CN115160396B - 从中华雪胆中提取的具有抗肠炎活性的葫芦烷型四环三萜类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

从中华雪胆中提取的具有抗肠炎活性的葫芦烷型四环三萜类化合物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及从中华雪胆中提取的具有抗肠炎活性的葫芦烷型四环三萜类化合物及其制备方法与应用，可有效解决从中华雪胆中制备新的葫芦烷型四环三萜类化合物，并实现在制备治疗肠炎药物中的应用问题，解决的技术方案是，中华雪胆加乙醇回流提取，提取液减压浓缩成样品溶液，加水分散，用乙酸乙酯萃取，减压浓缩萃取溶液，经硅胶柱色谱，用二氯甲烷‑甲醇梯度洗脱，收集洗脱液，经中压Flash MCI柱色谱，用甲醇‑水洗脱，收集洗脱液，减压回收溶剂，得化合物1、化合物2。本发明易操作，导向性强，产品纯度高，该化合物可有效用于制备治疗肠炎的药物，开拓了中华雪胆的药用价值。

Description

从中华雪胆中提取的具有抗肠炎活性的葫芦烷型四环三萜类 化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及医药领域，特别是一种从中华雪胆中提取的具有抗肠炎活性的葫芦烷型四环三萜类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
中华雪胆为葫芦科雪胆属植物雪胆(Hemsleya chinensis)的块茎，现收载于《贵州中药材民族药材质量标准》和《湖北中药材质量标准》。味苦，性寒，具有清热解毒、消肿散结、止痛的功效，用于菌痢、肠炎等。中华雪胆广泛分布于我国西南部山区，如云南、四川、贵州等省，资源丰富且价格低廉。长期以来被作为西南地区的常用民间药物，治疗胃肠道疾病、牛羊等家畜腹泻等疾病。葫芦烷型四环三萜类成分为中华雪胆的主要活性成分。现中华雪胆等雪胆属植物提取物已被开发上市为雪胆素片，其主要成分为雪胆素甲、雪胆素乙等葫芦烷型四环三萜类成分，用于治疗菌痢、肠炎、支气管炎、急性扁桃体炎等疗效确切。遵循传统功效，同时结合对中华雪胆的前期研究，希望从中华雪胆中获得结构新颖、抗炎活性强的新葫芦烷型四环三萜类化合物，有效用于肠炎的治疗。但至今未见有从中华雪胆制备治疗肠炎活性的葫芦烷型四环三萜类化合物1(hemchininC)和化合物2(hemchininD)的公开报导。
发明内容
针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种从中华雪胆中提取葫芦烷型四环三萜类化合物的制备方法及其应用，可有效解决从中华雪胆中提取葫芦烷型四环三萜类化合物，实现在制备治疗肠炎药物中的应用问题。
本发明解决的技术方案是，一种从中华雪胆中提取的葫芦烷型四环三萜类化合物，包括化合物1(hemchininC)和化合物2(hemchininD)，其分子式均为C30H46O6，不饱和度均为8，结构式分别为：
其制备方法，包括以下步骤：
(1)取干燥的中华雪胆块根15.0kg，每次加70％乙醇溶液80～300L，回流提取1～4次，每次提取1～4h，合并提取液，减压浓缩，得到相当于生药量1.0～3.0g/mL的样品溶液；
(2)在步骤(1)的样品溶液中加5～10L分散成悬浮液，用乙酸乙酯重复萃取3～10次，每次用量15～30L，充分振摇，静置分层，收集乙酸乙酯层，减压回收溶剂，得到干燥固体组分Fr.EtOAc(142.4～180.7g)；
(3)组分Fr.EtOAc经80～300目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝6～10cm、H＝30～50cm，用体积比1:0、50:1、25:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱3～8个柱体积，收集10:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4(12.1～21.6g)；
(4)组分Fr.EtOAc-4经中压FlashMCI柱色谱(220～330g)，用体积比30:70、50:50、70:30、90:10的甲醇-水进行梯度洗脱，流速20～25mL/min，每个比例洗脱3～10个柱体积，收集70:30的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4-D(2.5～4.8g)；
(5)组分Fr.EtOAc-4-D经中压FlashODS柱色谱(80～220g)，用体积比60:40、70:30、80:20的甲醇-水进行梯度洗脱，流速10～20mL/min，每个比例洗脱5～10个柱体积，收集60:40的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4-D-2(0.9～1.9g)；
(6)组分Fr.EtOAc-4-D-2用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，经C18柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比57:43的甲醇-水，3mL/min，分别收集44.36、50.89min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物1(56.7～78.4mg)和化合物2(43.3～69.1mg)。本发明所述的化合物1(hemchininC)和化合物2(hemchininD)在制备治疗肠炎药物中的应用。
本发明经鉴定，是两个从中华雪胆提取的新的葫芦烷型四环三萜类化合物hemchininC和hemchininD，其制备方法易操作，导向性强，产品纯度高，该化合物可有效用于制备治疗肠炎的药物，开拓了中华雪胆的药用价值和商业价值，经济和社会效益巨大。
附图说明
图1为本发明化合物1、化合物2的化学结构图。
图2为本发明化合物1、化合物2的关键1H-1HCOSY和HMBC相关图。
图3为本发明化合物1、化合物2的关键NOESY相关图。
图4为本发明化合物1、化合物2的实验和计算ECD光谱图。
图5为本发明的工艺流程图。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1
本发明在具体实施时，其制备方法如图5所示，包括以下步骤：
(1)取干燥的中华雪胆块根15.0kg，每次加70％乙醇溶液200L，回流提取2次，每次提取2h，合并提取液，减压浓缩，得到相当于生药量2.0g/mL的样品溶液；
(2)在步骤(1)的样品溶液中加10L分散成悬浮液，用乙酸乙酯重复萃取10次，每次用量20L，充分振摇，静置分层，收集乙酸乙酯层，减压回收溶剂，得到干燥固体组分Fr.EtOAc(175.7g)；
(3)组分Fr.EtOAc经200目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝8cm、H＝40cm，用体积比1:0、50:1、25:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱8个柱体积，收集10:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4(18.3g)；
(4)组分Fr.EtOAc-4经中压FlashMCI柱色谱(330g)，用体积比30:70、50:50、70:30、90:10的甲醇-水进行梯度洗脱，流速25mL/min，每个比例洗脱5个柱体积，收集70:30的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4-D(3.8g)；
(5)组分Fr.EtOAc-4-D经中压FlashODS柱色谱(220g)，用体积比60:40、70:30、80:20的甲醇-水进行梯度洗脱，流速20mL/min，每个比例洗脱5个柱体积，收集60:40的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4-D-2(1.5g)；
(6)组分Fr.EtOAc-4-D-2用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，经C18柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比57:43的甲醇-水，3mL/min，分别收集44.36min、50.89min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物1(68.7mg)和化合物2(55.3mg)。
实施例2
本发明在具体实施时，制备方法包括以下步骤：
(1)取干燥的中华雪胆块根15.0kg，每次加70％乙醇溶液80L，回流提取4次，每次提取1h，合并提取液，减压浓缩，得到相当于生药量3.0g/mL的样品溶液；
(2)在步骤(1)的样品溶液中加10L分散成悬浮液，用乙酸乙酯重复萃取6次，每次用量15L，充分振摇，静置分层，收集乙酸乙酯层，减压回收溶剂，得到干燥固体组分Fr.EtOAc(166.4g)；
(3)组分Fr.EtOAc经80目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝7cm、H＝35cm，用体积比1:0、50:1、25:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱3个柱体积，收集10:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4(13.2g)；
(4)组分Fr.EtOAc-4经中压FlashMCI柱色谱(220g)，用体积比30:70、50:50、70:30、90:10的甲醇-水进行梯度洗脱，流速20mL/min，每个比例洗脱10个柱体积，收集70:30的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4-D(3.1g)；
(5)组分Fr.EtOAc-4-D经中压FlashODS柱色谱(120g)，用体积比60:40、70:30、80:20的甲醇-水进行梯度洗脱，流速15mL/min，每个比例洗脱8个柱体积，收集60:40的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4-D-2(1.2g)；
(6)组分Fr.EtOAc-4-D-2用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，经C18柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比57:43的甲醇-水，3mL/min，分别收集44.36min、50.89min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物1(60.9mg)和化合物2(49.6mg)。
实施例3
本发明在具体实施时，制备方法包括以下步骤：
(1)取干燥的中华雪胆块根15.0kg，每次加70％乙醇溶液300L，回流提取1次，每次提取4h，合并提取液，减压浓缩，得到相当于生药量1.0g/mL的样品溶液；
(2)在步骤(1)的样品溶液中加5L分散成悬浮液，用乙酸乙酯重复萃取3次，每次用量30L，充分振摇，静置分层，收集乙酸乙酯层，减压回收溶剂，得到干燥固体组分Fr.EtOAc(142.4g)；
(3)组分Fr.EtOAc经300目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝6cm、H＝30cm，用体积比1:0、50:1、25:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱10个柱体积，收集10:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4(12.1g)；
(4)组分Fr.EtOAc-4经中压FlashMCI柱色谱(220g)，用体积比30:70、50:50、70:30、90:10的甲醇-水进行梯度洗脱，流速20mL/min，每个比例洗脱3个柱体积，收集70:30的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4-D(2.5g)；
(5)组分Fr.EtOAc-4-D经中压FlashODS柱色谱(80g)，用体积比60:40、70:30、80:20的甲醇-水进行梯度洗脱，流速10mL/min，每个比例洗脱10个柱体积，收集60:40的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4-D-2(0.9g)；
(6)组分Fr.EtOAc-4-D-2用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，经C18柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比57:43的甲醇-水，3mL/min，分别收集44.36min、50.89min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物1(56.7mg)和化合物2(43.3mg)。
实施例4
本发明在具体实施时，制备方法包括以下步骤：
(1)取干燥的中华雪胆块根15.0kg，每次加70％乙醇溶液150L，回流提取3次，每次提取2h，合并提取液，减压浓缩，得到相当于生药量2.5g/mL的样品溶液；
(2)在步骤(1)的样品溶液中加10L分散成悬浮液，用乙酸乙酯重复萃取6次，每次用量20L，充分振摇，静置分层，收集乙酸乙酯层，减压回收溶剂，得到干燥固体组分Fr.EtOAc(180.7g)；
(3)组分Fr.EtOAc经200目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝10cm、H＝50cm，用体积比1:0、50:1、25:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱6个柱体积，收集10:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4(21.6g)；
(4)组分Fr.EtOAc-4经中压FlashMCI柱色谱(330g)，用体积比30:70、50:50、70:30、90:10的甲醇-水进行梯度洗脱，流速25mL/min，每个比例洗脱6个柱体积，收集70:30的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4-D(4.8g)；
(5)组分Fr.EtOAc-4-D经中压FlashODS柱色谱(220g)，用体积比60:40、70:30、80:20的甲醇-水进行梯度洗脱，流速20mL/min，每个比例洗脱6个柱体积，收集60:40的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4-D-2(1.9g)；
(6)组分Fr.EtOAc-4-D-2用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，经C18柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比57:43的甲醇-水，3mL/min，分别收集44.36min、50.89min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物1(78.4mg)和化合物2(69.1mg)。
要指出的是，上述实施例仅是用于说明本发明的具体实施方式，以对该从中华雪胆中提取具有治疗肠炎活性的化合物及其提取方法进行的详细描述，是说明性的，而不是用于限定本发明的保护范围，凡是在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，均应属本发明的保护范围之内，并经试验得到了证明，相关试验资料如下：
一、结构鉴定
本发明所得化合物经测定，鉴定为从中华雪胆中提取的2个新的葫芦烷型四环三萜类化合物：化合物1和化合物2，分子结构式见图1所示。
化合物1：白色无定形粉末，易溶于甲醇等有机溶剂。旋光度[α]2D5 42.001(c0.1,CH3OH)；紫外光谱显示在203nm处有最大吸收峰；红外光谱提示该化合物存在羟基(3369cm-1)，羰基(1686cm-1)；HR-ESI-MS谱显示准分子离子峰m/z 501.32220[M-H]-(C30H45O6计算值为501.32216)，结合1H-NMR、13C-NMR谱确定分子式为C30H46O6，不饱和度为8。
根据1D NMR和HSQC谱显示两个酮羰基δC 216.5(C-22),216.2(C-11)；两组双键(其中有一组末端双键)δH 5.75(d,J＝6.2Hz,H-6),4.71(s,H-26),4.70(s,H-26)；δC 146.3(C-25),142.7(C-5),119.9(C-6),110.0(C-26)；一个连氧季碳δC 80.7(C-20)；三个连氧次甲基δH 3.54(m,H-2)，2.86(d,J＝9.3Hz,H-3),4.44(t,J＝7.3Hz,H-16)；δC 81.9(C-3),71.6(C-16),71.5(C-2)；七个甲基δH 1.74(s,H-27),1.37(s,H-21),1.28(s,H-30),1.18(s,H-28),1.08(s,H-19),0.95(s,H-29),0.90(s,H-18)；δC 25.5(C-28),25.3(C-21),22.8(C-29),22.3(C-27),20.5(C-30),20.5(C-19),19.8(C-18)，见表1。以上推测该化合物为葫芦烷型四环三萜类化合物。
结合1H-1H COSY谱显示有四个自旋耦合片段H-10/H2-1/H-2/H-3、H-6/H2-7/H-8、H2-15/H-16/H-17和H2-23/H2-24。HMBC谱(见图2)显示两个连氧氢质子H-2与C-1、C-3、C-4、C-10相关；H-3与C-1、C-2、C-4、C-5、Me-28、Me-29相关，表明C-2、C-3位分别有游离羟基取代；H-8、H-10、H3-19、H2-12分别与C-11位酮羰基相关，H-17、H3-21、H2-23、H2-24分别与C-22位酮羰基相关，表明C-11、C-22位处分别有酮羰基取代；末端双键H2-26与C-24、C-25、Me-27相关，H2-24与C-22、C-23、C-25、C-26、Me-27相关，表明存在末端双键Δ25,26；由H-17，H3-21与连氧季碳C-21相关，H-17，H2-15与连氧次甲基C-16相关，结合化合物分子式，提示C-16、C-20位均存在游离羟基取代。综合以上信息，确定了化合物1的平面结构。
化合物1的相对构型是通过NOESY分析确定的(见图3)。NOESY谱显示H-3与H3-28相关，H-2与H-10、H3-29相关，提示OH-2与OH-3分别处于异侧，分别暂定为β、α构型。由H-8与H3-18、H3-19相关，H3-19与H-1β相关，H3-18与H-16相关，提示Me-18、Me-19、H-8和H-16均为β构型。由H-10与H3-30相关，H-17与H-23、H3-30相关，提示H-17、H-23和Me-30均为α构型。化合物1的ECD光谱在201nm和300nm处显示正的Cotton效应。通过比较计算和实测ECD光谱，计算曲线与实验曲线吻合良好，但有轻微的峰移(见图4)，确定化合物1的C-2,C-3,C-8,C-9,C-10,C-13,C-14,C-16,C-17的绝对构型分别为S,S,S,R,R,R,S,R,R,R。综上确定化合物为2β,3α,16α,20-tetrahydroxycucurbita-5,25-dien-11,22-dione,分子结构式为：
化合物2：白色无定形粉末，易溶于甲醇等有机溶剂。旋光度[α]2D5-46.001(c0.1,CH3OH)；紫外光谱显示在202nm处有最大吸收峰；红外光谱提示该化合物存在羟基(3464cm-1)，羰基(1693cm-1)；HR-ESI-MS谱显示准分子离子峰m/z 501.32190[M-H]+(C30H45O6计算值为501.32110)，结合1H-NMR、13C-NMR谱确定分子式为C30H46O6，不饱和度为8。
根据1D NMR和HSQC谱显示两个酮羰基δC 216.2(C-11),215.9(C-22)；两组双键δH5.75(d,J＝6.0Hz,H-6),5.29(tq,J＝6.4,1.5Hz,H-24)；δC 136.0(C-25),135.6(C-5),120.2(C-6),118.1(C-24)；一个连氧季碳δC 80.8(C-20)；三个连氧次甲基δH 3.57(m,H-2)，2.85(d,J＝9.3Hz,H-3),4.47(t,J＝7.5Hz,H-16)；δC 81.9(C-3),71.6(C-16),71.5(C-2)；八个甲基δH 1.74(s,H-27),1.64(s,H-26),1.38(s,H-30),1.31(s,H-21),1.18(s,H-28),1.08(s,H-19),0.97(s,H-29),0.90(s,H-18)；δC 25.9(C-27),25.6(C-30),25.4(C-28),22.3(C-29),20.5(C-18,19),19.8(C-21),18.2(C-26),见表1。与化合物1数据进行对比，发现二者结构十分相似，同为葫芦烷型四环三萜类化合物。主要区别是末端双键发生转移，该化合物存在双键Δ24,25，可根据HMBC谱(见图2)上烯氢质子H-24与C-22、C-23、C-25、C-26、C-27相关确定。综合以上信息，确定了化合物2的平面结构。
化合物2的相对构型是通过与化合物1一致的NOESY分析确定的(见图3)。
化合物2的ECD光谱在201nm和300nm处显示正的Cotton效应。通过比较计算和实测ECD光谱，计算曲线与实验曲线吻合良好，但有轻微的峰移(见图4)，确定化合物3的C-2,C-3,C-8,C-9,C-10,C-13,C-14,C-16,C-17的绝对构型分别为S,S,S,R,R,R,S,R,R,R。综上确定化合物为2β,3α,16α,20-tetrahydroxycucurbita-5,25-dien-11,22-dione,分子结构式为：
表1.化合物1和化合物2的1H和13C-NMR数据(500and125MHzinMeOD,δinppm,JinHz)
二、体内活性实验
以化合物1、化合物2为主成分制备了一种治疗肠炎的药物，进行了体内活性实验。
试验方法：30只昆明雌性小鼠，适应性喂养3d，随机分为正常对照组(生理盐水)，模型组(5％葡聚糖硫酸钠DSS，1.0g/kg)，阳性对照组(柳氮磺吡啶肠溶片，0.5g/kg)，高、低剂量组(200、100mg/kg)，每组6只，灌胃剂量20mL/kg。除正常组外其余各组小鼠灌胃5％DSS溶液(1.0g/kg)，建立肠炎模型，每天1次，连续7d，第4天开始给药干预，每天1次，连续7d。对各组小鼠精神状态及活动状况、皮毛光滑度、肛周大便污染等进行观察。7d后将小鼠处死取结肠1cm，滤纸将血液及表面水分吸干，电子天平称定湿质量，再于60℃烘箱中烘烤24h，称定干质量，计算结肠湿/干质量比。
制备的治疗肠炎药物高、低剂量组均有显著的治疗作用。正常对照组小鼠活动敏捷，体质量正常增加，皮毛光滑，无腹泻，大便呈颗粒状；模型组小鼠逐渐出现厌食，皮毛无光泽，体质量减轻，肛周污染，可见稀便、粪便隐血为阳性；各给药组、阳性对照组小鼠摄食量、体质量均有不同程度的增加，稀便、血便也有不同程度的减轻。给药7d后，与正常组相比，模型组小鼠结肠湿/干质量(7.12±0.45)显著升高；与模型组相比，高、低剂量组小鼠结肠湿/干质量(5.55±0.73、6.31±0.35)显著降低。由此可以看出，制备的治疗肠炎药物在200mg/kg和100mg/kg剂量下均可以显著抑制葡聚糖硫酸钠诱导的小鼠肠炎，具有很好的活性。
本发明经鉴定，是两个从中华雪胆提取的新的葫芦烷型四环三萜类化合物hemchininC和hemchininD，其制备方法易操作，导向性强，产品纯度高，本发明葫芦烷型四环三萜类化合物1和化合物2作为活性先导化合物，有效用于制备治疗肠炎的药物，具有巨大的开发前景，经济和社会效益巨大。

Claims (6)

1.一种从中华雪胆中提取葫芦烷型四环三萜类化合物，其特征在于，化合物1和化合物2，其分子式均为C30H46O6，不饱和度均为8，结构式分别为：
2.权利要求1所述的从中华雪胆中提取葫芦烷型四环三萜类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取干燥的中华雪胆块根15.0kg，每次加70％乙醇溶液80～300L，回流提取1～4次，每次提取1～4h，合并提取液，减压浓缩，得到相当于生药量1.0～3.0g/mL的样品溶液；
(2)在步骤(1)的样品溶液中加5～10L水分散成悬浮液，用乙酸乙酯重复萃取3～10次，每次用量15～30L，充分振摇，静置分层，收集乙酸乙酯层，减压回收溶剂，得到干燥固体组分Fr.EtOAc；
(3)组分Fr.EtOAc经80～300目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝6～10cm、H＝30～50cm，用体积比1:0、50:1、25:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱3～8个柱体积，收集10:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4；
(4)组分Fr.EtOAc-4经中压Flash MCI柱色谱，用体积比30:70、50:50、70:30、90:10的甲醇-水进行梯度洗脱，流速20～25mL/min，每个比例洗脱3～10个柱体积，收集70:30的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4-D；
(5)组分Fr.EtOAc-4-D经中压Flash ODS柱色谱，用体积比60:40、70:30、80:20的甲醇-水进行梯度洗脱，流速10～20mL/min，每个比例洗脱5～10个柱体积，收集60:40的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4-D-2；
(6)组分Fr.EtOAc-4-D-2用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，经C18柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比57:43的甲醇-水，3mL/min，分别收集44.36、50.89min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物1和化合物2。
3.根据权利要求2所述的从中华雪胆中提取葫芦烷型四环三萜类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取干燥的中华雪胆块根15.0kg，每次加70％乙醇溶液200L，回流提取2次，每次提取2h，合并提取液，减压浓缩，得到相当于生药量2.0g/mL的样品溶液；
(2)在步骤(1)的样品溶液中加10L水分散成悬浮液，用乙酸乙酯重复萃取10次，每次用量20L，充分振摇，静置分层，收集乙酸乙酯层，减压回收溶剂，得到干燥固体组分Fr.EtOAc；
(3)组分Fr.EtOAc经200目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝8cm、H＝40cm，用体积比1:0、50:1、25:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱8个柱体积，收集10:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4；
(4)组分Fr.EtOAc-4经中压Flash MCI柱色谱，用体积比30:70、50:50、70:30、90:10的甲醇-水进行梯度洗脱，流速25mL/min，每个比例洗脱5个柱体积，收集70:30的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4-D；
(5)组分Fr.EtOAc-4-D经中压Flash ODS柱色谱，用体积比60:40、70:30、80:20的甲醇-水进行梯度洗脱，流速20mL/min，每个比例洗脱5个柱体积，收集60:40的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4-D-2；
(6)组分Fr.EtOAc-4-D-2用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，经C18柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比57:43的甲醇-水，3mL/min，分别收集44.36min、50.89min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物1和化合物2。
4.根据权利要求2所述的从中华雪胆中提取葫芦烷型四环三萜类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取干燥的中华雪胆块根15.0kg，每次加70％乙醇溶液80L，回流提取4次，每次提取1h，合并提取液，减压浓缩，得到相当于生药量3.0g/mL的样品溶液；
(2)在步骤(1)的样品溶液中加10L水分散成悬浮液，用乙酸乙酯重复萃取6次，每次用量15L，充分振摇，静置分层，收集乙酸乙酯层，减压回收溶剂，得到干燥固体组分Fr.EtOAc；
(3)组分Fr.EtOAc经80目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝7cm、H＝35cm，用体积比1:0、50:1、25:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱3个柱体积，收集10:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4；
(4)组分Fr.EtOAc-4经中压Flash MCI柱色谱，用体积比30:70、50:50、70:30、90:10的甲醇-水进行梯度洗脱，流速20mL/min，每个比例洗脱10个柱体积，收集70:30的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4-D；
(5)组分Fr.EtOAc-4-D经中压Flash ODS柱色谱，用体积比60:40、70:30、80:20的甲醇-水进行梯度洗脱，流速15mL/min，每个比例洗脱8个柱体积，收集60:40的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4-D-2；
(6)组分Fr.EtOAc-4-D-2用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，经C18柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比57:43的甲醇-水，3mL/min，分别收集44.36min、50.89min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物1和化合物2。
5.根据权利要求2所述的从中华雪胆中提取葫芦烷型四环三萜类化合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取干燥的中华雪胆块根15.0kg，每次加70％乙醇溶液300L，回流提取1次，每次提取4h，合并提取液，减压浓缩，得到相当于生药量1.0g/mL的样品溶液；
(2)在步骤(1)的样品溶液中加5L水分散成悬浮液，用乙酸乙酯重复萃取3次，每次用量30L，充分振摇，静置分层，收集乙酸乙酯层，减压回收溶剂，得到干燥固体组分Fr.EtOAc；
(3)组分Fr.EtOAc经300目硅胶柱色谱，硅胶柱d＝6cm、H＝30cm，用体积比1:0、50:1、25:1、10:1、5:1、0:1的二氯甲烷-甲醇进行梯度洗脱，每个比例洗脱10个柱体积，收集10:1的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4；
(4)组分Fr.EtOAc-4经中压Flash MCI柱色谱，用体积比30:70、50:50、70:30、90:10的甲醇-水进行梯度洗脱，流速20mL/min，每个比例洗脱3个柱体积，收集70:30的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4-D；
(5)组分Fr.EtOAc-4-D经中压Flash ODS柱色谱，用体积比60:40、70:30、80:20的甲醇-水进行梯度洗脱，流速10mL/min，每个比例洗脱10个柱体积，收集60:40的洗脱液，减压回收溶剂，得到干燥粉末组分Fr.EtOAc-4-D-2；
(6)组分Fr.EtOAc-4-D-2用甲醇溶解成50mg/mL的样品溶液，经C18柱在半制备HPLC上进一步分离，洗脱溶剂为体积比57:43的甲醇-水，3mL/min，分别收集44.36min、50.89min的色谱峰，减压回收溶剂，得到干燥粉末状的化合物1和化合物2。
6.权利要求1所述的从中华雪胆中提取葫芦烷型四环三萜类化合物在制备治疗肠炎药物中的应用。
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