乙醇层浸膏与乙酸乙酯层浸膏的薄层色谱行为一致，故合并为总浸膏；
(3)-(14)同实施例1(3)-(14)。
实施例3
千金二萜烷型化合物的提取方法，包括如下步骤：
(1)以大戟科大戟属植物续随子的干燥种子为原料，加入原料5质量倍的石油醚试剂，室温下浸泡过夜，脱脂，过滤石油醚液体并用体积分数为85％的乙醇水溶液进行萃取，萃取液减压回收溶剂，得到85％乙醇层浸膏。而药粉则加入8质量倍的体积分数为95％乙醇水溶液，回流提取4次，每次提取2小时，合并所得提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到95％乙醇层浸膏；
(2)将95％乙醇层浸膏分散到6质量倍的水中，用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到乙酸乙酯层浸膏，经薄层层析色谱分析，前述(1)中的85％乙醇层浸膏与乙酸乙酯层浸膏的薄层色谱行为一致，故合并为总浸膏；
(3)-(14)同实施例1(3)-(14)。
实施例4
本发明产物对RAW264.7细胞生成NO的影响研究
将RAW264.7细胞接种在96孔板中，并用不同浓度(0-100μM)的化合物处理3小时，然后与LPS(1μg/mL)一起温育24小时。将具有或不具有LPS的DMSO作为媒介物对照或模型对照处理。使用Griess试剂在540nm下用酶标仪测量培养基中的亚硝酸盐积累。计算化合物处理组的抑制率(％)并测定IC50值以评价NO抑制活性。以地塞米松为阳性对照药。
表1.化合物抑制RAW264.7细胞NO生成IC50值表
Figure BDA0001949361910000071
Figure BDA0001949361910000081
从表中可以发现，化合物4和5抑制NO生成的活性接近地塞米松。
含有本发明所述化合物或组合物的抗炎、治疗自身免疫性疾病和免疫损伤药物，可以为适用于口服或注射等应用形式，例如，可为片剂、胶囊剂、粉剂、糖浆剂、针剂等。
以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其中心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护。

Claims (10)

1.千金二萜烷型化合物，其特征是，具有式(I)的结构：
Figure FDA0001949361900000011
其中：
R1，R2为H，C2-C6酰基，苯环羟基、甲氧基取代的2′-羟基-苯乙酰基，苯环羟基、甲氧基取代的苯乙酰基，苯环羟基、甲氧基取代的肉桂酰基或C2-C10烷基。
2.权利要求1所述的化合物，其特征在于所述化合物结构式为：
Figure FDA0001949361900000012
3.权利要求1或2所述千金二萜烷型化合物的提取方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)以大戟科大戟属植物续随子的干燥种子为原料，石油醚脱脂，石油醚液体用体积分数为70％-85％的乙醇水溶液进行萃取，乙醇层萃取液减压回收溶剂，得到70％-85％乙醇层浸膏，脱脂后的药渣用90％-95％乙醇水溶液提取，提取液减压回收溶剂，浓缩后得到90％-95％乙醇层浸膏；
(2)将90％-95％乙醇层浸膏分散到水中，用乙酸乙酯进行萃取，乙酸乙酯萃取液减压回收溶剂，得到乙酸乙酯层浸膏，合并70％-85％乙醇层浸膏与乙酸乙酯层浸膏为总浸膏；
(3)总浸膏经硅胶柱色谱分离，以体积比分别为100:1-1:1的石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分Fr.E1、Fr.E2、Fr.E3、Fr.E4、Fr.E5、Fr.E6、Fr.E7和Fr.E8；
(4)馏分Fr.E6用石油醚-甲醇混合试剂进行重结晶依次得到部分晶体及Fr.E6母液；
(5)馏分Fr.E6母液经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1-0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分Fr.E6-6和Fr.E6-7；
(6)馏分Fr.E6-6和Fr.E6-7分别经硅胶柱色谱分离，以体积比为100:1-0:1的石油醚-丙酮为洗脱剂梯度洗脱，得到馏分Fr.E6-6-2及Fr.E6-7-4；
(7)Fr.E6-6-2和Fr.E6-7-4分别经制备HPLC色谱，以体积比为75％-85％的甲醇-水为流动相，进行分离，依次得到馏分Fr.E6-6-2-1、Fr.E6-6-2-7；Fr.E6-7-4-2、Fr.E6-7-4-4和化合物4；
(8)馏分Fr.E6-6-2-1经制备HPLC色谱，以体积比为70％-80％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物1；
(9)馏分Fr.E6-6-2-7经制备HPLC色谱，以体积比为70％-80％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物5；
(10)馏分Fr.E6-7-4-2经制备HPLC色谱，以体积比为70％-80％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物2；
(11)Fr.E6-7-4-4经制备HPLC色谱，以体积比为70％-80％的甲醇-水为流动相，进行纯化，得到化合物3。
4.权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中续随子的干燥种子加入1-5质量倍的石油醚试剂，室温下浸泡过夜，脱脂，石油醚液体用体积分数为70％-85％的乙醇水溶液进行萃取，萃取液减压回收溶剂，得到70％-85％乙醇层浸膏。
5.权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中脱脂后的药渣加入3-8质量倍的体积分数为90％-95％乙醇水溶液，回流提取2-4次，每次提取2-4小时，合并所得提取液，减压回收溶剂，浓缩后得到90％-95％乙醇层浸膏。
6.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1或2所述的千金二萜烷型化合物或其药学上可接受的盐，和药学上可接受的载体和/或赋形剂。
7.千金子提取物，其特征在于，包含权利要求1或2所述的千金二萜烷型化合物中的一种或几种。
8.权利要求1或2所述的千金二萜烷型化合物或权利要求6所述的组合物在制备抗炎、治疗自身免疫性疾病或免疫损伤药物中的应用。
9.权利要求7所述的千金子提取物在制备抗炎、治疗自身免疫性疾病或免疫损伤药物中的应用。
10.如权利要求8或9所述的应用，其特征在于，所述的炎症、自身免疫疾病或免疫性损伤包括系统性红斑狼疮、类风湿关节炎、系统性血管炎、硬皮病、皮肌炎、自身免疫性溶血性贫血、溃疡性结肠炎、慢性淋巴细胞性甲状腺炎、甲状腺功能亢进、胰岛素依赖型糖尿病、重症肌无力、溃疡性结肠炎、恶性贫血伴慢性萎缩性胃炎、肺出血肾炎综合征、寻常天疱疮、类天疱疮、原发性胆汁性肝硬化、多发性脑脊髓硬化症、急性特发性多神经炎、感染所致的内毒素血症、败血症。
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