CN117186166B - 芳香性甾体类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及药物技术领域，公开了一种芳香性甾体类化合物及其制备方法和应用。所述芳香性甾体类化合物为化合物1至化合物10中的任一种，化合物1至化合物10的结构如下所示；该芳香性甾体类化合物是从真菌醒目曲霉的代谢产物中提取得到，并且经过研究发现本发明所述的芳香性甾体类化合物1至化合物10均具有一定的神经保护活性。
Description
技术领域
本发明涉及药物技术领域，具体涉及一种芳香性甾体类化合物及其制备方法和应用。
背景技术
甾体是一类结构特殊的天然产物，含有环戊烷骈多氢菲碳骨架，此骨架又称甾核。甾体类化合物用于疾病的治疗具有悠久的历史，据记载早在1775年，英国医生就发现干燥的洋地黄叶对风湿浮肿有非常好的效果，后来发现是对弱化的心脏有强心作用，洋地黄叶中主要成分包括地高辛(digoxin)和洋地黄毒苷(digitoxin)等强心苷类甾体成分。德国药剂师在1875年分离得到了洋地黄毒苷的纯品，后来法国一名药剂师将洋地黄毒苷用于临床。如今许多甾体类化合物应用于人类临床，一些植物甾醇还能预防结肠癌。
芳香类固醇是类固醇骨架中含有至少一个或多个芳香环的类固醇的一个亚类。甾体芳构化可能发生在A、B、C或D环，迄今发现的芳香化甾醇主要为A环芳香性甾体(220多个)，只有少数呈现B环芳香化(约20个)，且这些芳香性甾体多来自于石油，海绵以及曲霉属真菌。经文献调研，这些甾体化合物被发现具有调节肝脏X受体活性、抗菌、抗真菌和抗HIV活性等生物活性，因此，从曲霉中发现更多新的甾体衍生物作为人类疾病治疗药物的先导化合物，意义重大。
研究表明，脑部疾病的发生、发展过程中，均伴随着不同程度的神经细胞损伤，在缺血性脑中风发生时，血流减少导致正常细胞的功能改变，大脑组织对局部缺血非常敏感，即使神经元的短时间缺血也会引发一系列的事件，最终导致神经细胞的死亡。因此，当前对脑病疾病的治疗中神经保护制剂作为一种重要的治疗药物在一线临床广泛使用。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的具有神经保护活性药物种类较少以及活性需要进一步提升等问题，提供一种芳香性甾体类化合物及其制备方法和应用，该芳香性甾体类化合物是从真菌醒目曲霉的代谢产物中提取得到，并且经过研究发现本发明所述的芳香性甾体类化合物具有较好的神经保护活性。
为了实现上述目的，本发明一方面提供一种芳香性甾体类化合物，所述芳香性甾体类化合物为化合物1至化合物10中的任一种，化合物1至化合物10的结构如下所示；
本发明第二方面提供一种所述的芳香性甾体类化合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将醒目曲霉的菌丝接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，接着进行恒温培养；
(2)将步骤(1)得到的含菌丝的培养基切块后接种于大米培养基中，进行发酵培养；
(3)将步骤(2)得到的发酵产物采用乙醇减压提取，得到总浸膏；
(4)将所述总浸膏采用乙酸乙酯和水的混合溶液进行萃取，得到乙酸乙酯提取物；
(5)将所述乙酸乙酯提取物进行正相硅胶柱层析，得到8个组分Fr.1至Fr.8；
(6)将组分Fr.3经过反相ODS柱层析，得到8个组分Fr.3.1至Fr.3.8；
(7)将组分Fr.3.4经过凝胶柱层析，接着通过正相柱层析得到9个组分Fr.3.4.1至Fr.3.4.9；
(8)将组分Fr.3.4.4通过半制备高效液相色谱分离，得到化合物1、化合物2和化合物3；
(9)将组分Fr.3.4.5经过凝胶柱层析分离得到化合物4；
(10)将组分Fr.3.4.6经过凝胶柱层析，接着通过半制备高效液相色谱分离得到化合物5；
(11)将组分Fr.3.4.7通过半制备高效液相色谱纯化得到化合物6和化合物7；
(12)将组分Fr.3.4.9通过半制备高效液相色谱纯化得到化合物8和化合物9；
(13)将组分Fr.3.4.2经过硅胶柱层析，接着通过半制备高效液相色谱分离，得到化合物10。
优选地，在步骤(1)中，所述恒温培养的条件包括：温度为25-30℃，时间为4-6天。
优选地，在步骤(2)中，所述恒温培养的条件包括：温度为25-30℃，时间为175-185天。
优选地，所述步骤(5)的过程包括：将所述乙酸乙酯提取物进行正相柱层析，接着采用体积比为30:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液进行梯度洗脱，然后再采用体积比为100:1-0:1的乙酸乙酯-甲醇混合溶液进行梯度洗脱，得到8个组分Fr.1至Fr.8。
优选地，在步骤(6)中，所述反相ODS柱层析的洗脱液为体积比为50:50-100:0甲醇-水混合溶液。
优选地，在步骤(7)中，所述凝胶柱层析的洗脱液为甲醇；
优选地，所述正相柱层析的洗脱液为体积比为15:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液。
优选地，在步骤(10)中，所述凝胶柱层析的洗脱液为体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液；
优选地，在步骤(10)中，所述半制备高效液相色谱的流动相为体积比为85:15的乙腈和水的混合溶液。
优选地，在步骤(13)中，所述硅胶柱层析的洗脱液为体积比为3:1-0:1的石油醚-二氯甲烷混合溶液。
优选地，在步骤(13)中，所述半制备高效液相色谱的流动相为体积比为75:25的甲醇和水的混合溶液。
本发明第三方面提供一种所述的芳香性甾体类化合物或其药学上可接受的盐在制备用于神经保护的药物中的应用。
在本发明中，通过对真菌醒目曲霉的发酵产物进行分离纯化得到了10个芳香性甾体类化合物(化合物1至化合物10)。另外通过质谱、核磁等光谱分析技术，以及圆二色谱计算、X射线单晶衍射等实验方法确定了本发明中所述的化合物1至化合物10的具体结构。本发明所述的芳香性甾体类化合物1至化合物10具有较好的神经保护活性，可以很好的应用于制备神经保护的药物。
附图说明
图1是本发明所述的化合物1的晶体结构；
图2是本发明所述的化合物6的晶体结构；
图3是本发明所述的化合物1至化合物10对谷氨酸钠处理SH-SY5Y细胞活力的保护作用；
图4是本发明所述的化合物8对谷氨酸钠处理SH-SY5Y细胞活力的保护作用；
图5是本发明所述的化合物8对谷氨酸钠处理后的SH-SY5Y细胞形态图以及经JC-1染色后的SH-SY5Y细胞中线粒体膜电位变化图；
图6是本发明所述的化合物8对谷氨酸钠处理后的SH-SY5Y细胞经JC-1染色后采用流式细胞仪处理后的结果。
具体实施方式
以下结合附图对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
本发明提供一种芳香性甾体类化合物，所述芳香性甾体类化合物为化合物1至化合物10中的任一种，化合物1至化合物10的结构如下所示；
在本发明中，所述化合物1的英文名为Spectasterol F；所述化合物2的英文名为Spectasterol G；所述化合物3的英文名为Spectasterol H；所述化合物4的英文名为Spectasterol I；所述化合物5的英文名为Spectasterol J；所述化合物6的英文名为Spectasterol K；所述化合物7的英文名为Spectasterol L；所述化合物8的英文名为Spectasterol M；所述化合物9的英文名为SpectasterolN；所述化合物10的英文名为Spectasterol O。
在本发明中进一步提供一种所述的芳香性甾体类化合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)将醒目曲霉的菌丝接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，接种进行恒温培养；
(2)将步骤(1)得到的含菌丝的培养基切块后接种于大米培养基中，进行发酵培养；
(3)将步骤(2)得到的发酵产物采用乙醇减压提取，得到总浸膏；
(4)将所述总浸膏采用乙酸乙酯和水的混合溶液进行萃取，得到乙酸乙酯提取物；
(5)将所述乙酸乙酯提取物进行正相硅胶柱层析，得到8个组分Fr.1至Fr.8；
(6)将组分Fr.3经过反相ODS柱层析，得到8个组分Fr.3.1至Fr.3.8；
(7)将组分Fr.3.4经过凝胶柱层析，接着通过正相柱层析得到9个组分Fr.3.4.1至Fr.3.4.9；
(8)将组分Fr.3.4.4通过半制备高效液相色谱分离，得到化合物1、化合物2和化合物3；
(9)将组分Fr.3.4.5经过凝胶柱层析分离得到化合物4；
(10)将组分Fr.3.4.6经过凝胶柱层析，接着通过半制备高效液相色谱分离得到化合物5；
(11)将组分Fr.3.4.7通过半制备高效液相色谱纯化得到化合物6和化合物7；
(12)将组分Fr.3.4.9通过半制备高效液相色谱纯化得到化合物8和化合物9；
(13)将组分Fr.3.4.2经过硅胶柱层析，接着通过半制备高效液相色谱分离，得到化合物10。
在优选的实施方式中，所采用的醒目曲霉菌种是从中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)菌种库中购买得到，购买序号为CGMCC 3.4339。所述醒目曲霉保存于华中科技大学药学院414，编号为414JZ-4。
在本发明中，所述芳香性甾体类化合物是从醒目曲霉的代谢产物中提取得到。
在优选的实施方式中，在步骤(1)中，所述恒温培养的条件包括：温度为25-30℃，优选为28℃，时间为4-6天。具体地，所述恒温培养的温度可以为26℃、28℃或30℃；所述恒温培养的时间可以为4天、5天或6天。
在具体的实施方式中，步骤(1)的具体过程包括：将菌种醒目曲霉进行复活，接着将醒目曲霉的菌丝接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，接着进行恒温培养，在连续拷贝三代后对菌种进行鉴定，用ITS基因测序鉴定无误后将醒目曲霉菌株大量拷贝，继续进行恒温培养。具体地，两次恒温培养的条件保持一致。
在具体的实施方式中，所述大米培养基的制备方法为：将大米和水混合后，接着置于高压灭菌锅中进行灭菌处理得到大米培养基。
在优选的实施方式中，所述大米培养基中大米和水的固液比为200-250g:250mL。具体地，所述大米培养基中大米和水的固液比可以为200g:250mL、230g:250mL或250g:250mL。
在优选的实施方式中，高压灭菌锅中进行灭菌处理的时间为30min。
在优选的实施方式中，在步骤(2)中，所述发酵培养的条件包括：温度为25-30℃，时间为175-185天。具体地、所述发酵培养的温度为26℃、28℃或30℃；所述发酵培养的时间可以为175天、180天或185天。
在优选的实施方式中，在步骤(3)中，所述乙醇提取的次数为9-12次。具体地，所述乙醇提取的次数可以为9次、10次、11次或12次。
在具体的实施方式中，在步骤(3)中，采用无水乙醇进行提取。
在优选的实施方式中，在步骤(4)中，在所述混合溶液中，乙酸乙酯和水的体积比为1:1-2:1。具体地，乙酸乙酯和水的体积比可以为1:1、1.5:1或2:1。
在优选的实施方式中，在步骤(4)中，采用乙酸乙酯和水的混合溶液进行萃取的次数为8-10次。
在优选的实施方式中，所述步骤(5)的过程包括：将所述乙酸乙酯提取物进行正相硅胶柱层析，接着采用体积比为30:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液进行梯度洗脱，然后再采用体积比为100:1-0:1的乙酸乙酯-甲醇混合溶液进行梯度洗脱，得到8个组分Fr.1至Fr.8。
在优选的实施方式中，收集体积比为30:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱液得到组分Fr.1；收集体积比为15:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱液得到组分Fr.2；收集体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱液得到组分Fr.3和Fr.4；收集体积比为10:1-5:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱液得到组分Fr.5；收集体积比为5:1-3:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱液得到组分Fr.6；收集体积比为1：1的石油醚-乙酸乙酯洗脱液以及乙酸乙酯-甲醇体积比为100：1的洗脱液，合并后得到组分Fr.7；收集体积比为100:1-5:1的乙酸乙酯-甲醇洗脱液得到组分Fr.8。
在具体的实施方式中，在步骤(5)中，将所述乙酸乙酯提取物进行正相硅胶柱层析的过程包括：将所述乙酸乙酯提取物与粒径为100-200目正相硅胶混合，进行拌样，接着采用粒径为80-100目正相硅胶填柱，然后进行正相硅胶柱层析。
在优选的实施方式中，在步骤(6)中，所述反相ODS柱层析的洗脱液为体积比为50:50-100:0甲醇-水混合溶液进行梯度洗脱。
在优选的实施方式中，在步骤(7)中，所述凝胶柱层析的洗脱液为甲醇；所述正相柱层析的洗脱液为体积比为15:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液。
在优选的实施方式中，在步骤(8)中，所述半制备高效液相色谱的流动相为体积比为92:8的甲醇和水的混合溶液。
在优选的实施方式中，在步骤(8)中，可以重复多次进行半制备高效液相色谱纯化使分离效果更好。
在优选的实施方式中，在步骤(9)中，所述凝胶柱层析的洗脱液为体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液。
在优选的实施方式中，在步骤(10)中，所述凝胶柱层析的洗脱液为体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液；
在优选的实施方式中，在步骤(10)中，所述半制备高效液相色谱的流动相为体积比为85:15的乙腈和水的混合溶液。
在优选的实施方式中，在步骤(11)中，所述半制备高效液相色谱的流动相为体积比为82:18的乙腈和水的混合溶液。
在优选的实施方式中，在步骤(12)中，所述半制备高效液相色谱的流动相为体积比为80:20的乙腈和水的混合溶液。
在优选的实施方式中，在步骤(13)中，所述硅胶柱层析的洗脱液为体积比为3:1-0:1的石油醚-二氯甲烷混合溶液。
在优选的实施方式中，在步骤(13)中，所述半制备高效液相色谱的流动相为体积比为75:25的甲醇和水的混合溶液。
本发明还可以提供一种所述的芳香性甾体类化合物或其药学上可接受的盐在制备用于神经保护的药物中的应用。
在本发明中，所述用于神经保护的药物可以为治疗焦虑症药物、治疗老年痴呆的药物或治疗抑郁症的药物。
本发明所述的芳香性甾体类化合物1至化合物10均具有较好的神经保护活性，其中化合物8的神经保护活性最优。本发明所述的化合物1至化合物10均可以用于制备神经保护的药物。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述，但本发明的保护范围并不局限于此。
以下实施例中所使用的菌种醒目曲霉购买于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)菌种库，购买序号为CGMCC 3.4339。所述醒目曲霉保存于华中科技大学药学院414，编号为414JZ-4。购买后经ITS基因测序鉴定为醒目曲霉(Aspergillus spectabilis)。所述菌种ITS序列号为：
AGATCCTACCTGATCCGAGGTCACCTGAAAAAAAAATTGGTTGACGGCTGGCGCCGGCCGGGCCCTATTCGAGCGGGTGACAAAGCCCCATACGCTCGAGGACCGGACGGTACCGCCGCTGCCTTTCGGGCCCGTCTCCCGGAAGAGACGAGGACCCAACACACAAGCCGCGCTTGATGGGCAGTAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCCCCGGAATGCCAGGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCGCATTACTTATCGCAGTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCGGAACCAAGAGATCCATTGTTGAAAGTTTTAATTAATTTTGCTTATTCAAGCTCAGAGATCATGCTTAAACAAAGAAGTTCAGTGGTCTCCGGCGGTCGCTCCCAGGGGAGGCTTCCGCCGAAGCAACAGTGTTTGGTAGTCACGGGTGGGAGGTTGGGCGCCCGGAGGCAGCCCGCACTCAGTAATGATCCTTCCGCAGT。
实施例1
(1)在无菌操作台中对菌种醒目曲霉进行复活，用接种环将醒目曲霉的菌丝接种于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基上，在温度为28℃的恒温箱中恒温培养5天。连续拷贝三代后对菌种进行鉴定，用ITS基因测序鉴定无误后，对醒目曲霉菌株大量拷贝，继续在28℃下恒温培养5天；
(2)将250g大米和200mL水混合后倒入1000mL的锥形瓶中，共准备800个锥形瓶，然后将锥形瓶置于高压灭菌锅中灭菌30min得到大米培养基。然后将大量拷贝后长满菌丝的马铃薯葡萄糖琼脂培养基切成正方形小块，均匀接种于放凉的大米培养基中，总发酵量为200kg(以大米重量计算)，在28℃的恒温条件下发酵培养180天；
(3)将步骤(2)得到的发酵产物经无水乙醇减压提取9次得到黑色的总浸膏；
(4)将得到的总浸膏用体积比为乙酸乙酯和水的混合溶液进行萃取，得到2000g的乙酸乙酯提取物；
(5)将得到的乙酸乙酯提取物与100-200目正相硅胶混合，进行拌样，采取80-100目正相硅胶填柱进行正相硅胶柱层析，以体积比为30:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液进行梯度洗脱，然后再采用体积比为100:1-0:1的乙酸乙酯-甲醇混合溶液进行梯度洗脱；收集体积比为30:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱液得到组分Fr.1；收集体积比为15:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱液得到组分Fr.2；收集体积比为10:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱液得到组分Fr.3和Fr.4；收集体积比为10:1-5:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱液得到组分Fr.5；收集体积比为5:1-3:1的石油醚-乙酸乙酯洗脱液得到组分Fr.6；收集体积比为1：1的石油醚-乙酸乙酯洗脱液以及乙酸乙酯-甲醇体积比为100：1的洗脱液，合并得到组分Fr.7；收集体积比为100:1-5:1的乙酸乙酯-甲醇洗脱液得到组分Fr.8；其中组分Fr.1和Fr.2为小极性的油和甾体，组分Fr.8为大极性色素；
(6)将组分Fr.3经过反相ODS柱层析，采用体积比为50:50-100:0甲醇-水混合溶液进行洗脱得到8个组分Fr.3.1至Fr.3.8；
(7)将组分Fr.3.4经过凝胶柱层析，采用甲醇进行洗脱，接着通过正相柱层析，采用体积比为15:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液进行洗脱得到9个组分Fr.3.4.1至Fr.3.4.9；
(8)将组分Fr.3.4.4通过半制备高效液相色谱分离，采用体积比为92:8的甲醇-水混合溶液作为流动相分离得到化合物1(10.2mg)、化合物2(4.2mg)和化合物3(36.4mg)；
(9)将组分Fr.3.4.5经过凝胶柱层析，采用体积比为1:1的二氯甲烷-甲醇混合溶液进行洗脱，进一步分离得到化合物4(3.0mg)；
(10)将组分Fr.3.4.6经过凝胶柱层析，采用体积比为1:1的二氯甲烷-甲醇混合溶液进行洗脱，接着通过半制备高效液相色谱，采用体积比为85:15的乙腈-水混合溶液作为流动相，进一步分离得到化合物5(5.4mg)；
(11)将组分Fr.3.4.7通过半制备高效液相色谱，采用体积比为82:18的乙腈-水混合溶液作为流动相，纯化得到化合物6(15.5mg)和化合物7(21.1mg)；
(12)将组分Fr.3.4.9通过半制备高效液相色谱，采用体积比为80:20的乙腈-水混合溶液作为流动相，纯化得到化合物8(4.4mg)和化合物9(4.8mg)；
(13)将组分Fr.3.4.2经过硅胶柱层析，采用体积比为3:1-0:1的石油醚-二氯甲烷混合溶液进行洗脱，接着通过半制备高效液相色谱分离，采用体积比为75:25的甲醇-水混合溶液作为流动相，进一步纯化得到化合物10(2.0mg)。
测试例
测试例1
对化合物1至化合物10的结构鉴定。
对化合物1至化合物10进行高分辨质谱(HRESIMS)，紫外光谱(UV)，红外光谱(IR)，旋光(ORD)，核磁共振(1H NMR和13C NMR)，圆二色谱(ECD)和X射线单晶衍射测试，对测试数据进行综合分析，从而确定化合物1至化合物10的结构。测试结果如下：
化合物1(Spectasterol F)：无色单晶；IR vmax＝3431,2955,1635,1463cm–1；UV(MeOH)λmax(logε)＝203(4.68),225(3.99)nm；ECD(MeOH)λmax(Δε)200(+8.68)nm；1H NMR(600MHz)的数据见表1；13C NMR(150MHz)的数据见表3；HRESIMS[M+Na]+m/z 449.3024(计算值为：C28H42O3Na,449.3032)，晶体结构如图1所示。
化合物2(Spectasterol G)：白色粉末；IR vmax＝3422,2957,1646,1460cm–1；UV(MeOH)λmax(logε)＝203(4.63),225(3.98)nm；ECD(MeOH)λmax(Δε)208(+32.2)nm；1H NMR(600MHz)的数据见表1；13C NMR(150MHz)的数据见表3；HRESIMS[M+Na]+m/z 449.3036(计算值为：C28H42O3Na,449.3032)。
化合物3(Spectasterol H)：白色粉末；IR vmax＝3350,2933,1462cm–1；UV(MeOH)λmax(logε)＝203(4.79),225(4.09)nm；ECD(MeOH)λmax(Δε)206(+15.1)nm；的1H NMR(400MHz的数据见表1；13C NMR(100MHz)的数据见表3；HRESIMS[M+Na]+m/z463.3187(计算值为：C29H44O3Na,463.3188)。
化合物4(Spectasterol I)：白色粉末；IR vmax＝3428,2929,1674,1436cm–1；UV(MeOH)λmax(logε)＝203(4.75),225(4.30)nm；ECD(MeOH)λmax(Δε)224(+3.95),234(+8.07)nm；1H NMR(400MHz)的数据见表1；13C NMR(100MHz)的数据见表3；HRESIMS[M+Na]+m/z393.2043(计算值为：C23H30O4Na,393.2042)。
化合物5(Spectasterol J)：白色粉末；IR vmax＝3428,2957,1621,1463cm–1；UV(MeOH)λmax(logε)＝203(4.65),225(4.15)nm；ECD(MeOH)λmax(Δε)208(+9.54)nm；1H NMR(400MHz)的数据见表1；13C NMR(100MHz)的数据见表3；HRESIMS[M+H]+m/z 431.2920(计算值为：C28H40O2Na,431.2926)。
化合物6(Spectasterol K)：无色晶体；IR vmax＝3410,2930,1681,1465cm–1；UV(MeOH)λmax(logε)＝203(4.42),225(3.76)nm；ECD(MeOH)λmax(Δε)267(+10.17)nm；1H NMR(600MHz)的数据见表2；13C NMR(150MHz)的数据见表3；HRESIMS[M+Na]+m/z 449.3026(计算值为：C29H44O3Na,449.3032)，晶体结构如图6所示。
化合物7(Spectasterol L)：白色粉末；IR vmax＝3400,2958,1646,1466cm–1；UV(MeOH)λmax(logε)＝203(4.62),225(3.92)nm；ECD(MeOH)λmax(Δε)201(+5.54)nm；1H NMR(600MHz)的数据见表2；13C NMR(150MHz)的数据见表3；HRESIMS[M+Na]+m/z 449.3032(计算值为：C29H44O3Na,449.3032)。
化合物8(Spectasterol M)：白色粉末；IR vmax＝3431,2959,1631,1465cm–1；UV(MeOH)λmax(logε)＝203(4.72),225(4.02)nm；ECD(MeOH)λmax(Δε)209(+14.82)nm；1H NMR(400MHz)的数据见表2；13C NMR(100MHz)的数据见表3；HRESIMS[M+Na]+m/z 445.3199(计算值为：C29H44O3Na,463.3188)。
化合物9(SpectasterolN)：白色粉末；IR vmax＝3412,2958,1631,1465cm–1；UV(MeOH)λmax(logε)＝203(4.85),225(4.13)nm；ECD(MeOH)λmax(Δε)210(+8.05)nm；1H NMR(400MHz)的数据见表2；13C NMR(100MHz)的数据见表3；HRESIMS[M+Na]+m/z 463.3196(计算值为：C29H44O3Na,463.3188)。
化合物10(Spectasterol O)：白色粉末；IR vmax＝3364,2958,1678,1596,1457cm–1；UV(MeOH)λmax(logε)＝203(4.30),248(4.95)nm；ECD(MeOH)λmax(Δε)217(－13.46)nm；1H NMR(600MHz)的数据见表1；13C NMR(150MHz)的数据见表3；HRESIMS[M+Na]+m/z 445.3062计算值为：C29H42O2Na,445.3083)。
表1化合物1至化合物5和化合物10的1H NMR数据。
注：上标a表示溶剂为氘代氯仿(400MHZ)，上标b表示溶剂为氘代氯仿(600MHZ)，上标c表示溶剂为氘代二甲基亚砜(600MHZ)
表2化合物6至化合物9的1H NMR数据。
注：上标a表示溶剂为氘代氯仿(400MHZ)，上标b表示溶剂为氘代氯仿(600MHZ)。
表3化合物1至化合物10的13C NMR数据。
注：上标a表示溶剂为氘代氯仿(100MHZ)，上标b表示溶剂为氘代氯仿(150MHZ)，上标c表示溶剂为氘代二甲基亚砜(150MHZ)
测试例2
对实施例1制备得到的化合物1至化合物10的神经保护活性进行评价。
(1)对化合物1至化合物10对谷氨酸钠诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的神经保护作用进行了初步活性评价；
测试方法：将生长状态良好的SH-SY5Y细胞收集并稀释成密度为1.5×105个/mL的细胞悬液，接种于96孔板中，待稳定生长24小时后，给予采用DMEM/F12培养基稀释的浓度为40μM的待测化合物1至化合物10，并设置空白对照组(即不加入化合物1至化合物10)，孵育4小时，根据CCK-8试剂的说明书加入测试试液，与SH-SY5Y细胞在37℃下共同孵育1小时后测量吸光度OD，根据存活率(％)＝OD待测/OD对照×100％来评价待测化合物的毒性。
结果表明，在40μM浓度下预先检测了化合物1至化合物10的细胞毒性，结果表明IC50值>40μM，化合物1至化合物10均未观察到明显的细胞毒性。
(2)CCK-8检测细胞活力；
将生长状态良好的SH-SY5Y细胞收集并稀释成密度为1.5×105个/mL的细胞悬液，接种于96孔板中。待稳定生长24小时后，给予采用DMEM/F12培养基稀释的浓度为40μM的化合物1至化合物10，孵育4小时后，给予采用DMEM/F12培养基稀释的终浓度(孔板浓度)20mM的谷氨酸钠(Glu)溶液共同孵育24小时，同时设置有空白组(即不添加化合物1至化合物10和谷氨酸钠)和谷氨酸钠组(即不添加化合物1至化合物10，只加入谷氨酸钠母液使谷氨酸钠终浓度为20mM)，然后根据CCK-8试剂的说明书加入测试试液，与细胞在37℃下共同孵育1小时后测量吸光度，通过细胞存活率(％)＝(OD待测化合物-OD模型)/(OD对照-OD模型)×100％来评价待测化合物1至化合物9(浓度为40μM)在谷氨酸钠溶液刺激后的保护效果，结果如图3所示；
将生长状态良好的SH-SY5Y细胞收集并稀释成密度为1.5×105个/mL的细胞悬液，接种于96孔板中。待稳定生长24小时后，再给予采用DMEM/F12培养基稀释的浓度为10和5μM的化合物8，孵育4小时后，给予采用DMEM/F12培养基稀释的终浓度(孔板浓度)20mM的谷氨酸钠(Glu)溶液共同孵育24小时，同时设置有空白组(即不添加化合物8和谷氨酸钠)和谷氨酸钠组(即不添加化合物8，只加入谷氨酸钠母液使谷氨酸钠终浓度为20mM)，然后根据CCK-8试剂的说明书加入测试试液，与细胞在37℃下共同孵育1小时后测量吸光度，通过细胞存活率(％)＝(OD待测化合物-OD模型)/(OD对照-OD模型)×100％来评价待测化合物8(浓度为10μM和5μM)在谷氨酸钠溶液刺激后的保护效果，结果如图4A所示。
(3)AnnexinV-FITC/PI染色检测细胞凋亡；
将生长状态良好的SH-SY5Y细胞收集并稀释成密度为1×106个/mL的细胞悬液，接种于6孔细胞培养板，待其稳定生长24小时后，给予采用DMEM/F12培养基稀释的浓度为10μM和5μM的化合物8，4小时后，加入适量谷氨酸钠母液使谷氨酸钠终浓度为20mM，设置有空白组(即不添加化合物8和谷氨酸钠)和谷氨酸钠组(即不添加化合物8，只加入谷氨酸钠母液使谷氨酸钠终浓度为20mM)24h后采用Annexin V-FITC/PI染色，采用流式细胞术检测细胞凋亡率，结果如图4B和4C所示。其中图4B为不同浓度化合物8(5μM和10μM)处理后的细胞凋亡率柱状图；图4C为空白组、谷氨酸钠组、浓度分别为5μM和10μM的化合物8的细胞凋亡情况。数据以均数±标准差表示(n＝3)。与空白组(无谷氨酸钠和化合物8处理组)相比：##p<0.01，####p<0.0001；与谷氨酸钠治疗组相比：*p<0.05，**p<0.01，****p<0.0001。
如图3所示，本发明所述的化合物1至化合物10对SH-SY5Y细胞均具有一定的保护作用；另外如图4A所示，当谷氨酸钠对SH-SY5Y细胞产生毒性作用时，10μM和5μM浓度的化合物8对SH-SY5Y细胞具有显著的保护作用，细胞活力明显上升，约为对照细胞系的50％。
然后进行Annexin V-FITC/PI双染色实验。与谷氨酸钠处理相比，化合物8在浓度为10μM和5μM时，细胞凋亡率分别降低至6.6％和15.3％，如图4B和4C所示，其与CCK-8实验结果一致。
(4)检测化合物8保护谷氨酸钠处理的SH-SY5Y细胞的线粒体功能；
将生长状态良好的SH-SY5Y细胞收集并稀释成密度为5×105个/mL的细胞悬液，接种到12孔细胞培养板中，置于细胞培养箱中培养24小时后，给予采用DMEM/F12培养基稀释的浓度为10μM和5μM的化合物8，4小时后，加入适量谷氨酸钠母液中使谷氨酸钠浓度为20mM，并设置有空白组(不添加化合物8和谷氨酸钠)和谷氨酸钠组(即不添加化合物8，只加入谷氨酸钠母液使谷氨酸钠终浓度为20mM)，24小时后根据线粒体膜电位检测试剂盒(索莱宝)说明书对不同给药组的细胞线粒体膜电位进行检测。
采用相差显微镜观察经谷氨酸钠和不同浓度的化合物8处理后的SH-SY5Y细胞的形态变化，结果如图5A所示。经过谷氨酸钠和化合物8处理后的SH-SY5Y细胞经过JC-1(膜渗透性染料)染色后，在荧光显微镜下观察SH-SY5Y细胞的线粒体膜电位变化(红色荧光表示线粒体膜电位上升，绿色荧光表示线粒体膜电位下降)，结果如图5B所示。图6A为经过谷氨酸钠和化合物8处理后的SH-SY5Y细胞经过JC-1染色后，采用流式细胞术检测得到的数据图。图6A中数据以均数±标准差表示(n＝3)。与空白组(无谷氨酸钠和化合物8治疗组)相比:###p<0.001；与谷氨酸钠处理组比较：**p<0.01。
如图5A所示，与空白组相比，单独用20mM谷氨酸钠处理24h，细胞明显缩小；如图5B和6A所示，与空白组相比，谷氨酸钠处理可以显著降低SH-SY5Y细胞系的红色荧光，这意味着此时线粒体膜电位丢失，但是与谷氨酸钠处理单独相比，化合物8会导致SH-SY5Y细胞系的红色荧光明显增加，因此可以说明化合物8具有较好的神经保护活性。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种芳香性甾体类化合物，其特征在于，所述芳香性甾体类化合物为化合物1至化合物10中的任一种，化合物1至化合物10的结构如下所示；
；
；
；
；
。
2.一种权利要求1所述的芳香性甾体类化合物的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（1）将醒目曲霉的菌丝接种于马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，接着进行恒温培养；
（2）将步骤（1）得到的含菌丝的培养基接种于大米培养基中，进行发酵培养；
（3）将步骤（2）得到的发酵产物采用乙醇减压提取，得到总浸膏；
（4）将所述总浸膏采用乙酸乙酯和水的混合溶液进行萃取，减压浓缩得到乙酸乙酯提取物；
（5）将所述乙酸乙酯提取物进行正相硅胶柱层析，接着采用体积比为30:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液进行梯度洗脱，然后再采用体积比为100:1-0:1的乙酸乙酯-甲醇混合溶液进行梯度洗脱，得到8个组分Fr.1至Fr.8；
（6）将组分Fr.3经过反相ODS柱层析，得到8个组分Fr.3.1至Fr.3.8，所述反相ODS柱层析的洗脱液为体积比为50:50-100:0甲醇-水混合溶液；
（7）将组分Fr.3.4经过凝胶柱层析，所述凝胶柱层析的洗脱液为甲醇，接着通过正相柱层析得到9个组分Fr.3.4.1至Fr.3.4.9，所述正相柱层析的洗脱液为体积比为15:1-0:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶液；
（8）将组分Fr.3.4.4通过半制备高效液相色谱分离，得到化合物1、化合物2和化合物3，所述半制备高效液相色谱的流动相为体积比为92:8的甲醇和水的混合溶液；
（9）将组分Fr.3.4.5经过凝胶柱层析分离得到化合物4，所述凝胶柱层析的洗脱液为体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液；
（10）将组分Fr.3.4.6经过凝胶柱层析，所述凝胶柱层析的洗脱液为体积比为1:1的二氯甲烷和甲醇的混合溶液，接着通过半制备高效液相色谱分离得到化合物5，所述半制备高效液相色谱的流动相为体积比为85:15的乙腈和水的混合溶液；
（11）将组分Fr.3.4.7通过半制备高效液相色谱纯化得到化合物6和化合物7，所述半制备高效液相色谱的流动相为体积比为82:18的乙腈和水的混合溶液；
（12）将组分Fr.3.4.9通过半制备高效液相色谱纯化得到化合物8和化合物9，所述半制备高效液相色谱的流动相为体积比为80:20的乙腈和水的混合溶液；
（13）将组分Fr.3.4.2经过硅胶柱层析，所述硅胶柱层析的洗脱液为体积比为3:1-0:1的石油醚-二氯甲烷混合溶液，接着通过半制备高效液相色谱分离，得到化合物10，所述半制备高效液相色谱的流动相为体积比为75:25的甲醇和水混合溶液。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述恒温培养的条件包括：温度为25-30℃，时间为4-6天。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述恒温培养的条件包括：温度为25-30℃，时间为175-185天。
5.权利要求1所述的芳香性甾体类化合物或其药学上可接受的盐在制备用于神经保护的药物中的应用。
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