CN116003238B

CN116003238B - 茉莉根中倍半萜类化合物及其提取方法和用途

Info

Publication number: CN116003238B
Application number: CN202310009752.3A
Authority: CN
Inventors: 雍建平; 卢灿忠; 奥拉特德·奥拉戈克·扎克斯
Original assignee: Xiamen Institute of Rare Earth Materials
Current assignee: Xiamen Institute of Rare Earth Materials
Priority date: 2023-01-04
Filing date: 2023-01-04
Publication date: 2024-03-12
Anticipated expiration: 2043-01-04
Also published as: CN116003238A

Abstract

本发明公开了倍半萜类化合物及其提取方法和用途。本发明所述的倍半萜类化合物选自式A、式B或式C所示的化合物。本发明还公开了所述倍半萜类化合物的分离方法及其在制备治疗癌症的药物中的用途。

Description

茉莉根中倍半萜类化合物及其提取方法和用途

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及茉莉根中倍半萜类化合物及其提取方法和用途。

背景技术

癌症已成为世界范围内最主要的致死性疾病，癌症可于任何年龄在各种器官及组织中发生。

通过对全球癌症患者新发病例和死亡数据比较，开发新的抗癌药物是亟待解决的难题。

然而，大部分癌症患者发觉病情时通常已是中期至晚期，临床治疗总体效果较差，尤其是多药耐药性的不断出现，使得癌症的治疗困难重重。虽然部分小分子抗癌化疗药、抗体药已经进入临床。然而大部分临床应用的抗癌的新药基本上都依赖进口，治疗费用高昂。我国自主研发的新抗癌药物相对甚少。因此，开发出活性高、副作用低的新型抗癌药物来满足临床的需求迫在眉睫。尤其是从传统中药中发现新的抗肿瘤候选化合物，是当今药物研发的主流。

茉莉根别名茉莉花根，系双子叶植物木犀科素馨属植物茉莉(Jasminum sambac(L.)Ait.)的干燥根。性温、味苦，有毒，原产于印度。据中国古书籍记载，茉莉根用于骨折、脱臼、接骨类有止痛作用及一定的麻醉作用。茉莉花根具有提高机体免疫力、清热解毒、消肿止痛的功效。对患有痢疾、腹痛、肠病、结膜炎的患者有良好的治疗效果。临床上常用于治疗骨折筋伤、龋齿、巅顶痛等多种病症。

本发明对福建省宁德生长的茉莉根进行了提取分离，以期从中发现具有抗肿瘤活性的新药候选化合物或先导化合物。

发明内容

本发明从茉莉根中分离获得了3个结构新颖的倍半萜类化合物，且该类化合物对肿瘤具有较强的抑制活性。

本发明提供一种倍半萜类化合物，所述倍半萜类化合物选自如下式A、式B、式C所示的化合物：

本发明还提供上述倍半萜类化合物的提取分离方法，包括以下步骤：

(1)将茉莉根粉碎，乙醇水溶液提取，提取液浓缩得到总浸膏；

(2)将步骤(1)所得的总浸膏用水分散，用不同极性的有机溶剂萃取，萃取液浓缩得到不同极性的浸膏；

(3)将步骤(2)中所得不同极性的浸膏进行色谱分离得到粗组分；和

(4)将步骤(3)中所得的粗组分进行分离纯化得到上述式A、式B、式C所示的倍半萜化合物。

根据本发明的实施方案，步骤(1)中的乙醇水溶液提取选自浸泡提取或回流提取。

根据本发明的实施方案，浸泡提取：浸泡温度为15-30℃，优选为室温；浸泡时间为20-40天，优选为25-35天，例如为28天，29天，30天，31天，32天；

和/或，回流提取：回流时间为10-24h，例如为12-15h。

根据本发明的实施方案，步骤(2)中不同极性的有机溶剂选自石油醚、乙酸乙酯、氯仿或正丁醇。

根据本发明的实施方案，步骤(3)中的色谱分离包括但不限于硅胶柱分离、制备型液相色谱分离以及它们的任意组合。

根据本发明的实施方案，步骤(4)中的分离纯化选自硅胶柱分离、凝胶柱分离、制备板分离或制备型液相色谱分离以及它们的任意组合。

根据本发明的实施方案，上述倍半萜类化合物的提取分离方法，包括以下步骤：

(1)将茉莉根粉碎，用乙醇水溶液浸泡，过滤浓缩得到总浸膏；

(2)将步骤(1)所得的总浸膏用水分散，依次用石油醚、乙酸乙酯和氯仿分别萃取3-5次，将不同极性的萃取液分别浓缩得到石油醚浸膏、乙酸乙酯浸膏和氯仿浸膏；

(3)将步骤(2)中所得的乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱分离，采用展开剂进行梯度洗脱，得到了不同极性的粗组分；

(4)通过HPLC分析步骤(3)中的不同极性的粗组分并进行合并，再通过硅胶柱分离、制备板分离或制备液相色谱分离纯化，得到上述式A、式B、式C所示的化合物。

根据本发明的实施方案，所述步骤(1)中，乙醇水溶液中乙醇的质量分数可以为50-80％，例如50％、60％、70％或80％。

根据本发明的实施方案，所述步骤(2)中，所述总浸膏与水的质量体积比(g/mL)为(0.2-3):1，例如(0.5-2):1，示例性为1:1。

根据本发明的实施方案，所述步骤(2)中，萃取使用的有机溶剂与水的体积比为1:(0.2-3)，例如1:(0.5-2)，示例性为1:2。

根据本发明的实施方案，步骤(3)中展开剂为石油醚和/或乙酸乙酯，从纯的石油醚开始，逐渐增加乙酸乙酯的量同时减少石油醚的量，最终变成纯的乙酸乙酯。优选地，石油醚和乙酸乙酯的体积比为1:0、0.9:0.1、0.8:0.2、0.7:0.3、0.6:0.4、0.5:0.5、0.4:0.6、0.3:0.7、0.2:0.8、0.1:0.9、0:1。

根据本发明的实施方案，所述步骤(4)中，所述HPLC分析条件如下：流动相：V_甲醇:V_{水(含0.3％磷酸)}＝7:3，柱温为室温，检测波长为200-400nm整合波长。

根据本发明的实施方案，步骤(4)中，所述分离纯化选取极性差值较大的组分进行(例如选取R_f差值为0.5-1的3-5个组分)。

根据本发明的实施方案，步骤(4)中，所述分离纯化可以重复进行。

本发明还提供上述倍半萜类化合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用。

根据本发明的实施方案，所述癌症选自肺癌、胃癌、乳腺癌或宫颈癌。

有益效果

本发明通过对植物提取液进行纯化(如柱分离、制备板分离、制备液相色谱分离等)，快速准确的获取高纯度的目标化合物(纯度可高达98％)，对含有复杂成分的植物提取液中具体化合物、尤其是手性对映体的快速分离和鉴定具有重要意义。

本发明从茉莉根中分离获得的3个新倍半萜类化合物对乳腺癌细胞株具有很强的抑制活性。

附图说明

图1为化合物A的HPLC色谱图；

图2为化合物B的HPLC色谱图；

图3为化合物C的HPLC色谱图；

图4为化合物A的HMBC相关图；

图5为化合物B的HMBC相关图；

图6为化合物C的HMBC相关图；

图7为化合物A的ROESY相关图；

图8为化合物B的ROESY相关图；

图9为化合物C的ROESY相关图。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

仪器与试剂：

茉莉根(2021年10月采自福建省宁德)，其它化学试剂均为国产化学纯试剂；CCK8(上海贝博生物科技有限公司)；DMEM高糖培养基(赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司)；EDTA(胰酶)(gibco)；Foetal Bovine Serum(Biological Industries)；磷酸缓冲盐溶液；96孔细胞培养板；多功能酶标仪。

实施例1：倍半萜类化合物A、B和C提取分离及结构鉴定

化合物A、B及C的提取分离按照如下过程进行：

(a)将20公斤干燥的茉莉根(2021年10月采自福建省宁德)粉碎，分别装入3个20L的塑料桶中，各加入15L 70％的乙醇/水溶液室温浸泡2个月，过滤浓缩即得浸膏。

(b)将步骤a所得的1公斤浸膏分散在2L水中，依次用石油醚、乙酸乙酯和氯仿分别萃取5次，每次石油醚、乙酸乙酯和氯仿用量为1000毫升。将不同极性的萃取液分别浓缩即得不同极性的浸膏。

(c)将步骤b中所得的乙酸乙酯浸膏进行第一次硅胶柱分离，采用V_石油醚/V_乙酸乙酯＝1:0至0:1进行梯度洗脱，收集V_石油醚/V_乙酸乙酯为2:1和1:1洗脱组份，得到了50个不同极性的部位(Fr₁-Fr₅₀)(I)。

(d)将步骤(c)中获得的50个组份首先通过初步的TLC检测，合并相似组份，获得了30个组份(II)。然后分别对组份(II)进行HPLC定性分析(色谱条件：V_甲醇:V_{水(含0.3％磷酸)}，7:3，柱温为室温，检测波长是200-400nm)，对相似组份进行合并。然后选取极性差值较大(核心物质保留时间差值大约为0.5-5分钟)的5个组份接着分别进行第一次硅胶柱分离，将得到的组分进行初步的TLC分析后，对近似组份进行合并，并选择极性差值较大(R_f差值大约为0.2-0.6)的组份进行第二次硅胶柱分离，然后将第二次柱分离后的组份进行制备板分离或制备高效液相色谱分离，将制备色谱分离获得的相同R_f值或相同保留时间的组份进行合并，即得三个倍半萜化合物A、B和C。

对分离得到的倍半萜化合物(A、B及C)，通过HPLC测定其纯度：A的纯度98.855％,Rt＝21.727min；B的纯度98.695％,Rt＝11.887；C的纯度97.185％，Rt＝12.987min，(色谱条件：色谱条件：C₁₈柱；流动相：V_甲醇:V_水，7:3；检测波长:254nm。化合物A的HPLC色谱图见附图1，B的HPLC色谱图见附图2，C的HPLC色谱图见附图3)。

通过1D NMR和2D NMR、高分辨质谱分析，确定了其结构，通过ROESY分析方法确定了其绝对构型。A的HMBC见附图4、B的HMBC见附图5、C的HMBC见附图6；A的ROESY见附图7、B的ROESY见附图8、C的ROESY见附图9。

倍半萜A的表征数据如下：黄色固体，HR-MS for“C₁₅H₂₄O₄+Na”:计算值：291.1567,实验值：291.1567；¹H NMR(400MHz,CD₃OD,ppm,J/Hz):0.69(3H,s,H-15),0.88(3H,d,J＝8.0Hz,H-14),1.29(1H,s,H-2α),1.33(3H,s,H-15),1.49(1H,m,H-2β),1.79(2H,m,H-11),2.01(2H,m,H-3),2.10(1H,m,H-4),2.66(1H,dd,J＝8.0,4.0Hz,H-10),3.55(1H,d,J＝11.8Hz,H-12α),3.72(1H,d,J＝11.8Hz,H-12β),4.15(1H,s,H-1),6.14(1H,s,H-8).¹³C NMR(100MHz):11.5(C-15),13.5(C-14),20.4(C-3),22.6(C-13),24.9(C-11),29.4(C-2),34.4(C-4),43.4(C-5),47.9(C-10),68.1(C-1),74.7(C-6),124.3(C-8),164.2(C-7),202.9(C-9)。

倍半萜B的表征数据如下：黄色固体，HR-MS for“C₁₅H₂₄O₃+Na”:计算值：275.1618,实验值：275.1618；¹H NMR(400MHz,CD₃OD,ppm,J/Hz)0.56(3H,s,H-15),0.79(3H,d,J＝6.7Hz,H-14),1.22(3H,s,H-13),1.23(2H,s,H-3),1.40(2H,m,H-11),1.69(2H,m,H-2),1.88(2H,m,H-1),2.27(1H,m,H-4),2.55(1H,d,J＝3.7Hz,H-10),3.48(2H,m,H-12),5.95(1H,s,H-8).13C NMR(100MHz):12.7(C-15),15.1(C-14),20.9(C-1),24.3(C-13),25.4(C-2),29.6(C-11),30.1(C-3),34.5(C-4),43.5(C-5),47.9(C-10),68.6(C-12),74.9(C-6),124.0(C-8),165.0(C-7),201.4(C-9)。

倍半萜C的表征数据如下：黄色固体，HR-MS for“C₁₅H₂₂O₃+Na”:计算值：273.1461，实验值：273.1461¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆，ppm,J/Hz):0.54(3H,s,H-15),0.84(2H,m,H-2),0.88(3H,d,J＝7.4Hz,H-14),1.22(3H,s,H-13),1.23(2H,s,H-11),1.83(2H,m,H-3),2.26(1H,m,H-4),3.49(2H,m,H-12),5.35(1H,dd,J＝10Hz,H-10),5.60(1H,m,H-1),6.00(1H,s,H-8).¹³C NMR(100MHz):13.5(C-15),14.3(C-14),22.9(C-3),24.2(C-13),29.3(C-11),29.6(C-2),33.4(C-4),40.6(C-5),68.5(C-12),74.8(C-6),123.9(C-8),124.1(C-1),132.7(C-10),165.8(C-7),201.2(C-9)。

实施例2：体外抗肿瘤活性测试

对化合物A、B和C进行了体外抗肿瘤活性测试，研究其对肺癌细胞株A549、宫颈癌细胞株Hela和乳腺癌细胞株MCF-7的抑制活性。具体的测试过程以化合物A对肺癌细胞株A549的抑制活性测试过程为例进行阐述：

1.测试样品浓度配制

称取化合物A10.0mg，加入5mL的塑料离心管中，用DMSO稀释至1mL。即得浓度为10.0mg/mL的初始浓度。然后将初始浓度用DMSO进行倍比稀释，依次获得5.0mg/mL,2.5mg/mL,1.25mg/mL,0.625mg/mL,0.3125mg/mL 5个不同的浓度梯度，置于4℃冰箱保存待用。

2.癌细胞株的培养及抑制活性测试

将肺腺癌细胞株(A549)置于37℃,饱和湿度，含有5％的CO₂培养箱中培养24小时，当细胞处于对数生长期时，吸弃上清培养液，并用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液消化后，使用高糖培养基终止消化。并将细胞接种于96孔板中，使得细胞密度为5000个/孔。将96孔板置于培养箱中培养24小时。随之吸弃96孔板中的细胞培养液。并向96孔板中补加100μL的高糖培养基，然后每孔加入不同浓度的测试样品1μL(每个浓度设置5个复孔)，接着置于37℃，饱和湿度，5％CO₂的培养箱中继续培养48h后，每个孔加入10μL CCK8，继续在37℃培养箱中孵育1-4h后。在多功能酶标仪上测定450nm波长下每孔的吸光度值。按照抑制率％＝[(对照细胞OD-加药细胞OD)/(对照细胞OD-空白OD)]×100。阴性对照为V_{高糖培养基}/V_DMSO＝10:1的混合溶液。

化合物A、B和C对宫颈癌细胞株Hela和乳腺癌细胞株MCF-7的培养以及抑制活性测试过程同上。

结果表明：化合物A、B和C对乳腺癌细胞株MCF-7具有很强的抑制活性，其IC₅₀值分别为:125.1、1781.0和40.28μg/mL。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种倍半萜类化合物，所述倍半萜类化合物选自如下式A、式B、式C所示的化合物：

2.权利要求1所述的倍半萜类化合物的提取分离方法，包括以下步骤：

(4)通过HPLC分析步骤(3)中的不同极性的粗组分并进行合并，再通过硅胶柱分离、制备板分离或制备液相色谱分离纯化，得到所述式A、式B、式C所示的化合物。

3.根据权利要求2所述的提取分离方法，其特征在于，

步骤(1)中，浸泡提取的温度为15-30℃。

4.根据权利要求3所述的提取分离方法，其特征在于，浸泡时间为20-40天。

5.根据权利要求2-4任一项中所述的提取分离方法，其特征在于，

所述步骤(1)中，乙醇水溶液中乙醇的质量分数可以为50-80％；

和/或，所述步骤(2)中，所述总浸膏与水的质量体积比为(0.2-3)g:1mL；

和/或，所述步骤(2)中，萃取使用的有机溶剂与水的体积比为1:(0.2-3)；

和/或，步骤(3)中展开剂为石油醚和/或乙酸乙酯，从纯的石油醚开始，逐渐增加乙酸乙酯的量同时减少石油醚的量，最终变成纯的乙酸乙酯；

和/或，所述步骤(4)中，所述HPLC分析条件如下：流动相：V_甲醇:V_{水(含0.3％磷酸)}＝7:3，柱温为室温，检测波长为200-400nm整合波长；

和/或，步骤(4)中，所述分离纯化选取极性差值较大的组分进行；

和/或，步骤(4)中，所述分离纯化可以重复进行。

6.根据权利要求5所述的提取分离方法，其特征在于，

所述步骤(1)中，乙醇水溶液中乙醇的质量分数为50％、60％、70％或80％；

和/或，所述步骤(2)中，所述总浸膏与水的质量体积比(0.5-2)g:1mL；

和/或，所述步骤(2)中，萃取使用的有机溶剂与水的体积比为1:(0.5-2)；

和/或，步骤(3)中展开剂为石油醚和/或乙酸乙酯，石油醚和乙酸乙酯的体积比为1:0、0.9:0.1、0.8:0.2、0.7:0.3、0.6:0.4、0.5:0.5、0.4:0.6、0.3:0.7、0.2:0.8、0.1:0.9、0:1；

和/或，步骤(4)中，所述分离纯化选取R_f差值为0.5-1的3-5个组分进行。

7.权利要求1所述的倍半萜类化合物在制备治疗和/或预防癌症的药物中的应用，所述癌症为乳腺癌。