CN107556362A - 葫芦烷型三萜化合物的提取方法及抗阿尔兹海默症医药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种葫芦烷型三萜类化合物及提取方法，通过将苦瓜果实研磨成粉末，置于甲醇中浸提，用乙酸乙酯和水萃取，得到水层和酯层的粗提物，分别进行分离纯化，得到目标化合物。本发明提供的葫芦烷型三萜类化合物为一类新型化合物，提取方法简单易行，收率高。本发明提供的葫芦烷型三萜类化合物在抗阿尔兹海默症的体外筛选模型中，显著提高PC12细胞的神经突起分化率，可在制备抗阿尔兹海默症药物和保健品中应用。为抗阿尔兹海默症的新药研发和基础性研究提供依据，具有重要的现实意义。葫芦烷型三萜类化合物结构式如下：
Description
技术领域
本发明属于药物提取领域，涉及葫芦烷型三萜化合物的提取方法，具体涉及一种从苦瓜果实中提取葫芦烷型三萜化合物1-11的方法及其抗阿尔兹海默症的医药用途。
背景技术
随着社会的发展，生活及医疗水平的提高，人类的寿命延长，导致老龄人口增多。据最近的一次联合国对世界人口统计，2015年，全世界的老龄人口已达到9.01亿，占人口总数的12％，并且这个比例还会以每年3.26％的速率在增加，预计2050年，这个数字将达到21亿，世界上主要地区的老龄人口将占四分之一，世界已进入老龄化社会。中国的人口老龄化进程远远快于许多中低收入和高收入国家。在未来的25年里，中国的老龄人口预计会增加一倍以上，将从2010年的1.68亿(12.4％)增长到2040年的4.02亿(28％)。阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)俗称老年痴呆，是威胁老年群体健康的主要疾病之一。在国际阿尔茨海默症协会年报告中指出，2015年，全世界约有4680万人患有痴呆症，预计2030年将达到7470万人，2050年更将突破1亿3150万人，其中约一半为AD患者。58％的痴呆症患者生活在现今的中低收入国家，在2030年这一数字将增加到63％，2050年则达到68％。2015年全球痴呆症照护成本总计为8180亿美元。短短3年，此金额将增加至1兆美元，2030年更会高达2兆美元。我国阿尔兹海默症患者估计超过500万,约占世界总病例数的1/4；而且，随着我国人口老龄化进程的加快，这个数字将更为庞大，给社会稳定与发展带来重大的影响。
AD患者有明显的认知障碍，其中包括渐进性的记忆丢失，丧失语言能力，迷失方向，行为障碍以及失去日常行为能力并最终死亡。AD最主要的病理特征为神经元及突触的丢失，病理组织中的蛋白沉积可以分为两种，一种为胞外β-淀粉样蛋白沉积(β-amynoidprotein,Aβ)，又称作老年斑(senile plaques，SPs)另一种为神经细胞内的神经纤维缠结(neurofibrillary tangles,NFTs)。虽然目前学术界有许多关于AD的病理假说，但都不能完全清楚的解释AD的发病机制。
现今用于治疗AD的药物很多，包括胆碱能药，其中乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)抑制剂上市的药物有他克林(tacrine)、酒石酸卡巴拉汀(rivastigmine)、石杉碱甲(huperzine A)、多奈哌齐(donepezil)等；抗Aβ蛋白沉积的药物，主要有胰岛素样激素、结晶抑制剂和分泌酶抑制剂；神经兴奋性毒性抑制剂美金刚；脑代谢调节剂，如长春胺、尼莫地平、脑益嗪；影响自由基代谢的药物，如维生素C结合维生素E等。但AD是神经退行性疾病，病程中所造成的神经细胞的死亡是不可逆的，而这些治疗药物只能延缓病理进程，且随病情发展药物疗效逐渐降低，有副作用，因此，近年来寻找新的针对AD病因的治疗药物和方法，成为当今研究的热点和难点。
苦瓜(Momordica charantia L.)别名凉瓜、锦荔枝、癫瓜，为葫芦科一年生攀援草本苦瓜属植物，果实药食兼用，是亚洲地区常见的一种蔬菜。我国已有50年的应用历史,为著名的民间中草药。苦瓜性味苦寒,具有驱虫、治疗便秘、降低血糖、抗炎、抗癌、抗肥胖、抗病毒、抗溃疡、降低胆固醇、抗骨质疏松等多种功效。苦瓜中含有数百种物质，比如皂苷、多糖、蛋白质、三萜类、生物碱类、黄酮类、奎宁、氨基酸类、脂肪酸类和微量元素等。
发明内容
本发明的目的是提供一种葫芦烷型三萜类化合物，化合物1-11具有如下结构：
本发明的第二个目的是提供一种葫芦烷型三萜化合物的提取方法，是从苦瓜果实中提取葫芦烷型三萜化合物的方法，通过以下技术方案实现：
(1)将苦瓜果实研磨成粉末，置于甲醇中浸提，得浸提物；
(2)用乙酸乙酯和水对浸提物进行萃取，分别得到水层和酯层的粗提物；
(3)对酯层的粗提物进行第一次分离纯化，得到目标馏分；
(4)对目标馏分进行第二次分离纯化，得到目标馏分I～IV；
(5)对目标馏分I进行分离纯化化合物1-2；
(6)对目标馏分II进行分离纯化得到化合物3-6；
(7)对目标馏分III进行分离纯化得到化合物7-9；
(8)对目标馏分IV进行分离纯化得到化合物10-11。
化合物1-11的化学结构如下：
作为优选，所述的步骤(1)中浸提时间为1～5天。由于甲醇的破壁效果较好，提取效率较高，将苦瓜果实粉碎后置于甲醇中1～5天，能够得到合适的浸提物，以提高后续葫芦烷型三萜化合物的产率。
作为优选，所述的步骤(2)中乙酸乙酯和水的体积比为1:1～3。
作为优选，所述的步骤(3)中先后以正己烷与丙酮、丙酮与甲醇溶剂系统作洗脱剂，采用硅胶开口柱对酯层的粗提物进行第一次分离纯化。作为优选，将正己烷与丙酮溶剂系统按体积比99:1、98:2、95:5、90:10、80：20、70:30、60:40、50:50、20:80、0:100依次洗脱，接着换用丙酮与甲醇溶剂系统按体积比50:50、0:100依次洗脱，获得目标馏分。
作为优选，所述的步骤(4)中以甲醇与水系统作洗脱剂，采用十八烷基键合硅胶开口柱对所述目标馏分进行第二次分离纯化。将甲醇与水溶剂系统按照体积比60:40、70:30、75:25、80:20、90:10、100:0依次洗脱，获得目标馏分I-IV。
作为优选，所述的步骤95中对目标馏分I进行分离纯化包括以下步骤：a1)以甲醇与水溶剂系统作洗脱剂，采用十八烷基键合硅胶开口柱对目标馏分I进行分离，获得目标馏分；a2)将目标馏分以二氯甲烷与甲醇溶剂系统作洗脱剂，采用硅胶开口柱进行分离，获得目标馏分。a3)对目标馏分进行HPLC纯化，得到化合物1-2。作为优选，所述的步骤a1)中，将甲醇与水溶剂系统按照体积比70:30、73:27、75:25、77:23、80:20、83:17、85:15、100:0依次洗脱，获得目标馏分。作为优选，所述的步骤a2)中，将二氯甲烷与甲醇溶剂系统按照体积比100:0、99:1、98:2、97.5:2.5、95:5、90:10、0:100依次洗脱，获得目标馏分。作为优选，所述的步骤a3)中对目标馏分进行HPLC纯化的条件如下：C30-UG-5(10ID×250mm,NomuraChemical)，流动相为乙腈:水＝90:10，流速为3mL/min，检测波长为210nm，得到化合物1(1.0mg，tR＝30.7min)和2(4.6mg，tR＝33.5min)。
作为优选，所述的步骤(6)中对目标馏分II进行分离纯化包括以下步骤：b1)以三氯甲烷与甲醇溶剂系统作洗脱剂，采用硅胶开口柱进行分离，获得目标馏分；b2)以甲醇与水溶剂系统作洗脱剂，采用十八烷基键合硅胶开口柱对目标馏分进行分离，获得目标馏分；b3)对目标馏分进行高效液相纯化，得到化合物3-6。作为优选，所述的步骤b1)中，将三氯甲烷与甲醇溶剂系统按照体积比100:0、98:2、95:5、90:10、0:100依次洗脱，获得目标馏分。作为优选，所述的步骤b2)中，将甲醇与水溶剂系统按照体积比70:30、75:25、80:20、90:10、100:0依次洗脱，获得目标馏分。作为优选，所述的步骤b3)中对目标馏分进行HPLC纯化的条件如下：C30-UG-5(10ID×250mm,Nomura Chemical)，流动相为乙腈:水＝62:38，流速为3mL/min，检测波长为210nm，得到化合物3(10.6mg，tR＝15.9min)，4(1.8mg，tR＝17.1min)，5(1.9mg，tR＝18.7min)和6(3.2mg，tR＝30.5min)。
作为优选，所述的步骤(7)中对目标馏分III进行分离纯化包括以下步骤：c1)先后以正己烷与三氯甲烷、三氯甲烷与甲醇溶剂系统作洗脱剂，采用硅胶开口柱进行分离，获得目标馏分；c2)对目标馏分进行高效液相纯化，得到化合物7-9。作为优选，所述的步骤c1)中，溶剂系统为正己烷:氯仿＝50:50、30:70、0:100；氯仿:甲醇＝97:3、95:5、90:10、0:100，依次洗脱，获得目标馏分。作为优选，所述的步骤c2)中对目标馏分进行HPLC纯化的条件如下：PAKC18(10ID×250mm,CAPCELL)，流动相为乙腈:水＝63:37，流速为3mL/min，检测波长为210nm，得到化合物7(10.2mg，tR＝20.2min)，8(4.9mg，tR＝22.9min)和9(1.3mg，tR＝32.0min)。
作为优选，所述的步骤(8)中对目标馏分IV进行分离纯化包括以下步骤：d1)以三氯甲烷与甲醇溶剂系统作洗脱剂，采用硅胶开口柱进行分离，获得目标馏分；d2)以甲醇与水溶剂系统作洗脱剂，采用十八烷基键合硅胶开口柱对目标馏分进行分离，获得目标馏分；d3)对目标馏分进行高效液相纯化，得到化合物10-11。作为优选，所述的步骤d1)中，将三氯甲烷与甲醇溶剂系统按照体积比100:0、100:1、100:2、100:3、100:5、90:10、0:100依次洗脱，获得目标馏分。作为优选，所述的步骤d2)中，将甲醇与水溶剂系统按照体积比90:10、95:5、100:0依次洗脱，获得目标馏分。作为优选，所述的步骤d3)中对目标馏分进行HPLC纯化的条件如下：PAKC18(10ID×250mm,CAPCELL)，流动相为乙腈:水＝60:40，流速为3mL/min，检测波长为210nm，得到化合物10(5.0mg，tR＝28.7min)和11(8.0mg，tR＝33.8min)。
上述技术方案中提供了一种新型的提取方法，从苦瓜果实中提取葫芦烷型三萜化合物1-11，该方法简单易行，效率高。
本发明的第三个目的是提供通过上述方法提取的葫芦烷型三萜化合物在制备抗阿尔兹海默症药物中的应用，所述葫芦烷型三萜化合物为化合物1-11。所述药物葫芦烷型三萜化合物与药学上可接受的载体组成。
研究发现，这11个葫芦烷型三萜化合物在抗阿尔兹海默症的体外筛选模型中，可以显著提高PC12细胞的神经突起分化率。
本发明的第四个目的是提供通过上述方法提取的葫芦烷型三萜化合物在制备抗阿尔兹海默症的保健品中的应用，所述葫芦烷型三萜化合物为化合物1-11。所述保健品由葫芦烷型三萜化合物与食品或保健品可接受的载体组成。
所述的药学上可接受的载体是指药学领域常规的药物载体，如填充剂、粘合剂、湿润剂、吸收促进剂、表面活性剂等。所述的填充剂可采用淀粉、蔗糖或微晶纤维素；所述的粘合剂可采用淀粉浆、羟丙纤维素、明胶或聚乙二醇；所述的湿润剂可采用硬脂酸镁、微粉硅胶或聚乙二醇类；所述的吸收促进剂可采用聚山梨脂或卵磷脂；所述的表面活性剂可采用伯洛沙姆、脂肪酸山梨坦或聚山梨脂。另外还可以加入其它辅剂如香味剂、甜味剂等。
所述的抗阿尔兹海默症的药物或保健品的剂型可以是片剂，丸剂，粉剂，分散片，小药囊剂，酏剂，混悬剂，乳剂，溶液剂，糖浆剂，气雾剂，软胶囊，硬胶囊，无菌注射液，搽剂或栓剂；可制成常规、速释、缓释或延迟释放制剂。
本发明制备的抗阿尔兹海默症药物或保健品可通过各种途径给予，包括口服、鼻腔、肌肉注射、皮下注射、静脉注射等。
同现有技术相比，本发明的有益效果体现在：
(1)本发明采用PC 12细胞作为有效的活性鉴定系统，发现苦瓜甲醇提取物分离得到的活性化合物1-11，能诱导PC 12细胞神经突起伸长，具有显著的拟神经生长因子活性。
(2)本发明提供新型的提取方法，从苦瓜果实中提取葫芦烷型三萜化合物，该方法简单易行，价格低廉，用时较短提取率高，此外，苦瓜药食同源，来源广泛，取材便利。
(3)本发明制备的活性化合物1-11，具有显著的拟神经生长因子的活性，可以制备预防阿尔兹海默症等神经退行性疾病的药物和保健食品。
(4)本发明中的苦瓜廉价易得，且至今无其具有拟神经生长因子活性的相关报道。因此，本发明对该食品新的药理活性研究及开发具有重要意义。
附图说明
图1～8为本发明化合物1-11对PC12细胞神经突起分化率的影响；其中，DMSO为阴性对照，神经生长因子NGF为阳性对照。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1:苦瓜果实中提取葫芦烷型三萜化合物
苦瓜果实中提取葫芦烷型三萜化合物的方法，包括以下步骤：
(1)将1.5kg(干重)的苦瓜(Momordica charantia)粉碎后，用5L工业级甲醇浸提，放在摇床中室温震荡浸提3天，真空抽滤，取滤液，减压浓缩得到甲醇浸提物224g。
(2)将(1)中所得甲醇浸提物交替使用乙酸乙酯和水溶解样品并转移至分液漏斗内分配，静置过夜后分别旋干乙酸乙酯层和水层，得到乙酸乙酯层样品30g，水层样品170g。
(3)乙酸乙酯层的样品经硅胶开口柱分离(硅胶200-300目)，洗脱体系为正己烷:丙酮＝99:1、98:2、95:5、90:10、80：20、70:30、60:40、50:50、20:80、0:100；丙酮:甲醇＝50:50、0:100。经TLC分析，合并后共得到9个样品(A-1～9)。对A-8(13.9g，洗脱体系为正己烷:丙酮＝20:80)进一步分离纯化。
(4)将A-8(取其中的4g)用十八烷基键合硅胶开口柱进行第二次分离，洗脱体系为甲醇:水＝60:40、70:30、75:25、80:20、90:10、100:0。经TLC分析，合并后共得到11个样品(B-1～11)。分别对B-6(660mg，洗脱体系为甲醇:水＝75:25)，B-7(277mg，洗脱体系为甲醇:水＝75:25)，B-8(340.4mg，洗脱体系为甲醇:水＝80:20)，B-9(608.8mg，洗脱体系为甲醇:水＝80:20)进一步分离纯化。
a)对B-6的分离纯化。将B-6(取600mg)用十八烷基键合硅胶开口柱进行第三次分离，洗脱体系为甲醇:水＝70:30、73:27、75:25、77:23、80:20、83:17、85:15、100:0。经TLC分析，合并后共得到9个样品(C-1～9)。将C-6(72mg，洗脱体系为甲醇:水＝75:25)用硅胶开口柱进一步分离，洗脱体系为二氯甲烷:甲醇＝100:0、99:1、98:2、97.5:2.5、95:5、90:10、0:100。经TLC分析，合并后共得到10个样品(D-1～10)。然后对D-6(共11.6mg，洗脱体系为二氯甲烷:甲醇＝98:2)进行高效液相纯化。色谱条件为C30-UG-5(10ID×250mm,NomuraChemical)，流动相为乙腈:水＝90:10，流速为3mL/min，检测波长为210nm，得到化合物1(1.0mg，tR＝30.7min)和2(4.6mg，tR＝33.5min)。
b)对B-7的分离纯化。将B-7(277mg)用硅胶开口柱进一步分离，洗脱体系为氯仿:甲醇＝100:0、98:2、95:5、90:10、0:100，经TLC分析，合并后共得到11个样品(III-E-1～11)。然后对E-7(共63mg，洗脱体系为氯仿:甲醇＝98:2)用十八烷基键合硅胶开口柱进行分离，洗脱体系为甲醇:水＝70:30、75:25、80:20、90:10、100:0。经TLC分析，合并后共得到6个样品(III-F-1～6)。对F-2(37.8mg，洗脱体系为甲醇:水＝75:25)进行高效液相纯化。色谱条件为C30-UG-5(10ID×250mm,Nomura Chemical)，流动相为乙腈:水＝62:38，流速为3mL/min，检测波长为210nm，得到化合物3(10.6mg，tR＝15.9min)，4(1.8mg，tR＝17.1min)，5(1.9mg，tR＝18.7min)和6(3.2mg，tR＝30.5min)。
c)对B-8的分离纯化。将B-8(取340mg)用硅胶开口柱进一步分离，洗脱体系为正己烷:氯仿＝50:50、30:70、0:100；氯仿:甲醇＝97:3、95:5、90:10、0:100，经TLC分析，合并后共得到9个样品(G-1～9)。然后对G-4(共49.4mg，洗脱体系为氯仿:甲醇＝97:3)进行高效液相纯化。色谱条件为PAKC18(10ID×250mm,CAPCELL)，流动相为乙腈:水＝63:37，流速为3mL/min，检测波长为210nm，得到化合物7(10.2mg，tR＝20.2min)，8(4.9mg，tR＝22.9min)和9(1.3mg，tR＝32.0min)。
d)对B-9的分离纯化。将B-9(取600mg)用硅胶开口柱进一步分离，洗脱体系为氯仿:甲醇＝100:0、100:1、100:2、100:3、100:5、90:10、0:100、经TLC分析，合并后共得到8个样品(H-1～8)。然后对活性馏分H-4(共332.4mg，洗脱体系为氯仿:甲醇＝100:3)用十八烷基键合硅胶开口柱进行分离，洗脱体系为甲醇:水＝90:10、95:5、100:0。经TLC分析，合并后共得到4个样品(I-1～4)。对I-3(42mg，洗脱体系为甲醇:水＝90:10)进行高效液相纯化。色谱条件为PAKC18(10ID×250mm,CAPCELL)，流动相为乙腈:水＝60:40，流速为3mL/min，检测波长为210nm，得到化合物10(5.0mg，tR＝28.7min)和11(8.0mg，tR＝33.8min)。
对所得的11个化合物的理化特化学结构经13C NMR、MS、[α]D进行分析测定，结果如下：
化合物1：(23E)-5β,19-Epoxycucurbita-6,23,25-trien-3β-ol 3-O-β-D-allopyranoside(Charantoside IV)；无色固体；分子式为C36H56O7；高分辨率质谱High-resolution ESI-TOF-MS m/z 623.3919,calcd.forC36H56O7Na(M+Na)+623.3918；1H NMR(500MHz,pyridine-d5):δ＝0.76(3H,s,-CH3),0.86(3H,s,-CH3),0.90(3H,s,-CH3),0.93(3H,d,J＝6.1Hz,H-21),1.52(3H,s,-CH3),1.92(3H,s,-CH3),3.62(1H,d,J＝7.9Hz,H-19),3.68(1H,br s,H-3),3.78(1H,d,J＝8.0Hz,H-19),4.99(1H,s,H-26a)5.05(1H,s,H-26b),5.45(1H,d,J＝7.8Hz,H-1′),5.57(1H,dd,J＝3.7,9.7Hz,H-7),5.77(1H,m,H-23),6.21(1H,dd,J＝2.1,9.6Hz,H-6),6.31(1H,d,J＝15.1Hz,H-24)；13C NMR(125MHz,pyridine-d5):δ＝15.4,19.3,19.3,19.3,20.6,21.5,24.2,26.0,28.0,28.7,31.4,33.8,37.2,39.4,40.5,40.5,45.7,45.9,49.3,51.0,52.7,63.7,69.7,72.9,73.5,76.6,80.5,85.5,86.3,104.3,115.1,130.3,130.4,134.6,135.1,142.9。
化合物2的结构经LC-MS、1H NMR、13C NMR，HMBC测试后确定。化合物2:白色固体；分子式为C37H58O8；高分辨率质谱High-resolution ESI-TOF-MS m/z 653.4029,calcd.for C37H58O8Na(M+Na)+653.4024；1H NMR和13C NMR数据见下表1。
表1
化合物2中糖的立体构型的确定：
取化合物2 0.5mg，1mL甲醇溶解后，加入200μL浓盐酸，80℃油浴回流4h，减压蒸馏干燥后，用水和氯仿交替萃取，所得水层旋干后，取200μg用160μL吡啶溶解，加入40μL10mg/mL的L-半胱氨酸甲酯盐酸盐的吡啶溶液，60℃油浴1h后，再加入100μL含0.67μL邻甲苯异硫氰酸酯吡啶溶液，继续60℃油浴1h后取出，经氮吹干燥后，400μL甲醇复溶，HR ESI-TOF-MS分析，糖的衍生物保留时间和标准糖衍生物进行比对，确定糖的绝对立体构型。标准糖衍生物的制备同上，其中由于标准L-阿洛糖无法购买得到，经查阅文献，将D-阿洛糖和D-半胱氨酸甲酯盐酸盐反应，其余条件不变，得到L-阿洛糖衍生物的保留时间。
化合物2的单糖衍生物保留时间为阿洛糖(tR＝9.287min)和标准糖衍生物L-半胱氨酸甲酯-D-阿洛糖(tR＝9.127min)，D-半胱氨酸甲酯-D-阿洛糖(tR＝7.460min)对比得到化合物2的单糖为D-阿洛糖。
化合物3：Momordicoside F2；白色固体；分子式为C36H58O8；高分辨率质谱High-resolution ESI-TOF-MS m/z 641.4025,calcd.forC36H58O8Na(M+Na)+641.4024；1H NMR(500MHz,pyridine-d5):δ＝0.74(3H,s,-CH3),0.83(3H,s,-CH3),0.90(3H,s,-CH3),0.96(3H,d,J＝5.8Hz,H-21),1.51(3H,s,-CH3),1.56(3H,s,-CH3),1.57(3H,s,-CH3),3.61(1H,d,J＝8.0Hz,H-19),3.68(1H,br s,H-3),3.77(1H,d,J＝8.0Hz,H-19),3.98(1H,m,H-2′),4.73(1H,d,J＝2.9Hz,H-3′),5.44(1H,d,J＝7.8Hz,H-1′),5.57(1H,dd,J＝3.7,9.8Hz,H-7),5.94(2H,m,H-23,H-24),6.21(1H,dd,J＝1.8,9.8Hz,H-6)；13C NMR(125MHz,pyridine-d5):δ＝15.4,19.3,19.3,20.6,21.5,24.3,26.0,28.0,28.6,31.3,31.3,31.4,33.8,37.0,39.4,39.9,40.5,45.7,45.8,49.3,50.6,52.7,63.7,69.7,70.1,72.9,73.5,76.6,80.5,85.5,86.3,104.2,124.6,130.4,134.6,142.1.
化合物4：19(R)-methoxy-5β,19-epoxy-cucurbita-6,23-diene-3β,25-diol3-O-β-D-allopyranoside(Goyaglycoside-b)；白色固体；分子式为C37H60O9；高分辨率质谱High-resolution ESI-TOF-MS m/z 671.4134,calcd.forC37H60O9Na(M+Na)+671.4130；1H NMR(500MHz,pyridine-d5):δ＝0.83(3H,s,-CH3),0.87(3H,s,-CH3),0.89(3H,s,-CH3),0.97(3H,d,J＝5.6Hz,H-21),1.48(3H,s,-CH3),1.56(3H,s,-CH3),1.57(3H,s,-CH3),3.14(1H,br s,H-8),3.51(3H,s,-OCH3),3.73(1H,br s,H-3),4.91(1H,s,H-19),5.53(1H,d,J＝7.8Hz,H-1′),5.63(1H,dd,J＝3.6,9.8Hz,H-7),5.95(2H,m,H-23,H-24),6.17(1H,dd,J＝2.0,9.7Hz,H-6)；13C NMR(125MHz,pyridine-d5):δ＝15.3,19.1,19.3,20.4,21.7,23.7,25.3,27.8,28.6,31.3,31.3,31.3,34.3,37.0,39.5,40.0,42.0,42.6,45.7,48.6,48.7,50.8,58.1,63.7,69.7,70.1,72.2,74.2,77.0,83.9,86.0,102.8,112.8,124.7,132.0,133.6,142.1.
化合物5：7-methoxycucurbita-5,23-dien-3β,25-diol 3-O-β-D-allopyranoside(Karaviloside III)；白色固体；分子式为C37H62O8；高分辨率质谱High-resolution ESI-TOF-MS m/z 657.4342,calcd.forC37H62O8Na(M+Na)+657.4337；1H NMR(500MHz,pyridine-d5):δ＝0.67(3H,s,-CH3),0.90(3H,s,-CH3),1.00(3H,d,J＝5.8Hz,H-21),1.09(3H,s,-CH3),1.14(3H,s,-CH3),1.56(3H,s,-CH3),1.57(3H,s,-CH3),1.58(3H,s,-CH3),3.31(3H,s,-OCH3),3.42(1H,br d,J＝4.6Hz,H-7),3.67(1H,br s,H-3),5.38(1H,d,J＝7.9Hz,H-1′),5.96(3H,m,H-6,H-23,H-24)；13C NMR(125MHz,pyridine-d5):δ＝16.0,18.5,19.4,23.1,26.3,28.3,29.3,29.4,29.6,30.8,31.3,31.3,33.2,34.7,35.4,37.1,39.8,40.0,42.4,46.7,48.7,49.3,50.6,56.6,63.8,69.7,70.1,72.5,73.9,76.1,78.0,88.2,105.4,119.5,124.2,142.1,148.4.
化合物6：25-methoxy-5β,19-epoxycucurbita-6,23-dien-19-on 3-O-β-D-allopyranoside(Charantoside C)；白色固体；分子式为C37H58O9；高分辨率质谱High-resolution ESI-TOF-MS m/z 669.3975,calcd.for C37H58O9Na(M+Na)+,669.3973；1H NMR(500MHz,pyridine-d5):δ＝0.82(3H,s,-CH3),0.88(3H,s,-CH3),0.91(3H,s,-CH3),0.94(3H,d,J＝5.5Hz,H-21),1.34(6H,s,-CH3×2),1.55(3H,s,-CH3),3.22(3H,s,-OCH3),3.63(1H,br s,H-3),5.33(1H,d,J＝7.9Hz,H-1′),5.54～5.67(4H,m,H-6,H-7,H-23,H-24)；13C NMR(125MHz,pyridine-d5):δ＝15.0,19.2,19.7,20.1,21.2,22.3,24.3,26.4,26.8,26.9,28.0,30.5,33.8,36.7,38.7,40.0,41.1,45.3,45.7,48.3,50.5,50.8,51.1,63.7,69.6,72.8,73.5,75.2,76.4,84.7,85.6,105.3,128.7,132.9,133.4,138.1,182.5.
化合物7：(23S)-5β,19-Epoxy-23-methoxycucurbita-6,24-dien-3β-ol3-O-β-D-allopyranoside(Charantoside VI)；白色固体；分子式为C37H60O8；高分辨率质谱High-resolution ESI-TOF-MS m/z 655.4178,calcd.forC37H60O8Na(M+Na)+655.4180；1H NMR(500MHz,pyridine-d5):δ＝0.77(3H,s,-CH3),0.88(3H,s,-CH3),0.90(3H,s,-CH3),1.04(3H,d,J＝5.4Hz,H-21),1.49(3H,s,-CH3),1.73(3H,s,-CH3),1.75(3H,s,-CH3),3.31(3H,s,-OCH3),3.59(1H,d,J＝8.0Hz,H-19),3.67(1H,br s,H-3),3.76(1H,d,J＝8.0Hz,H-19),4.12(1H,dt,J＝4.8,8.8Hz,H-23),5.17(1H,d,J＝9.3Hz,H-24),5.42(1H,d,J＝7.8Hz,H-1′),5.56(1H,dd,J＝3.7,9.8Hz,H-7),6.21(1H,d,J＝9.9Hz,H-6)；13C NMR(125MHz,pyridine-d5):δ＝15.2,18.8,19.3,20.3,20.6,21.5,24.2,26.0,26.3,28.0,29.1,31.5,33.8,34.2,39.4,40.5,43.4,45.7,45.9,49.3,51.7,52.7,55.7,63.7,69.7,72.9,73.5,76.6,76.8,80.5,85.6,86.3,104.2,127.8,130.4,134.5,135.5.
化合物8：(19R,23S)-5β,19-epoxy-19,23-dimethoxycucurbita-6,24-dien-3β-ol-3-O-β-D-allopyranoside(Charantagenin E)；无色固体；分子式为C38H62O9；高分辨率质谱High-resolution ESI-TOF-MS m/z 685.4282,calcd.forC38H62O9Na(M+Na)+685.4286；1H NMR(500MHz,pyridine-d5):δ＝0.82(3H,s,-CH3),0.90(3H,s,-CH3),0.91(3H,s,-CH3),1.06(3H,d,J＝4.8Hz,H-21),1.47(3H,s,-CH3),1.71(3H,s,-CH3),1.73(3H,s,-CH3),3.14(1H,br s,H-8),3.31(3H,s,-OCH3),3.48(3H,s,-OCH3),3.72(1H,br s,H-3),4.89(1H,s,H-19),5.16(1H,d,J＝9.3Hz,H-24),5.53(1H,d,J＝7.8Hz,H-1′),5.62(1H,dd,J＝3.6,9.7Hz,H-7),6.17(1H,dd,J＝2.1,9.7Hz,H-6)；13C NMR(125MHz,pyridine-d5):δ＝15.1,18.8,19.1,20.4,20.4,21.7,23.7,25.3,26.2,27.8,29.0,31.4,34.2,34.2,39.5,42.0,42.6,43.4,45.7,48.5,48.7,51.8,55.7,58.0,63.7,69.6,72.2,74.2,76.9,77.0,83.9,86.0,102.8,112.8,127.8,132.0,133.5,135.5.
化合物9：(19R,23R)-5β,19-Epoxy-19,23-dimethoxycucurbita-6,24-dien-3β-ol3-O-β-D-allopyranoside(Charantoside II)；白色固体；分子式为C38H62O9；高分辨率质谱High-resolution ESI-TOF-MS m/z 685.4292,calcd.forC38H62O9Na(M+Na)+685.4286；1H NMR(500MHz,pyridine-d5):δ＝0.83(3H,s,-CH3),0.92(3H,s,-CH3),0.95(3H,s,-CH3),1.08(3H,d,J＝6.4Hz,H-21),1.47(3H,s,-CH3),1.71(3H,s,-CH3),1.75(3H,s,-CH3),3.14(1H,br s,H-8),3.29(3H,s,-OCH3),3.49(3H,s,-OCH3),3.73(1H,br s,H-3),4.90(1H,s,H-19),5.23(1H,d,J＝8.8Hz,H-24),5.54(1H,d,J＝7.8Hz,H-1′),5.62(1H,dd,J＝3.6,9.7Hz,H-7),6.17(1H,dd,J＝2.0,9.8Hz,H-6)；13C NMR(125MHz,pyridine-d5):δ＝15.2,18.5,19.1,19.3,20.4,21.6,23.7,25.2,26.2,27.7,28.8,31.4,33.2,34.2,39.4,42.0,42.6,43.7,45.8,48.5,48.7,51.7,56.0,58.0,63.6,69.6,72.2,74.1,75.2,76.9,83.9,85.9,102.9,112.8,128.3,132.0,133.5,134.9.
化合物10：Momordicoside G；白色固体；分子式为C37H60O8；高分辨率质谱High-resolution ESI-TOF-MS m/z 655.4188,calcd.forC37H60O8Na(M+Na)+655.4180；1H NMR(500MHz,pyridine-d5):δ＝0.79(3H,s,-CH3),0.89(3H,s,-CH3),0.91(3H,s,-CH3),0.97(3H,d,J＝6.1Hz,H-21),1.34(6H,s,-CH3×2),1.50(3H,s,-CH3),3.23(3H,s,-OCH3),3.62(1H,d,J＝8.0Hz,H-19),3.68(1H,br s,H-3),3.78(1H,d,J＝8.0Hz,H-19),3.96(1H,d,J＝7.6Hz,H-2′),4.71(1H,m,H-3′),5.42(1H,d,J＝7.8Hz,H-1′),5.60(2H,m,H-23,H-24),6.22(1H,dd,J＝1.8,9.7Hz,H-6)；13C NMR(125MHz,pyridine-d5):δ＝15.5,19.3,20.6,21.5,24.2,26.0,26.5,26.9,28.0,28.6,31.5,33.8,36.7,39.4,40.1,40.5,45.7,45.9,49.3,50.6,50.7,52.7,63.7,65.3,69.7,72.9,73.5,75.3,76.6,80.6,85.5,86.3,104.2,128.8,130.4,134.6,138.1.
化合物11：19(R),25-dimethoxy-5β,19-epoxycucurbita-6,23-dien-3β-ol 3-O-β-D-allopyranoside(Goyaglycoside-d)；白色固体；分子式为C38H62O9；高分辨率质谱High-resolution ESI-TOF-MS m/z 685.4292,calcd.forC38H62O9Na(M+Na)+685.4286；1H NMR(500MHz,pyridine-d5):δ＝0.84(3H,s,-CH3),0.92(3H,s,-CH3),0.93(3H,s,-CH3),0.99(3H,d,J＝5.7Hz,H-21),1.34(6H,s,-CH3×2),1.47(3H,s,-CH3),3.16(1H,br s,H-8),3.23(3H,s,-OCH3),3.52(3H,s,-OCH3),3.73(1H,br s,H-3),3.93(1H,d,J＝7.8Hz,H-2′),4.75(1H,m,H-3′),4.91(1H,s,H-19),5.51(1H,d,J＝7.8Hz,H-1′),5.57(1H,d,J＝15.9Hz,H-24),5.64(1H,dd,J＝3.6,9.5Hz,H-7),5.68(1H,dd,J＝6.3,9.4Hz,H-23),6.18(1H,dd,J＝2.1,9.7Hz,H-6)；13C NMR(125MHz,pyridine-d5):δ＝15.3,19.1,19.3,20.3,21.6,23.7,25.3,26.4,26.9,27.8,28.5,31.3,34.3,36.8,39.5,40.1,42.0,42.6,45.7,48.5,48.7,50.5,50.8,58.1,63.7,69.6,72.2,74.1,75.2,76.9,83.9,86.0,102.8,112.8,128.9,132.0,133.6,138.0。
实施例2：化合物1-11的生物活性分析
研究发现NGF具有促进神经生长和神经保护作用，能阻止或减少神经元的退变，一定程度可阻止AD进展。由于PC12细胞具有神经细胞的一般特征，在NGF的作用下会停止分裂，长出突起，转化成神经元样细胞。因此，采用PC 12细胞作为有效的体外生物活性鉴定系统，筛选具有拟神经生长因子活性的化合物，有可能成为治疗阿尔兹海默症的有效药物。
分析方法包括以下步骤：
(1)PC 12细胞(大鼠肾上腺嗜铬瘤细胞株)的培养：在100mm的培养皿中，加入10mL含20×104个PC 12细胞DMEM培养基(其中含10％马血清、5％胎牛血清)，两天后更换一次培养基，再过三天继代。继代时先用PBS(磷酸盐缓冲液)将细胞洗两次，再加入10mL PBS于培养皿中，在37℃，5％CO2的培养箱内静置10分钟后，取出吹洗，转移到15mL的一次性离心管，离心后血球计数板上计数。24孔细胞培养板每孔先加入1mL含血清的DMEM培养基，细胞计数后，每孔接2×104个细胞，CO2培养箱培养24小时后加样。
(2)活性测试：以DMSO(二甲基亚砜)为阴性对照，NGF为阳性对照，将活性化合物1-11配置成不同浓度的DMSO溶液。用1mL含0.5％DMSO和不同浓度样品的DMEM溶液(不含血清)将24孔细胞板的每孔原培养基置换后，放入37℃，5％CO2的培养箱中培养。倒置显微镜下每隔24小时、连续4天观察细胞形态变化，记录细胞的神经突起分化率(神经突起长于胞体直径一倍的细胞数目与视野下总细胞数目的比值)，每个视野下约100个细胞，随机选取3处，并统计作图分析。结果见图1-4。
(3)实验结果：
图1-2中，图1为加入不同浓度的化合物1和2时，PC12细胞的神经突起分化率。其中，0.5％DMSO为阴性对照Control，NGF(40ng/mL)为阳性对照。***P<0.001。图2为加入化合物1～2 48h后PC12细胞显微图片。(a)0.5％DMSO,Control；(b)40ng/mL NGF；(c)1,10μM；(d)2,3μM。
图3-4中，图3为加入不同浓度的化合物3～5时，PC12细胞的神经突起分化率。其中，0.5％DMSO为阴性对照Control，NGF(40ng/mL)为阳性对照。***P<0.001。图4为加入化合物3～5 48h后PC12细胞显微图片。(a)0.5％DMSO,Control；(b)40ng/mL NGF；(c)3,3μM；(d)4,1μM；(e)5,3μM。
图5-6中，图5为加入不同浓度的化合物7～9时，PC12细胞的神经突起分化率。其中，0.5％DMSO为阴性对照Control，NGF(40ng/mL)为阳性对照。***P<0.001。图6为加入化合物7～9 48h后PC12细胞显微图片。(a)0.5％DMSO,Control；(b)40ng/mL NGF；(c)7,1μM；(d)8,1μM；(e)9,3μM。
图7-8中，图7为加入不同浓度的化合物6,10～11时，PC12细胞的神经突起分化率。其中，0.5％DMSO为阴性对照Control，NGF(40ng/mL)为阳性对照。**P<0.01,***P<0.001。图8为加入化合物6,10～11 48h后PC12细胞显微图片。(a)0.5％DMSO,Control；(b)40ng/mLNGF；(c)6,1μM；(d)10,10μM；(e)11,10μM。
上述实验结果表明，苦瓜果实中提取分离得到的葫芦烷型三萜化合物1-11具有显著的拟神经生长因子活性。在三萜皂苷19位引入甲氧基或酮基后，化合物的拟神经生长因子活性明显提高，其中新化合物2活性最好。
Claims (8)
1.一种葫芦烷型三萜类化合物，其特征在于，化合物1-11具有如下结构：
。
2.一种葫芦烷型三萜化合物的提取方法，其特征在于，通过以下步骤实现：
(1)将苦瓜果实切成片，晒干后粉碎，置于甲醇中浸提1～5天，得浸提物；
(2)用乙酸乙酯和水对浸提物进行萃取，分别得到水层和酯层的粗提物，乙酸乙酯和水的体积比为1:1～3；
(3)对酯层的粗提物进行第一次分离纯化，得到目标馏分，以正己烷与丙酮、丙酮与甲醇溶剂系统作洗脱剂，采用硅胶开口柱对酯层的粗提物进行分离纯化；将正己烷与丙酮溶剂系统按体积比99:1、98:2、95:5、90:10、80：20、70:30、60:40、50:50、20:80、0:100依次洗脱，接着换用丙酮与甲醇溶剂系统按体积比50:50、0:100依次洗脱，获得的目标馏分，正己烷:丙酮＝20:80；
(4)对目标馏分进行第二次分离纯化，得到目标馏分I～IV；以甲醇与水系统作洗脱剂，采用十八烷基键合硅胶开口柱对所述目标馏分进行分离纯化，将甲醇与水溶剂系统按照体积比60:40、70:30、75:25、80:20、90:10、100:0依次洗脱，获得目标馏分I～IV；
(5)对目标馏分I进行分离纯化得到化合物1-2，通过以下步骤：
a1)以甲醇与水溶剂系统作洗脱剂，采用十八烷基键合硅胶开口柱对目标馏分I进行分离，获得目标馏分；
a2)将a1)所得目标馏分以二氯甲烷与甲醇溶剂系统作洗脱剂，采用硅胶开口柱进行分离，获得目标馏分；
a3)对a2)所得目标馏分进行HPLC纯化，得到化合物1-2。
(6)对目标馏分II进行分离纯化得到化合物3-6，通过以下步骤实现：
b1)以三氯甲烷与甲醇溶剂系统作洗脱剂，采用硅胶开口柱进行分离，获得目标馏分；
b2)对b1)所得目标馏分以甲醇与水溶剂系统作洗脱剂，采用十八烷基键合硅胶开口柱进行分离，获得目标馏分；
b3)对b2)所得目标馏分进行高效液相纯化，得到化合物3-6；
(7)对目标馏分III进行分离纯化得到化合物7-9，通过以下步骤实现：
c1)先后以正己烷与三氯甲烷、三氯甲烷与甲醇溶剂系统作洗脱剂，采用硅胶开口柱进行分离，获得目标馏分；
c2)对c1)所得目标馏分进行高效液相纯化，得到化合物7-9；
(8)对目标馏分IV进行分离纯化得到化合物10-11，通过以下步骤实现：
d1)以三氯甲烷与甲醇溶剂系统作洗脱剂，采用硅胶开口柱进行分离，获得目标馏分；
d2)对d1)所得目标馏分以甲醇与水溶剂系统作洗脱剂，采用十八烷基键合硅胶开口柱进行分离，获得目标馏分；
d3)对d2)所得目标馏分进行高效液相纯化，得到化合物10和11。
3.根据权利要求2所述的一种葫芦烷型三萜化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤(5)中的步骤a1)，将甲醇与水溶剂系统按照体积比70:30、73:27、75:25、77:23、80:20、83:17、85:15、100:0依次洗脱，获得目标馏分；步骤a2)中，将二氯甲烷与甲醇溶剂系统按照体积比100:0、99:1、98:2、97.5:2.5、95:5、90:10、0:100依次洗脱，获得目标馏分；步骤a3)中对目标馏分进行HPLC纯化的条件如下：C30-UG-5(10ID×250mm,Nomura Chemical)，流动相为乙腈:水＝90:10，流速为3mL/min，检测波长为210nm，得到化合物1：1.0mg，tR＝30.7min和化合物2：4.6mg，tR＝33.5min。
4.根据权利要求2所述的一种葫芦烷型三萜化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤(6)中的步骤b1)，将三氯甲烷与甲醇溶剂系统按照体积比100:0、98:2、95:5、90:10、0:100依次洗脱，获得目标馏分；步骤b2)中，将甲醇与水溶剂系统按照体积比70:30、75:25、80:20、90:10、100:0依次洗脱，获得目标馏分；步骤b3)中对目标馏分进行HPLC纯化的条件如下：C30-UG-5，10ID×250mm,Nomura Chemical，流动相为乙腈:水＝62:38，流速为3mL/min，检测波长为210nm，得到化合物3：10.6mg，tR＝15.9min，化合物4：1.8mg，tR＝17.1min，化合物5：1.9mg，tR＝18.7min和化合物6：3.2mg，tR＝30.5min。
5.根据权利要求2所述的一种葫芦烷型三萜化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤(7)中的步骤c1)，溶剂系统为正己烷:氯仿＝50:50、30:70、0:100；氯仿:甲醇＝97:3、95:5、90:10、0:100，依次洗脱，获得目标馏分；步骤c2)中对目标馏分进行HPLC纯化的条件如下：PAKC18，10ID×250mm,CAPCELL，流动相为乙腈:水＝63:37，流速为3mL/min，检测波长为210nm，得到化合物7：10.2mg，tR＝20.2min，化合物8：4.9mg，tR＝22.9min和化合物9：1.3mg，tR＝32.0min。
6.根据权利要求2所述的一种葫芦烷型三萜化合物的提取方法，其特征在于，所述步骤(8)中的步骤d1)，将三氯甲烷与甲醇溶剂系统按照体积比100:0、100:1、100:2、100:3、100:5、90:10、0:100依次洗脱，获得目标馏分；步骤d2)中，将甲醇与水溶剂系统按照体积比90:10、95:5、100:0依次洗脱，获得目标馏分；步骤d3)中对目标馏分进行HPLC纯化的条件如下：PAKC18，10ID×250mm,CAPCELL，流动相为乙腈:水＝60:40，流速为3mL/min，检测波长为210nm，得到化合物10：5.0mg，tR＝28.7min和化合物11：8.0mg，tR＝33.8min。
7.一种如权利要求1所述的葫芦烷型三萜化合物在制备抗阿尔兹海默症药物中的应用，其特征在于，所述葫芦烷型三萜化合物为化合物1-11。
8.一种如权利要求1所述的葫芦烷型三萜化合物在制备抗阿尔兹海默症保健品中的应用，其特征在于，所述葫芦烷型三萜化合物为化合物1-11。
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