CN110804083B - 醋栗叶醇的制备方法及其作为降糖药物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于西印度醋栗中的降血糖活性成分化合物的制备领域。本发明提取的化合物分子式C39H56O3，结构为3α‑桂皮酰氧基乌索‑20(29)‑烯‑18‑醇，经相关数据库检索该化合物为首次发现并报道其相关结构数据，为其命名为醋栗叶醇，英文名：phyllanacidol。获得方法：将西印度醋栗干燥叶经乙醇渗漉提取，提取液减压浓缩后得浸膏，浸膏经硅胶柱色谱分离，依次用石油醚:乙酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸乙酯:乙醇、乙醇、甲醇、水梯度洗脱，根据薄层色谱分析，合并得到3个组分A、B、C；C组分经硅胶柱色谱分离，用石油醚:乙酸乙酯梯度洗脱，薄层色谱分析后合并得到18个组分C1～C18；C9经Sephadex LH‑20凝胶柱色谱甲醇:氯仿洗脱得到C9‑1、C9‑2、C9‑3三个组分；C9‑2经制备液相色谱甲醇洗脱分离得到该化合物。

Description

醋栗叶醇的制备方法及其作为降糖药物的用途
技术领域
本发明属于中药有效成分的提取和运用领域，尤其是西印度醋栗中的具体降血糖活性成 分化合物的制备领域。
背景技术
西印度醋栗(Phyllanthus acidus)为大戟科叶下珠属植物,是大戟科少数可食用果实的树 种之一，在东南亚地区具有悠久的药用和食用历史，在我国云南西双版纳和海南部分地方已 成功实现引种，可以用来治疗高血压、糖尿病等疾病。目前西印度醋栗化学成分的研究文献 较少，西印度醋栗的化学成分主要为萜类，除此之外还有生物碱类、黄酮、苷类、酚类、甾 体类等。
发明内容
解决的技术问题
在西印度醋栗中分离出一种具有降血糖活性的新化合物，并能确定其结构式。
发明采用的技术方案
具有以下结构式Ⅰ所代表的化合物：
Figure BDA0002297704790000011
进一步，获得该化合物的制备方法：将西印度醋栗干燥叶经乙醇渗漉提取，提取液减压 浓缩后得浸膏，浸膏经硅胶柱色谱分离，依次用石油醚:乙酸乙酯、乙酸乙酯、乙酸乙酯:乙 醇、乙醇、甲醇、水梯度洗脱，根据薄层色谱分析，合并得到3个组分A、B、C；C组分经硅胶 柱色谱分离，用石油醚:乙酸乙酯梯度洗脱，薄层色谱分析后合并得到18个组分C1～C18；C9 经Sephadex LH-20凝胶柱色谱甲醇:氯仿洗脱得到C9-1、C9-2、C9-3三个组分；C9-2经制备 液相色谱甲醇洗脱分离得到化合物Ⅰ。
更进一步，该化合物在制备降血糖药物中的用途。
有益效果
本发明首次公开了新化合物醋栗叶醇的结构及其制备方法，并且将其应用到降血糖药物的 领域。
附图说明
图1为本发明化合物样品对α-葡萄糖苷酶活性抑制曲线。
图2为阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性抑制曲线。
具体实施方法
一、提取分离
1.实验仪器
Agilent 1100系列LC-MS D Trap质谱仪；ULTRA SHIELD 400plus核磁共振仪(Bruker 公司)；APS10制备液相色谱仪(北京元宝山色谱科技有限公司)；Waters 2695高效液相色谱 仪；AQ-C18色谱柱(Welch公司，10×250mm,5μm；4.6×250mm,5μm)；SartoriusBT25S十 万分之一天平(北京塞托利斯有限公司)；Cmax Plus酶标仪(美国Thermo FisherScientific Oy 公司)；HH-4数显恒温搅拌水浴锅。
2.材料与试剂
柱色谱硅胶(青岛海洋化工厂)；薄层色谱HSGF254硅胶板(烟台江友硅胶开发有限公 司)；凝胶Sephadex LH-20(Pharmacia Biotech公司)；十二水合磷酸氢二钠(上海化学试剂 有限公司，批号：20040406)；磷酸二氢钾(南京化学试剂有限公司；批号：12040110502)； 无水碳酸钠(西陇科学股份有限公司；批号：1805241)；PNPG(上海源叶生物科技有限公司； 批号：K17A10B82914)；α-葡萄糖苷酶(上海源叶生物科技有限公司；批号：L12J10Y92782)； 阿卡波糖(德国拜耳公司)；纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；5ml、10ml、50ml容量 瓶；1.5mlEP管。色谱仪用化学试剂为色谱纯，其余为分析纯。
西印度醋栗叶采集于云南西双版纳，经江苏省中医药研究院钱士辉研究员鉴定为大戟科 叶下珠属植物西印度醋栗，凭证标本(JSTCMIBS-170503)存于江苏省中医药研究院。
3.提取与分离
西印度醋栗干燥叶15kg经95％乙醇渗漉提取3次，合并提取液，减压浓缩后得浸膏500 g。浸膏经20～60目硅胶柱色谱分离，依次用石油醚∶乙酸乙酯(2∶1)、乙酸乙酯、乙酸乙酯∶乙醇(1∶1)、乙醇、65％甲醇、水梯度洗脱，根据薄层色谱(TLC)分析，合并得到3 个组分A、B、C；C组分(20.4g)经200-300目硅胶柱色谱分离，用石油醚∶乙酸乙酯(100∶ 1～0∶1)梯度洗脱，TLC分析后合并得到18个组分C1～C18；C9(730mg)经Sephadex LH-20 凝胶柱色谱(甲醇∶氯仿/1∶1洗脱)得到C9-1、C9-2、C9-3三个组分；C9-2(63mg)经 制备液相色谱(90％甲醇洗脱)分离得到化合物Ⅰ(40mg)。
二、结构鉴定
化合物Ⅰ，白色粉末(甲醇)，HR-ESI-MS m/z：571.4534[M-H]-(计算值571.4532)，提 示分子式为C39H56O3，423.4002[M-H-cin]-为脱去1分子桂皮酸的三萜母核碎片离子。详见表 1，1H NMR(CDCl3,500MHz)谱图中低场区δ7.57(2H,m)、7.29～7.36(3H,m)、6,94(1H,d,J＝15.7Hz)和6.03(1H,d,J＝15.7Hz)为一组肉桂酰基信号；高场区δ0.80(3H,s)、0.86(3H,s)、 0.83(3H,s)、0.91(3H,s)、0.94(3H,s)、1.15(3H,s)和1.04(3H,s)为三萜苷元的角甲基信号； 4.75(1H,br.s)和4.69(1H,br.s)为一组端烯质子信号；4.70(1H,m)为连氧亚甲基质子信号。13C NMR(CDCl3,125MHz)谱图中显示39个信号，根据DEPT数据，其中包括7个CH3信号、 11个CH2信号、12个CH信号，9个季碳信号。通过HMBC谱中的C-H相关信号，可以确 认桂皮酰基[δ166.0(CO),120.9(CH),142.3(CH),135.3(C),129.6(CH),128.1(CH),128.8(CH),128.1(CH),129.6(CH)]取代，连氧亚甲基信号δ4.70(1H,m)与桂皮酰基中的羰基δ166.0 (CO)和δ50.7(C-5)相关，表明桂皮酰基取代位置在C-3位；端烯信号δ4.75(1H,br.s)、4.69(1H, br.s)[106.2(CH2)]与δ156.5(C-20)、34.1(C-19)和28.4(C-21)相关，提示环外双键位于E环 C-20位；连氧季碳信号δ75.3与δ1.75(16-H)、1.59(22-H)和1.15(28-H)相关，表明羟基取代 位于C-18位。NOESY谱中δ4.70(1H,m)与0.86(24-H)相关，表明C-3位氧取代为α-构型。 综上所述，推断化合物Ⅰ结构为3α-桂皮酰氧基乌索-20(29)-烯-18-醇，经相关数据库检索， 该化合物为首次发现并报道其相关结构数据，为其命名为醋栗叶醇，英文名：phyllanacidol。
化合物Ⅰ的结构式：
Figure BDA0002297704790000031
表1醋栗叶醇的C NMR，DEPT，H NMR，HMBC数据
Figure BDA0002297704790000032
Figure BDA0002297704790000041
三、体外α-葡萄糖苷酶活性抑制能力检测
化合物Ⅰ对α-葡萄糖苷酶活性抑制试验方法参考XU的方法，并稍作改动。
1.试药配制
PBS溶液：称取NaHPO4·12H2O 7.16g和KH2PO4 2.738g，分别用纯净水溶解定容至100ml，配制成0.2mol/l的母液，再按KH2PO4：NaHPO4·12H2O＝51：49的体积比配制成PH6.8的PBS溶液。
α-葡萄糖苷酶的配制：100Uα-葡萄糖苷酶，加入PBS溶液定容至100ml，-20℃冷冻保存。
PNPG底物溶液的配制：精密称取PNPG 37.66mg，加入PBS溶液，定容至25ml，得5mmol/l 的PNPG溶液,-4℃储存备用(PNPG分子量为301.25g/mol)。
Na2CO3溶液配制：称取NaCO3 1.06g，加入纯净水，定容至100ml，得0.1mol/l的NaCO3溶液(Na2CO3分子量为106g/mol)。
样品溶液配置：精密称取样品5mg，加DMSO至溶解，加入PBS定容至5ml。
取样品溶液(1mg/ml)用PBS溶液稀释至25，30，35，40，45μg/ml，备用。
2.α-葡萄糖苷酶活性抑制实验
取75μl酶液和25μl样品于1.5mlEP管中，37℃水浴5min，加入150μlPNPG溶液，将反应体系置于37℃水浴20min后，加入500μlNa2CO3溶液(0.1mol/l)终止反应，室温(25℃) 放置5min，采用酶标仪于405nm处测定吸光值A。同时设空白组、空白对照组、样品对照组。 阿卡波糖为阳性对照。根据上述反应程序及表2中不同组别的反应体系，分别加入相应试剂进行反应。每个样品设置3个重复，计算抑制率。
Figure BDA0002297704790000051
式中：A3为空白组吸光值；A0为空白背景组吸光值；A1为样品作用组吸光值；A2为样品背景组吸光值。
表2α-葡萄糖苷酶活性抑制实验
Figure BDA0002297704790000052
3.数据分析
采用prism 5.0c对数据进行分析，并采用“log(inhibitor)vs.normalizedresponse--Variable slope”计算各化合物对α-葡萄糖苷酶半数抑制浓度。
实验结果
(1)样品对α-葡萄糖苷酶活性抑制率
详见表3和图1(样品对α-葡萄糖苷酶活性抑制曲线)。
表3样品对α-葡萄糖苷酶活性抑制率(％)
Figure RE-GDA0002297817620000013
(2)阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性抑制率
详见表4和图2(阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性抑制曲线)
表4阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性抑制率
Figure RE-GDA0002297817620000014
通过对α-葡萄糖苷酶抑制活性实验评价了样品的体外降糖活性，样品和阳性对照阿卡波 糖的IC50分别为121.7ug/ml和163.5ug/ml，显示出化合物Ⅰ对α葡萄糖苷酶活性的抑制活性 高于阿卡波糖，具有一定的降糖活性。
总结
本发明通过对西印度醋栗叶的化学成分研究，采用硅胶、制备液相、凝胶SephadexLH-20 等多种色谱分离技术分离和纯化，利用核磁共振(NMR)及质谱等现代波谱学技术鉴定化合 物结构，分离得到一个新的三萜类化合物，鉴定为3α-桂皮酰氧基乌索-20(29)-烯-18-醇(1)。 新化合物中文名：醋栗叶醇；英文名：phyllanacidol。研究该化合物对α-葡萄糖苷酶活性的 抑制作用，其(IC50：121.7ug/ml)抑制作用高于阳性对照阿卡波糖(IC50：163.5ug/ml)， 具有一定的降糖活性。

Claims (3)

1.具有以下结构式Ⅰ所代表的化合物：
Figure FDA0003511062310000011
2.如权利要求1所述的化合物的制备方法：西印度醋栗干燥叶经乙醇渗漉提取，提取液减压浓缩后得浸膏，浸膏经硅胶柱色谱分离，依次用2：1的石油醚:乙酸乙酯、乙酸乙酯、1：1的乙酸乙酯:乙醇、乙醇、65％甲醇、水梯度洗脱，根据薄层色谱分析，合并得到3个组分A、B、C；C组分经硅胶柱色谱分离，用100：1～0：1的石油醚:乙酸乙酯梯度洗脱，薄层色谱分析后合并得到18个组分C1～C18；C9经Sephadex LH-20凝胶柱色谱1：1的甲醇:氯仿洗脱得到C9-1、C9-2、C9-3三个组分；C9-2经制备液相色谱90％甲醇洗脱分离得到化合物Ⅰ。
3.如权利要求1所述的化合物在制备降血糖药物中的用途。
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