CN115710300B - 一种从中华雪胆中提取的葫芦烷型五环三萜类化合物的制备方法及其应用 - Google Patents
一种从中华雪胆中提取的葫芦烷型五环三萜类化合物的制备方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及从中华雪胆中提取的葫芦烷型五环三萜类化合物的制备方法及其应用，可有效解决从中华雪胆中制备新的葫芦烷型五环三萜类化合物，并实现在制备治疗胃溃疡药物中的应用问题，本发明解决的技术方案是，中华雪胆加乙醇回流提取，提取液减压浓缩成稠浸膏，稠浸膏加水分散，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩萃取溶液，经硅胶柱色谱，用二氯甲烷‑甲醇梯度洗脱，收集洗脱液，减压浓缩，经中压Flash ODS柱色谱，用甲醇‑水洗脱，分别收集洗脱液，减压回收溶剂，得到组分Fr.EtOAc‑3‑D和Fr.EtOAc‑3‑H；分别用C18柱在半制备HPLC上分离，得化合物1、化合物2，本发明易操作，导向性强，产品纯度高，可有效用于制备治疗胃溃疡的药物，开拓了中华雪胆的药用价值。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是一种从中华雪胆中提取的葫芦烷型五环三萜类化合物的制备方法及其应用。
背景技术
中华雪胆为葫芦科雪胆属植物雪胆(Hemsleya chinensis)的块根，现收载于《贵州中药材民族药材质量标准》和《湖北中药材质量标准》。味苦，性寒，具有清热解毒、消肿散结、止泻止痢的功效，主治菌痢、肠炎、胃痛等症。广泛分布于我国西南部山区，如云南、四川、贵州等省，资源丰富且价格低廉。长期以来，中华雪胆被作为西南地区的常用民间药物，治疗胃肠道疾病、牛羊等家畜腹泻等疾病。葫芦烷型四环三萜类成分为其主要活性成分，代表性成分有雪胆甲素、雪胆乙素。现已有雪胆片(由雪胆粉加辅料制成的片剂)用于菌痢、肠炎、气管炎等；复方雪胆胶丸(由雪胆和雪胆皂苷制成)同于治疗子宫颈炎；雪胆苦味素(雪胆素)胶丸，治疗急性泌尿道感染；雪胆苷糖浆(雪胆皂苷)用于肺炎合并感染、上呼吸道感染等；雪胆苷注射液用于治疗慢性化脓性上颌窦炎。但至今未见有从中华雪胆制备具有抗胃溃疡活性的化合物1(hemchininA)和化合物2(hemchininB)，也未有如何从中华雪胆中提取抗胃溃疡活性的葫芦烷型五环三萜类成分的公开报导。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种从中华雪胆中提取的葫芦烷型五环三萜类化合物的制备方法及其应用，可有效解决从中华雪胆中提取制备葫芦烷型五环三萜类化合物，实现在制备治疗胃溃疡药物中的应用问题。
本发明解决的技术方案是，一种从中华雪胆中提取的葫芦烷型五环三萜类化合物，包括化合物1和化合物2，其分子式分别是C30H46O5和C30H46O6，不饱和度均为8，结构式分别为：
其制备方法，包括以下步骤：
(1)取干燥的中华雪胆块根20.0kg，每次加95％乙醇溶液100～300L，回流提取1～4次，每次提取1～4h，合并提取液，减压浓缩，得50℃相对密度为1.2～1.4的稠浸膏；
(2)在步骤(1)的稠浸膏中加10～20L分散成悬浮液，用乙酸乙酯重复萃取3～10次，每次用量15～25L，充分振摇，静置分层，收集乙酸乙酯层，减压回收溶剂，得到干燥固体组分Fr.EtOAc(150.8～230.7g)；
(3)组分Fr.EtOAc经80～300目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝6～12cm、H＝30～60cm，用体积比1:0、50:1、25:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱4～10个柱体积，收集25:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-3(4.5～7.2g)；
(4)组分Fr.EtOAc-3经中压FlashODS柱色谱(120g～250g)，用体积比40:60、50:50、60:40、70:30的甲醇-水进行梯度洗脱，每个比例洗脱5～10个柱体积，流速15～20mL/min，分别收集50:50、70:30的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-3-D(0.6～2.0g)和Fr.EtOAc-3-H(0.9～2.6g)；
(5)组分Fr.EtOAc-3-D用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，用C18色谱柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比43:57的乙腈-水，流速3mL/min，收集100.50min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物2(29.5～55.5mg)；
(6)组分Fr.EtOAc-3-H用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，用C18色谱柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比70:30的甲醇-水，流速3mL/min，收集43.13min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物1(24.7～48.6mg)。
本发明所述的从中华雪胆中提取的葫芦烷型五环三萜类化合物在制备治疗胃溃疡药物中的应用。
本发明经鉴定，是两个中华雪胆中提取的新的葫芦烷型五环三萜类化合物，其制备方法易操作，导向性强，产品纯度高，该化合物可有效用于制备胃溃疡的药物，开拓了中华雪胆的药用价值，经济和社会效益巨大。
附图说明
图1为本发明化合物1、2的实验和计算ECD光谱图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
本发明在具体实施时，其制备方法包括以下步骤：
(1)取干燥的中华雪胆块根20.0kg，每次加95％乙醇溶液250L，回流提取2次，每次提取2h，合并提取液，减压浓缩，得50℃相对密度为1.3的稠浸膏；
(2)在步骤(1)的稠浸膏中加10L水分散成悬浮液，用乙酸乙酯重复萃取10次，每次用量15L，充分振摇，静置分层，收集乙酸乙酯层，减压回收溶剂，得到干燥固体组分Fr.EtOAc(223.7g)；
(3)组分Fr.EtOAc经200目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝10cm、H＝50cm，用体积比1:0、50:1、25:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱8个柱体积，收集25:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-3(6.3g)；
(4)组分Fr.EtOAc-3经中压FlashODS柱色谱(220g)，用体积比40:60、50:50、60:40、70:30的甲醇-水进行梯度洗脱，每个比例洗脱10个柱体积，流速20mL/min，分别收集50:50、70:30的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-3-D(1.5g)和Fr.ETOAC-3-H(2.0g)；
(5)组分Fr.EtOAc-3-D用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，用C18色谱柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比43:57的乙腈-水，流速3mL/min，收集100.50min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物2(48.0mg)；
(6)组分Fr.EtOAc-3-H用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，用C18色谱柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比70:30的甲醇-水，流速3mL/min，收集43.13min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物1(40.6mg)。
实施例2
本发明在具体实施时，制备方法包括以下步骤：
(1)取干燥的中华雪胆块根20.0kg，每次加95％乙醇溶液300L，回流提取1次，每次提取4h，合并提取液，减压浓缩，得50℃相对密度为1.2的稠浸膏；
(2)在步骤(1)的稠浸膏中加15L水分散成悬浮液，用乙酸乙酯重复萃取6次，每次用量20L，充分振摇，静置分层，收集乙酸乙酯层，减压回收溶剂，得到干燥固体组分Fr.EtOAc(150.8g)；
(3)组分Fr.EtOAc经80目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝6cm、H＝30cm，用体积比1:0、50:1、25:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱4个柱体积，收集25:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-3(4.5g)；
(4)组分Fr.EtOAc-3经中压FlashODS柱色谱(120g)，用体积比40:60、50:50、60:40、70:30的甲醇-水进行梯度洗脱，每个比例洗脱10个柱体积，流速15mL/min，分别收集50:50、70:30的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-3-D(0.6g)和Fr.EtOAc-3-H(0.9g)；
(5)组分Fr.EtOAc-3-D用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，用C18色谱柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比43:57的乙腈-水，流速3mL/min，收集100.50min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物2(29.5mg)；
(6)组分Fr.EtOAc-3-H用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，用C18色谱柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比70:30的甲醇-水，流速3mL/min，收集43.13min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物1(24.7mg)。
实施例3
本发明在具体实施时，制备方法包括以下步骤：
(1)取干燥的中华雪胆块根20.0kg，每次加95％乙醇溶液100L，回流提取4次，每次提取1h，合并提取液，减压浓缩，得50℃相对密度为1.4的稠浸膏；
(2)在步骤(1)的稠浸膏中加20L水分散成悬浮液，用乙酸乙酯重复萃取6次，每次用量25L，充分振摇，静置分层，收集乙酸乙酯层，减压回收溶剂，得到干燥固体组分Fr.EtOAc(200.5g)；
(3)组分Fr.EtOAc经300目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝8cm、H＝45cm，用体积比1:0、50:1、25:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱6个柱体积，收集25:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-3(5.8g)；
(4)组分Fr.EtOAc-3经中压FlashODS柱色谱(220g)，用体积比40:60、50:50、60:40、70:30的甲醇-水进行梯度洗脱，每个比例洗脱10个柱体积，流速20mL/min，分别收集50:50、70:30的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-3-D(1.3g)和Fr.EtOAc-3-H(1.6g)；
(5)组分Fr.EtOAc-3-D用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，用C18色谱柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比43:57的乙腈-水，流速3mL/min，收集100.50min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物2(39.8mg)。
(6)组分Fr.EtOAc-3-H用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，用C18色谱柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比70:30的甲醇-水，流速3mL/min，收集43.13min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物1(30.3mg)。
实施例4
本发明在具体实施时，制备方法包括以下步骤：
(1)取干燥的中华雪胆块根20.0kg，每次加95％乙醇溶液200L，回流提取3次，每次提取3h，合并提取液，减压浓缩，得50℃相对密度为1.3的稠浸膏；
(2)在步骤(1)的稠浸膏中加20L水分散成悬浮液，用乙酸乙酯重复萃取6次，每次用量25L，充分振摇，静置分层，收集乙酸乙酯层，减压回收溶剂，得到干燥固体组分Fr.EtOAc(230.5g)；
(3)组分Fr.EtOAc经200目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝12cm、H＝60cm，用体积比1:0、50:1、25:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱10个柱体积，收集25:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-3(7.2g)；
(4)组分Fr.EtOAc-3经中压FlashODS柱色谱(250g)，用体积比40:60、50:50、60:40、70:30的甲醇-水进行梯度洗脱，每个比例洗脱10个柱体积，流速20mL/min，分别收集50:50、70:30的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-3-D(2.0g)和Fr.EtOAc-3-H(2.6g)；
(5)组分Fr.EtOAc-3-D用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，用C18色谱柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比43:57的乙腈-水，流速3mL/min，收集100.50min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物2(55.5mg)。
(6)组分Fr.EtOAc-3-H用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，用C18色谱柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比70:30的甲醇-水，流速3mL/min，收集43.13min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物1(48.6mg)。
要指出的是，上述实施例仅是用于说明本发明的具体实施方式，以对该从中华雪胆中提取具有治疗胃溃疡作用的葫芦烷型五环三萜类化合物及其提取方法进行的详细描述，是说明性的，而不是用于限定本发明的保护范围，凡是在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，均应属本发明的保护范围之内，并经试验得到了证明，相关试验资料如下：
一、结构鉴定
本发明所得化合物经测定，鉴定为从中华雪胆中提取的2个新的葫芦烷型五环三萜类化合物：化合物1和化合物2。
化合物1：白色无定形粉末，易溶于甲醇等有机溶剂。旋光度紫外光谱显示在203nm处有最大吸收峰；红外光谱提示该化合物存在羟基(3366cm-1)，羰基(1685cm-1)；HR-ESI-MS谱显示准分子离子峰m/z 485.32697[M-H]-(C30H45O5计算值为485.32615)，结合1H-NMR、13C-NMR谱确定分子式为C30H46O5，不饱和度为8。
根据1H-NMR和HSQC谱，显示有两个烯氢质子δH6.02(d,J＝8.7Hz,H-24),5.76(d,J＝6.3Hz,H-6)；四个连氧次甲基氢质子δH3.50(ddd,J＝11.4,9.3,4.2Hz,H-2)，2.86(d,J＝9.3Hz,H-3),4.67(t,J＝7.4Hz,H-16),4.58(m,H-23)；八个甲基质子δH1.74(s,H-27),1.67(s,H-26),1.30(s,H-21),1.24(s,H-30),1.18(s,H-28),1.09(s,H-19),0.97(s,H-18),0.95(s,H-29)。根据13C-NMR和HSQC谱，显示有30个碳信号，其中有一个酮羰基δC216.4(C-11)；两组双键δC142.8(C-5),135.8(C-25),126.9(C-24),120.0(C-6)；一个连氧季碳δC73.5(C-20)；四个连氧次甲基δC81.9(C-3),72.7(C-16),71.7(C-2),71.6(C-23)；五个亚甲基δC49.5(C-12),46.7(C-22),41.7(C-15),34.8(C-1),24.9(C-7)；2个次甲基δC56.5(C-17),43.8(C-8),34.6(C-10)；八个甲基δC26.1(C-27),29.8(C-21),25.5(C-28),22.3(C-29),21.7(C-30),20.7(C-19),20.1(C-18),17.8(C-26)。详细信息见表1。以上数据含有3个不饱和度，提示该化合物为五环三萜类化合物。
结合1H-1H COSY谱显示有四个自旋耦合片段H-10/H2-1/H-2/H-3、H-6/H2-7/H-8、H2-15/H-16/H-17和H-22/H2-23/H2-24。HMBC谱显示，H-2与C-1、C-3、C-4、C-10相关；H-3与C-1、C-4、C-5、C-28、C-29相关；H-6与C-4、C-5、C-7、C-8、C-10相关；H-16与C-13、C-14、C-15、C-17相关；H-17与C-12、C-13、C-14、C-15、C-16、C-18、C-20、C-21、C-22相关；H-23与C-20、C-22、C-24、C-25相关；H-24与C-22、C-23、C-25、C-26、C-27相关；H3-18与C-12、C-13、C-14、C-17相关；H3-19与C-8、C-9、C-10、C-11相关；H3-21与C-17、C-20、C-22相关；H3-26/27与C-24、C-25相关；H3-28/29与C-3、C-4、C-5相关，表明该化合物为葫芦烷型五环三萜类化合物。其中，H-23与C-16有明显的HMBC相关，结合C-16和C-23的化学位移，提示C-16与C-23之间连接有氧桥，形成一个新的六元氧环。综合以上数据，确定了化合物1的平面结构。
化合物1的相对构型是通过NOESY谱确定的。NOESY谱显示H-3与H3-28相关，H-2与H-10、H3-29相关，提示OH-2与OH-3分别处于异侧，分别定为β、α构型。由H-8与H3-18、H3-19相关，H3-19与H-1β相关，H3-18与H-16相关，提示Me-18、Me-19、H-8和H-16均为β构型。由H-17与H3-21、H-23、H3-30相关，H3-21与H-23相关，H3-30与H-10相关，提示Me-21、Me-30、H-17和H-23均为α构型。
化合物1的绝对对构型是通过比较实测和计算ECD光谱确定的。实测ECD光谱在203nm和299nm处显示正的Cotton效应。计算曲线与实验曲线吻合良好，但有轻微的峰移(见图1)，表明化合物1的绝对构型为2S,2S,8S,9R,10R,13R,14S,16R,17R,20S,23S。
化合物2：白色无定形粉末，易溶于甲醇等有机溶剂。旋光度紫外光谱显示在203nm处有最大吸收峰；红外光谱提示该化合物存在羟基(3370cm-1)，羰基(1684cm-1)；HR-ESI-MS谱显示准分子离子峰m/z 537.29822[M+Cl]-(C30H46O6Cl计算值为537.29884)，结合1H-NMR、13C-NMR谱确定分子式为C30H46O6，不饱和度为8。
根据1D NMR和HSQC谱显示一个酮羰基δC216.0(C-11)；两组双键δH6.20(dq,J＝8.2,1.4Hz,H-24),5.75(d,J＝6.4Hz,H-6)；δC142.8(C-5),138.4(C-25),127.1(C-24),120.0(C-6)；一个连氧季碳δC73.5(C-20)；四个连氧次甲基δH3.53(m,H-2)，2.85(d,J＝9.3Hz,H-3),4.72(t,J＝7.2Hz,H-16),4.60(m,H-23)；δC81.9(C-3),72.5(C-16),71.7(C-2),71.5(C-23)；七个甲基δH1.68(s,H-27),1.29(s,H-21),1.24(s,H-30),1.17(s,H-29),1.09(s,H-19),0.94(s,H-28),0.94(s,H-18)；δC29.8(C-21),22.2(C-28),25.4(C-29),21.6(C-30),20.1(C-19),13.7(C-27),14.2(C-18)，见表1。HMBC谱显示关键的H-23与C-16相关，提示C-16与C-23之间连接有氧桥。与化合物1数据进行对比，发现二者结构十分相似，同为葫芦烷型五环三萜类化合物。主要区别是该化合物的C-26位连接有游离羟基，可根据一维核磁图谱结合HSQC谱显示的连氧亚甲基信号δH3.94(2H,m,H-26),δC68.6(C-26)，以及HMBC谱上H2-26与C-24、C-25、C-27相关确定。综合以上信息，确定了化合物2的平面结构。
化合物2的相对构型是通过与化合物1一致的ROESY分析确定的。
化合物2的绝对构型是通过比较实测和计算ECD光谱确定的。实测ECD光谱在203nm和299nm处显示正的Cotton效应。计算曲线与实验曲线吻合良好，但有轻微的峰移(见图1)，表明化合物2的绝对构型为2S,2S,8S,9R,10R,13R,14S,16R,17R,20S,23S。
表1.化合物1和化合物2的1H和13C-NMR数据(500and125MHzinMeOD,δinppm,JinHz)
二、体内活性实验
以化合物1和化合物2(1：1)制备了一种治疗急性胃溃疡的药物，进行体内活性实验。
试验方法：30只雄性SD大鼠，按体质量分为5组(n＝6)，即正常组、模型组、雷尼替丁(35mg/kg)组、高剂量组(30mg/kg)、低剂量组(15mg/kg)。各组大鼠适应性喂养7d后开始给药，各给药组给予相应药物灌服，正常组和模型组灌服等体积赋形剂(1％Na-CMC)，每天两次，持续7d。造模前24h，大鼠禁食禁水。实验当天最终给药30min后，每只大鼠灌服2mL盐酸乙醇(150mMHCl中的60％EtOH)诱导急性胃溃疡。1h后，按5mL/kg剂量腹腔注射20％乌拉坦溶液，动物麻醉后取仰卧位大鼠，手术分离胃组织，并立即在4℃预冷的生理盐水中进行洗涤。沿胃大弯剪开胃体，生理盐水清洗胃黏膜表面的污物，并将其展开在板上，使用数码相机拍照。使用ImageJ软件测量每个粘膜糜烂病变的面积(mm2)，得出溃疡面积，根据下式计算抑制率：溃疡抑制率＝[(模型组溃疡面积-给药组溃疡面积)/模型组溃疡面积]×100％。
制备的治疗胃溃疡药物高、低剂量组均有显著的抑制活性。观察大鼠胃黏膜情况，正常组大鼠胃黏膜呈粉红色，皱壁走向清晰，表面光滑无出血点；灌胃给予盐酸乙醇造模后引起胃黏膜腺体部分溃疡形成，与正常组相比，模型组大鼠胃黏膜出现明显出血点，形成多条状血带，呈暗红色，溃疡面积138.00±18.25mm2。与模型组相比，高、低剂量组大鼠胃黏膜形态改善，无点状出血点，仅有细的血带形成，呈粉色，溃疡面积分别为10.24±4.17、35.31±7.22mm2，显著降低了胃粘膜损伤(P＜0.01)，且剂量依赖性改善胃组织损伤。提示制备的治疗胃溃疡药物在30、15mg/kg剂量下均可以显著抑制盐酸乙醇法致大鼠急性胃溃疡，具有很好的抗胃溃疡活性。
本发明经鉴定，是两个中华雪胆中提取的新的葫芦烷型五环三萜类化合物，其制备方法易操作，导向性强，产品纯度高，本发明葫芦烷型五环三萜类化合物1，2作为活性先导化合物，有效用于制备治疗胃溃疡的药物，具有巨大的开发前景，经济和社会效益巨大。
Claims (6)
1.一种从中华雪胆中提取的葫芦烷型五环三萜类混合物，其特征在于，由化合物1和化合物2按照1:1组成，其分子式分别是C30H46O5和C30H46O6，不饱和度均为8，结构式分别为：
2.权利要求1所述的从中华雪胆中提取的葫芦烷型五环三萜类混合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取干燥的中华雪胆块根20.0kg，每次加95％乙醇溶液100～300L，回流提取1～4次，每次提取1～4h，合并提取液，减压浓缩，得50℃相对密度为1.2～1.4的稠浸膏；
(2)在步骤(1)的稠浸膏中加10～20L水分散成悬浮液，用乙酸乙酯重复萃取3～10次，每次用量15～25L，充分振摇，静置分层，收集乙酸乙酯层，减压回收溶剂，得到干燥固体组分Fr.EtOAc；
(3)组分Fr.EtOAc经80～300目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝6～12cm、H＝30～60cm，用体积比1:0、50:1、25:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱4～10个柱体积，收集25:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-3；
(4)组分Fr.EtOAc-3经中压Flash ODS柱色谱，用体积比40:60、50:50、60:40、70:30的甲醇-水进行梯度洗脱，每个比例洗脱5～10个柱体积，流速15～20mL/min，分别收集50:50、70:30的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-3-D和Fr.EtOAc-3-H；
(5)组分Fr.EtOAc-3-D用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，用C18色谱柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比43:57的乙腈-水，流速3mL/min，收集100.50min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物2；
(6)组分Fr.EtOAc-3-H用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，用C18色谱柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比70:30的甲醇-水，流速3mL/min，收集43.13min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物1。
3.根据权利要求2所述的从中华雪胆中提取的葫芦烷型五环三萜类混合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取干燥的中华雪胆块根20.0kg，每次加95％乙醇溶液250L，回流提取2次，每次提取2h，合并提取液，减压浓缩，得50℃相对密度为1.3的稠浸膏；
(2)在步骤(1)的稠浸膏中加10L水分散成悬浮液，用乙酸乙酯重复萃取10次，每次用量15L，充分振摇，静置分层，收集乙酸乙酯层，减压回收溶剂，得到干燥固体组分Fr.EtOAc；
(3)组分Fr.EtOAc经200目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝10cm、H＝50cm，用体积比1:0、50:1、25:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱8个柱体积，收集25:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-3；
(4)组分Fr.EtOAc-3经中压Flash ODS柱色谱，用体积比40:60、50:50、60:40、70:30的甲醇-水进行梯度洗脱，每个比例洗脱10个柱体积，流速20mL/min，分别收集50:50、70:30的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-3-D和Fr.ETOAC-3-H；
(5)组分Fr.EtOAc-3-D用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，用C18色谱柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比43:57的乙腈-水，流速3mL/min，收集100.50min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物2；
(6)组分Fr.EtOAc-3-H用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，用C18色谱柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比70:30的甲醇-水，流速3mL/min，收集43.13min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物1。
4.根据权利要求2所述的从中华雪胆中提取的葫芦烷型五环三萜类混合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取干燥的中华雪胆块根20.0kg，每次加95％乙醇溶液300L，回流提取1次，每次提取4h，合并提取液，减压浓缩，得50℃相对密度为1.2的稠浸膏；
(2)在步骤(1)的稠浸膏中加15L水分散成悬浮液，用乙酸乙酯重复萃取6次，每次用量20L，充分振摇，静置分层，收集乙酸乙酯层，减压回收溶剂，得到干燥固体组分Fr.EtOAc；
(3)组分Fr.EtOAc经80目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝6cm、H＝30cm，用体积比1:0、50:1、25:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱4个柱体积，收集25:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-3；
(4)组分Fr.EtOAc-3经中压Flash ODS柱色谱，用体积比40:60、50:50、60:40、70:30的甲醇-水进行梯度洗脱，每个比例洗脱10个柱体积，流速15mL/min，分别收集50:50、70:30的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-3-D和Fr.EtOAc-3-H；
(5)组分Fr.EtOAc-3-D用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，用C18色谱柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比43:57的乙腈-水，流速3mL/min，收集100.50min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物2；
(6)组分Fr.EtOAc-3-H用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，用C18色谱柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比70:30的甲醇-水，流速3mL/min，收集43.13min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物1。
5.根据权利要求2所述的从中华雪胆中提取的葫芦烷型五环三萜类混合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取干燥的中华雪胆块根20.0kg，每次加95％乙醇溶液100L，回流提取4次，每次提取1h，合并提取液，减压浓缩，得50℃相对密度为1.4的稠浸膏；
(2)在步骤(1)的稠浸膏中加20L水分散成悬浮液，用乙酸乙酯重复萃取6次，每次用量25L，充分振摇，静置分层，收集乙酸乙酯层，减压回收溶剂，得到干燥固体组分Fr.EtOAc；
(3)组分Fr.EtOAc经300目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝8cm、H＝45cm，用体积比1:0、50:1、25:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱6个柱体积，收集25:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-3；
(4)组分Fr.EtOAc-3经中压Flash ODS柱色谱，用体积比40:60、50:50、60:40、70:30的甲醇-水进行梯度洗脱，每个比例洗脱10个柱体积，流速20mL/min，分别收集50:50、70:30的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-3-D和Fr.EtOAc-3-H；
(5)组分Fr.EtOAc-3-D用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，用C18色谱柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比43:57的乙腈-水，流速3mL/min，收集100.50min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物2；
(6)组分Fr.EtOAc-3-H用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，用C18色谱柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比70:30的甲醇-水，流速3mL/min，收集43.13min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物1。
6.权利要求1所述的从中华雪胆中提取的葫芦烷型五环三萜类混合物在制备治疗胃溃疡药物中的应用。
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| CN202210929093.0A CN115710300B (zh) | 2022-08-03 | 2022-08-03 | 一种从中华雪胆中提取的葫芦烷型五环三萜类化合物的制备方法及其应用 |
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Non-Patent Citations (6)
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| Bioactive cucurbitane triterpenoids from the tubers of Hemsleya penxianensis;Ye-Dan Li 等;《Phytochemistry Letters》;第18卷;5-9 * |
| CUCURBITACINS FROM WILBRANDIA EBRACTEATA;ELOIR PAULO SCHENKE 等;《Phytochemistry》;第31卷(第4期);1329-1333 * |
| Cucurbitane-Type Triterpenoids from the Stems of Cucumis melo;Chuan Chen 等;《Journal of Natural Products》;第72卷(第5期);824-829 * |
| Novel Triterpenoid Alkaloids With Their Potential Cytotoxic Activity From the Roots of Siraitia grosvenorii;Huijuan Wang 等;《Frontiers in Chemistry》;第10卷;1-13 * |
| polyhydroxy cucurbitane triterpenes from Hemsleya penxianensis tubers;Zhaocui Sun 等;《Scientific Reports》;第9卷;1-10 * |
| 金佛山雪胆的化学成分及生物活性研究;李莹;济南大学硕士学位论文;20170315;全文 * |
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