CN112300239B

CN112300239B - 竹柏叶中甾体类化合物及其提取方法和用途

Info

Publication number: CN112300239B
Application number: CN202011086140.7A
Authority: CN
Inventors: 雍建平; 卢灿忠; 杨洋
Original assignee: Xiamen Institute of Rare Earth Materials
Current assignee: Xiamen Institute of Rare Earth Materials
Priority date: 2020-10-12
Filing date: 2020-10-12
Publication date: 2021-07-23
Anticipated expiration: 2040-10-12
Also published as: CN112300239A

Abstract

本发明提供了一种竹柏叶中提取分离化合物A和B的方法，通过对竹柏叶的提取液进行初步纯化(如柱分离、制备板分离等)后，然后重结晶，并通过挑选不同的晶体得到高纯度的A和B化合物。通过该方法成功从竹柏叶中分离获得了2个甾体类化合物，这两种化合物对多种癌细胞(如胃癌细胞株、大肠癌细胞株和乳腺癌细胞株)均具有很强的抑制活性。此外本发明提供的提纯化合物的方法能够快速准确的获取高纯度的目标化合物，对含有复杂成分的植物提取液中具体化合物的快速分离和鉴定具有重要意义。

Description

竹柏叶中甾体类化合物及其提取方法和用途

技术领域

本发明属于医药技术领域。具体涉及从竹柏叶中分离获得的甾体类化合物及其提取方法和在治疗肿瘤/癌症方面的用途。

背景技术

癌症已成为世界范围内最重要的致死性疾病之一。癌症可于任何年龄在各种器官及组织中发生，导致死亡的主要癌症种类有：肺癌、胃癌、肝癌、结肠癌和乳腺癌等。虽然部分小分子抗癌药物已用于临床，部分化合物正在进行临床前的研究。然而大部分癌症患者发觉病情时已是中期至晚期，临床治疗总体效果较差，尤其是多药耐药性癌细胞的不断出现，使得癌症的治疗困难重重。因此，开发出活性高、副作用低的新型抗癌药物来满足临床的需求迫在眉睫。

中药在我国用药历史悠久，毒副作用相对较低。从中药中发现新的候选药物或先导药物是当今药物研发的主流，尤其是对民族中药的深入开发。

竹柏(Podocarpus nagi)，罗汉松科(Podocarpaceae)罗汉松属(Podocarpus)植物，在民间则有山杉、糖鸡子、罗汉柴、铁甲树、椰树等别名。主要分布于长江以南地带，如福建、江西、浙江、湖南、广西、广东等地。据报道，竹柏叶片和树皮可散发类似丁香的气味，具有驱蚊虫功效；在瑶族民间，竹柏作为习用中草药，具有止血、接骨、消肿作用；也可治外伤、出血、骨折、狐臭、眼疾、感冒等；竹柏鲜树皮或根的水煎剂可用于治风湿性关节炎([1]国家中医药管理局《中华本草》编委会，中华本草[M]，第2册第4卷，上海科学技术出版社，1999.0813-0817；[2]戴斌，中国现代瑶药[M]，广西科学技术出版社，2009:257-259.16-18])。文献也报道了竹柏果皮和果壳中挥发油成分具有抗肿瘤活性(廖泽勇，韦玮，竹柏果皮和果壳中挥发油成分及其抗肿瘤活性研究[J].医药导报，2015,34(5):609-612)。

为了深入研究该民族中药，我们对生长在福建省的竹柏叶进行了提取分离。以期从中发现新的候选药物或先导药物。

发明内容

本发明的目的是针对临床上应用的抗肿瘤/癌症药物具有毒、副作用大的现状，提供了从瑶族习用药材竹柏叶中分离获得的新甾体类化合物(A和B)及该化合物在治疗肿瘤/癌症方面的用途。

本发明提供了一种A和B所示的甾体化合物：

本发明还提供所述A和B化合物的提取分离方法，包括以下步骤：

(1)将竹柏叶粉碎，用酒精水溶液浸泡，过滤浓缩得到浸膏；

(2)将步骤(1)所得的浸膏用水分散，依次分别用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇萃取3-5次，将不同极性的萃取液分别浓缩即得不同极性的浸膏；

(3)将步骤(2)中所得的乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱分离，采用展开剂进行梯度洗脱，得到了不同极性的组分；

(4)通过HPLC分析不同极性的组分，再通过柱分离、重结晶，得到所述甾体类化合物A和B。

根据本发明的实施方案，所述步骤(1)中，酒精水溶液中酒精的质量分数可以为50-80％，例如50％，60％，70％，80％；浸泡温度为15-30摄氏度，优选为室温；浸泡时间为20-40天，优选为25-35天，例如为28天，29天，30天，31天，32天；

根据本发明的实施方案，所述步骤(2)中，所述浸膏与水的质量体积比(g/mL)为(0.2-3):1，例如(0.5-2):1，示例性为1:1；

根据本发明的实施方案，所述步骤(2)中，每次萃取使用的溶剂与水的体积比为1:(0.2-3)，例如1:(0.5-2)，示例性为1:2；

根据本发明的实施方案，所述步骤(4)中，所述HPLC分析条件优选为V甲醇：V水＝7：3，柱温为室温，检测波长是200-400nm整合波长；所述柱分离选取极性差值较大的组分进行(例如选取极性差值较大的3-5个组分)；所述柱分离可以重复进行一次。

根据本发明的实施方案，步骤(3)中展开剂为石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂，石油醚与乙酸乙酯的体积比为1:0-0:1。

根据本发明的实施方案，步骤(4)所述重结晶的溶剂为乙酸乙酯和正己烷的混合溶剂，乙酸乙酯和正己烷体积比为1-3:1，例如2:1；

根据本发明的实施方案，步骤(4)中，可以在显微镜下分离不同的晶体，得到所述甾体类化合物A和B；步骤(4)所述不同的晶体是指晶体的外观不同，所述外观包括形状、色彩；所述形状可以为针状、片状、块状。

所述显微镜下的分离步骤为，根据晶体外观状态不同，用挑晶体的针，将不同晶形的晶体挑选出来。

本发明还提供一种通过在显微镜下分离A和B所示的甾体化合物的晶体以提纯化合物的方法。

根据本发明的实施方案，所述不同的晶体是指晶体的外观不同，所述外观包括形状、色彩。

本发明还提供所述甾体化合物A和/或B在制备治疗癌症的药物中的应用。

根据本发明的实施方案，所述癌症为大肠癌、胃癌、乳腺癌。

本发明采用CCK8方法对优选的新甾体化合物A进行了体外抗肿瘤测试，主要研究了该单体化合物对胃癌细胞株、大肠癌细胞株、乳腺癌细胞株(MCF-7)抑制活性。结果表明其对上述肿瘤细胞株均具有很强的抑制活性。在5mg/mL浓度下，对胃癌细胞株、乳腺癌细胞株(MCF-7)和大肠癌细胞株的抑制率分别为：89.16％、97.02％和53.33％。

有益效果

本发明从竹柏叶中分离获得的2个甾体类化合物对多种癌细胞(如胃癌细胞株、大肠癌细胞株和乳腺癌细胞株)均具有很强的抑制活性。

本发明的提取方法通过对植物提取液进行初步纯化(如柱分离、制备板分离等)后，然后重结晶，并快速准确的获取高纯度的目标化合物(纯度可高达98％)，对含有复杂成分的植物提取液中具体化合物的快速分离和鉴定具有重要意义。

申请人惊奇的发现，通过本发明的方法，可以得到待分离化合物的不同晶体形态，从而易于进一步分离，尤其是可以通过显微镜实现分离。

附图说明

图1为化合物A的球棍模型图；

图2为化合物B的球棍模型图；

图3为混合物在显微镜下的晶体外观图，图中1表示的是化合物A，2表示的是化合物B，3表示的是谷甾醇；

图4为挑选出纯化合物A在显微镜下的晶体外观图；

图5为挑选出纯化合物B在显微镜下的晶体外观图；

图6为挑出谷甾醇纯化合物在显微镜下的晶体外观图。

具体实施方式

下文将结合具体实施例对本发明的技术方案做更进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。

除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。

仪器与试剂：

竹柏叶(2018年采自福建省洋里乡绅带村)，其它化学试剂均为国产化学纯试剂；CCK8(上海贝博生物科技有限公司)；DMEM高糖培养基(赛默飞世尔(苏州)仪器有限公司)；EDTA(胰酶)(gibco)；Foetal Bovine Serum(Biological Industries)；磷酸缓冲盐溶液；96孔细胞培养板；多功能酶标仪。

实施例1：化合物A和B的提取分离及结构鉴定

化合物A和B的提取分离按照如下过程进行：

(A)将20公斤干燥的竹柏叶(采自福建省洋里乡绅带村)粉碎，分别装入2个20L的塑料桶中，加入10L 70％的酒精/水溶液室温浸泡1个月，过滤浓缩即得浸膏。两桶药材分别重复上述浸泡、过滤、浓缩提取3次，将获得的浸膏合并。

(B)将步骤A所得的1公斤浸膏分散在1000mL水中，依次用石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇萃取5次，每次石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇用量500毫升。将不同极性的萃取液分别浓缩即得不同极性的浸膏。

(C)将B步骤中所得的乙酸乙酯浸膏进行硅胶柱分离，采用V_石油醚/V_乙酸乙酯：1:0至0:1进行梯度洗脱，得到了80个不同极性的部位(Fr₁-Fr₈₀)。

(D)通过HPLC(V甲醇：V水＝7：3，柱温为室温，检测波长是200-400nm)分析不同极性的组分，选取极性差值较大的5个组分进行一次柱分离，将得到的组分进行TLC分析后，选择极性差值较大的组分进行二次柱分离，然后将二次柱分离后的组分进行重结晶(V乙酸乙酯：V正己烷＝2：1)，在显微镜下挑选出片状和针状的晶体获得了两个新甾体类化合物A(如图3中1)和化合物B(如图3中2)。该化合物通过HPLC进行了纯度检测，其纯度都达到了98％。

发明人发现，仅通过柱分离，制备板分离只能获得化合物的混合物(经TLC检测是一个点，但HNMR分析为混合物)，而惊奇地发现，化合物在乙酸乙酯和正己烷混合溶剂中很容易形成晶体，且三种晶体(化合物A、B和谷甾醇)外观状态不同，因此可以采取在显微镜下挑选不同晶体形式，实现化合物A和B的分离。

对分离得到的新甾体化合物(A和B)进行了NMR和高分辨质谱分析，确定了其结构。通过XRD分析确定其及绝对构型。

A:无色片状晶体，m.p.:127-128℃.单斜晶系,空间群为P21；晶胞参数为：a＝9.63,b＝7.50,

α＝90°,β＝94.25°,γ＝90°,

Z＝2,d＝0.882g/cm³。(晶体结构见附图1).

B:无色片状晶体，m.p.:253-256℃；单斜晶系,空间群为P21；晶胞参数为：a＝10.8482(4),b＝7.3671(3),

α＝90°,β＝93.103(4)°,γ＝90°,

Z＝75,d＝1.1144g/cm³.(晶体结构见附图2).

实施例2：体外抗肿瘤活性测试

优选了化合物A进行了体外抗肿瘤活性测试，主要研究了其对大肠癌细胞株和乳腺癌细胞株MCF-7的抑制活性。具体的测试过程以乳腺癌MCF-7细胞株的测试过程为例进行阐述：

1.测试样品浓度配制

称取化合物A10mg，加入5mL的塑料离心管中，用DMSO稀释至2mL。

即得浓度为5mg/mL的初始浓度。然后将初始浓度用DMSO进行倍比稀释，依次获得5mg/mL,2.5mg/mL,1.25mg/mL,0.625mg/mL,0.3125mg/mL,0.15625mg/mL 6个不同的浓度梯度，置于4℃冰箱保存待用。

2.乳腺癌细胞株(MCF-7)的培养及抑制活性测试

将乳腺癌细胞株MCF-7置于37℃,饱和湿度，含有5％的CO₂培养箱中培养24小时，当细胞处于对数生长期时，吸弃上清培养液，并用0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液消化后，使用高糖培养基终止消化。并将细胞接种于96孔板中，使得细胞密度为5000个/孔。将96孔板置于培养箱中培养24小时。随之吸弃96孔板中的细胞培养液。并向96孔板中补加100μL的高糖培养基，然后每孔加入不同浓度的测试样品1μL(每个浓度设置5个复孔)，接着置于37℃，饱和湿度，5％CO₂的培养箱中继续培养48h后，每个孔加入10μL CCK8，继续在37℃培养箱中孵育1-4h后。在多功能酶标仪上测定450nm波长下每孔的吸光度值。按照抑制率％＝[(对照细胞OD-加药细胞OD)/(对照细胞OD-空白OD)]×100。阴性对照为V_{高糖培养基}/V_DMSO:10:1的混合溶液。

化合物A对胃癌细胞株、大肠癌细胞株的测试过程同上。其化合物A对胃癌细胞株、大肠癌细胞株和乳腺癌细胞株的抑制率如表1。

以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种A和B所示化合物的提取分离方法，包括以下步骤：

(1)将竹柏叶粉碎，用酒精水溶液浸泡，过滤浓缩得到浸膏；

(4)通过HPLC分析不同极性的组分，再通过柱分离、重结晶，在显微镜下分离不同的晶体得到所述甾体类化合物A和B；

步骤(3)中展开剂为石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂，石油醚与乙酸乙酯的体积比为1:0-0:1；

步骤(4)所述重结晶的溶剂为乙酸乙酯和正己烷的混合溶剂，乙酸乙酯和正己烷体积比为1-3:1。

2.根据权利要求1所述的提取分离方法，其特征在于，步骤(1)中酒精水溶液中酒精的质量分数为50-80％。

3.根据权利要求1或2所述的提取分离方法，其特征在于，步骤(1)中所述浸泡温度为15-30摄氏度；浸泡时间为20-40天。

4.根据权利要求1或2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述浸膏与水的质量体积比为(0.2-3):1g/mL。

5.根据权利要求1或2所述的提取分离方法，其特征在于，所述步骤(2)中，每次萃取使用的溶剂与水的体积比为1:(0.2-3)。

6.根据权利要求1或2所述的提取分离方法，其特征在于，步骤(1)中所述浸泡温度为室温；浸泡时间为25-35天；

步骤(2)中，所述浸膏与水的质量体积比为(0.5-2):1g/mL；

步骤(2)中，每次萃取使用的溶剂与水的体积比为1:(0.5-2)。

7.根据权利要求1或2所述的提取分离方法，其特征在于，步骤(4)中在显微镜下分离不同的晶体，得到所述甾体类化合物A和B；

步骤(4)所述不同的晶体是指晶体的外观不同，所述外观包括形状、色彩；所述形状为针状、片状、块状。

8.根据权利要求1或2所述的提取分离方法，其特征在于，步骤(4)中所述显微镜下的分离步骤为，根据晶体外观状态不同，用挑晶体的针，将不同晶形的晶体挑选出来。