KR100449245B1 - 맥문동 추출물을 포함하는 신경성 질환 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신경세포 성장을 증가시키고, 신경성장인자와 유사작용을 가짐으로써 신경세포보호 활성을 갖는 맥문동 추출물을 포함하는 신경성 질환 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 맥문동 추출물을 포함하는 신경성 질환 치료용 조성물은 신경자멸을 억제하고, 손상된 신경세포를 재생시킬 수 있는 신경성장인자(Nerve growth factor, NGF)와 작용이 유사할 뿐 아니라 독성이 없으므로, 신경세포의 사멸에 의해 발생되는 신경성 질환을 효과적으로 예방 및 치료하는데 사용될 수 있다.

Description

맥문동 추출물을 포함하는 신경성 질환 치료용 조성물{COMPOSITION CONTAINING LIRIOPE PLATYPHYLLA HAVING TEATMENT EFFECT FOR NERVOUS DISEASES}

본 발명은 신경성 질환 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신경성장인자와 유사작용을 가짐으로써 신경보호 활성을 갖는 맥문동 추출물을 포함하는 신경성 질환 치료용 조성물에 관한 것이다.

맥문동(麥門冬)은 백합과(Liliaceae)의 식물로 오피오포곤 자포니커스(OPHIOPOGON JAPONICUS) 또는 리리오페 플라티필라(Liriope platyphylla)이다(전국한의과대학 본초학교수, 본초학, 서울 영림사 pp589-590).

1968년에 카토(Studies on the constituents of Ophiopogon Tuber isolation of steroidal glycosides from tuber of Ophiopogon japonicusKer-Gawler var. genuinus. Yakugaku zasshi, 1968, 88 (6):710-4 )는 맥문동에서 시토스테롤(sitosterol), 스티그마스테롤(stigmasterol), 루스코제닌(ruscogenin, 5-spiro-stene-1,3-diol)을 비당부로 하는 스테로이달 사포닌인오피오포고닌(ophiopogonin) A, B, C, D를 분리하였고, 와타나베(Comparative studies on the constituents of ophiopogonis tuber and its congeners. VIII. Studies on the glycosides of the subterranean part of Ophiopogon japonicus Ker-Gawler cv. Nanus. Chem Pharm Bull (Tokyo). 1993 Mar;41(3):566-70)가 비당부 사포닌인 3종의 오피오포고닌 B', C', D'를 분리하였다. 우리나라의 밀양 지역에서 재배중인 재래종 괴근 성분은 단백질 1.8 %-2.6 %, 전당함량 64.4-77 %, 천연 아포논(crude aponon)이 1.1-1.5 %이고, 수집종에 따른 차이는 보이지 않으나 재배방법에 따라 그 성분의 차이가 나타난다고 보고되고 있다.

맥문동은 항산화 작용이 있고, 관상동맥의 혈류량 촉진과 심장 근육의 허혈증에 대한 보호작용이 현저하며, 진정작용을 나타낸다. 또한 면역증강 작용이 있고, 혈당을 내리며 백색 포도상구균과 대장균으로부터 항균작용을 보인다. 또한 최근 연구 보고에 따르면 맥문동이 주약으로 포함된 生脈散(인삼,Panax ginsengC. A. Meyer; 맥문동,Ophiophogon japonicusKer-Gwal; 오미자,Schisandra chinensisBail)은 신사구체 경화증 치료제(Peng, 2000). 국소빈혈(ischemia) 치료제, 강심제 등으로 사용되고 있다.

또한 맥문동 물 추출물과 알코올 추출물은 혈당을 내려가게 하고, 항암, 간 기능증진이 있음이 보고되었으며, 이의 활성 성분인 스피카토시드 B(Spicatoside B)는 폐암, 난소암, 악성흑색종, 중추신경계암, 결장암의 암세포에 대한 생장억제 활성을 가진다고 보고되고 있다(중약대사전, 1990). 그러나 맥문동의 신경세포 보호작용에 대해서는 전혀 알려진 바가 없다.

한편, 신경세포의 성장(growth), 분화(differentiation) 및 사멸 (cell death)은 각기 정상적인 발생, 조직의 고유한 기능 확립 및 항상성 유지를 조절하는 과정이다. 신경세포의 사멸은 두 가지 형태로 일어나는데 세포자멸(apoptosis)과 세포괴사(necrosis)가 있다. 신경세포괴사는 세포질과 미토콘드리아의 팽창 그리고 세포질의 용해 후 핵막의 파괴에 의해 유도되는데, 국소빈혈(ischemic), 저체온(hypothermia), 외상(trauma)이나 뇌졸중, 물리적 또는 화학적 외상과 같은 갑작스러운 상해에 의해 세포가 죽는 급성 사멸을 말한다(Tomei LD, Cope FO (1991) Apoptosis: The molecular basis of cell death. Cold Spring Harbor Labolatory press New York). 또한 신경세포괴사는 단백질 합성억제제에 의하여 영향을 받지 않으며 신경계에 일어나는 대표적인 신경세포괴사는 신경세포가 이온성 글루탐산 수용체의 활성화에 의해 손상을 입을 때 나타난다. 반면에 세포자멸은 예정화된 사멸이라고도 하는데, 특징적 형태는 세포 크기의 축소(cell shrinkage), 세포막팽창(membrane blebbing), 세포골격의 붕괴와 같은 막의 변화와 염색질응축 등과 같은 핵의 변화를 수반한다.

신경세포의 성장, 분화 및 사멸을 조절하는 것이 신경조절인자로, 중추신경(Central Nervous System, CNS)과 말초신경(Pheriperal Nervous System. PNS)에서 뉴론의 성장, 분화 및 생존에 영향을 미치는 단백질을 모두 신경성장인자(NGF; nerve growth factor)들이라 한다. 신경성장인자는 뇌유래 신경성장인자(BDNF; Brain-derived neurotrophic factor), 신경인자 (NT-3; Neurotrophin-3), NT-4, NT-5 등이 있다. 이러한 신경인자들은 합성하는 곳이나분화, 발현되는 양상이 다르고 표적장소가 다르다. 신경인자는 신경세포사멸을 억제하며, 이는 신경인자의 결핍에 의한 단백질의 합성(cell death related genes)에 의존하는 세포사멸을 발생시킨다.

신경성장인자(NGF)는 레비몬탈치니(Levi-Montalcini)가 분리하였고, 병아리 교감신경절 뉴론의 뉴론축색 성장을 촉진시킨다고 보고되었다. 과거에 신경성장인자는 뉴론의 분열을 촉진하는 것으로 생각되었으나, 현재는 뉴론의 퇴화 사멸을 억제함으로써 뉴론의 숫적 감소를 방지하고 있는 것으로 알려져 있다.

또한 신경성장인자는 중추신경계에서 신경세포의 손상을 보호하는 작용을 하고(Nerve growth factor promotes survival of septal cholinergic neurons after fimbrial transections.J Neurosci.1986 Aug;6(8):2155-62), 성숙한 신경원 유지에 중요한 역할을 한다(Levi-Montalcini R, Booler B (1960) Destruction of the sympathetic ganglia in mammals by an antiserum to a nerve growth protein. Proc Natl Acad Sci USA 46:384-391).

신경계의 정상적인 발생 과정 중 발생중인 뉴론의 약 50 %는 세포사멸에 의해 제거되며(Programmed cell death and the control of cell survival: lessons from the nervous system.Science. 1993 Oct 29;262(5134):695-700), 표적 세포에 의해 분비되는 신경인자들이 뉴론의 생존을 결정한다고 알려져 있다. 신경세포가 정상상태에서 생존, 성장, 분화하기 위해서는 신경성장인자와 같은 성장인자들이 필수적으로 요구된다고 할 수 있다. 그러나 이러한 신경성장인자는 분자량이 크기 때문에 뇌에서의 BBB(Blood brain barier)를 통과하지 못한다. 그래서 퇴행성 뇌질환에 있어서 치료효과를 보기가 어렵게 되어있다. 이에 내생하는 신경성장인자의 합성을 유도할 수 있으며, 신경성장인자와 같은 역할을 하는 물질의 개발이 요구되는 실정이다.

따라서, 본 발명은 신경세포사멸을 억제하고, 신경성장인자의 합성을 증가시키는 신경성 질환 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1은 맥문동 메탄올 추출물 및 맥문동 분획들에 의한 PC12 세포의 신경축색돌기 길이 성장을 나타낸 그래프이고,

도 2는 신경성장인자의 농도에 따른 PC12 세포의 신경축색돌기의 길이 성장을 나타낸 그래프이고,

도 3은 맥문동 부탄올 분획에 의한 PC12 세포의 신경축색돌기의 길이 성장을 나타낸 그래프이고,

도 4는 신경성장인자에 의한 세포의 형태학적 변화를 나타낸 사진이고,

도 5는 맥문동 부탄올 분획에 의한 세포의 형태학적 변화를 나타낸 사진이고,

도 6은 맥문동 부탄올 분획에 의한 세포생존율을 LDH로 측정한 그래프이고,

도 7은 맥문동 부탄올 분획이 세포사멸을 억제하는 것을 나타낸 사진이고,

도 8은 맥문동 부탄올 분획을 제거하였을 때 발생되는 세포자멸을 측정한 FACS 그래프이고,

도 9는 맥문동 부탄올 분획에 의한 신경성장인자 유전자 발현을 확인한 그래프이고,

도 10은 맥문동 부탄올 분획에 의한 신경성장인자 수용체의 발현을 웨스턴 블롯으로 확인한 사진이고,

도 11은 맥문동 부탄올 분획에 의한 신경성장인자 수용체의 발현을 면역세포화학염색법으로 확인한 사진이고,

도 12는 맥문동 부탄올 분획물이 수동적 인지기능을 증가시킨 것을 나타낸 그래프이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 맥문동 추출물을 포함하는 신경성 질환 치료용 조성물을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들이 광범위한 연구를 수행한 결과 맥문동 추출물이 신경성장인자와 유사한 작용을 갖기 때문에 신경세포 사멸을 억제하고 신경성장 인자의 합성을 증가시킴을 확인하였다.

본 발명에 사용되는 맥문동으로는 백합과 식물인 맥문동(Liripe platyphylla) 및 소엽맥문동(OPHIOPOGON JAPONICUS)이 바람직하게 이용될 수 있다.

본 발명의 맥문동 추출물은 탄소수 1 내지 5의 저급알콜, 물 및 유기용매로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되어진 용매를 이용하여 추출하는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하기로는 본 발명의 맥문동을 분쇄하여 상기 용매로 추출한 후 감압농축, 건조하여 제조된다. 상기 추출용매는 헥산, 메탄올, 에탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부탄올, 클로로포름 및 증류수로 이루어진 군으로부터 1종 이상선택된 용매가 바람직하게 사용될 수 있다. 추출방법은 통상의 식물 추출방법이 바람직하며, 가장 바람직하게는 초음파 추출법 또는 층분리이다.

본 발명의 맥문동 추출물은 신경세포의 분화 및 성장을 유도하고, 신경세포의 생존을 유지시킨다. 이러한 역할은 체내에서 합성되는 신경성장인자에 의해 수행되는 것으로, 상기 신경성장인자로는 뇌유래 신경성장인자(BDNF; Brain-derived neurotrophic factor), 신경인자 (NT-3; Neurotrophin-3), NT-4 및 NT-5 등이 있다. 본 발명의 맥문동 추출물은 신경성장인자의 역할을 수행할 수 있다.

또한 본 발명의 맥문동 추출물은 체내 신경성장인자 단백질 및 신경성장인자 수용체의 합성을 증가시킨다.

따라서, 본 발명의 맥문동 추출물은 신경세포의 성장, 분화 및 생존에 관련된 신경성 질환을 치료할 수 있는 치료제로 사용할 수 있다. 특히 신경세포 사멸에 의해 발생되는 뇌질환 치료 및 예방제로, 뇌졸증, 파킨슨, 노인성 치매 또는 알쯔하이머를 치료 및 예방하기 위한 용도로 사용가능하다.

본 발명의 맥문동 추출물을 포함하는 신경성 질환 치료용 조성물은 맥문동 추출물을 0.1 내지 20 중량%로 포함하는 것이 바람직하다. 또한 상기 조성물은 정제, 캅셀제, 용액제, 현탁제 또는 시럽제로 제조하는 것이 바람직하며, 제형에 따라 통상의 부형제를 더욱 포함하는 것이 바람직하다. 정제는 전분, 유당 등의 분말상 흡습제를 포함하고, 흡습을 방지하기 위하여 산화마그네슘을 포함하는 것이 좋다. 용액제는 물, 알코올 프로필렌글리콜, 글리세린 또는 생리식염수 등에 용해시키는 것이 좋으며, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한 상기 조성물은 제형에 따라 투여방법이 용이하게 결정될 수 있다. 바람직하게는 경구투여, 피부, 근육, 정맥 등을 통한 비경구 투여 등이 있다.

본 발명의 맥문동 추출물의 투여용량은 질환의 중증도, 투여대상 환자의 성별, 연령, 체중, 및 목적하는 효과가 어떤 것인지에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로는 성인에게 경구 투여하는 경우, 체중 1 kg 당 1 일 5 mg 내지 500 mg을 하루에 1-3회로 나누어 투여할 수 있고, 바람직하게는 100 mg 내지 250 mg 의 용량으로 투여할 수 있다.

[실시예 1] 맥문동 추출물의 제조

건조된 맥문동(Liriope platyphylla) 3 kg을 분쇄하고, 85 %의 메탄올 1 ℓ를 가한 후 3회 반복하여 초음파 추출하였다. 추출액은 여과한 다음 감압농축 및 건조하여 맥문동 메탄올 추출물 315 g을 수득하였다(수율 0.5 %).

[실시예 2]

상기 맥문동 메탄올 추출물 중 200 g을 취하여 3차 증류수 1 ℓ에 현탁한 에틸아세테이트(1 ℓ)를 혼합하고, 층분리하여 에틸아세테이트 분획을 수득하고, 남은 분획물에 부탄올 1 ℓ을 혼합하여 다시 층분리하였다. 이에 분리된 부탄올 분획 및 물 분획을 각각 수득하였다. 상기 3종의 분획은 감압농축 및 건조하여 에틸아세테이트 분획물 11.83 g, 부탄올 분획물 8.2 g 및 물 분획물 26 g을 수득하였다.

[실시예 3]

상기 실시예 2의 맥문동 부탄올 분획 중 5 mg을 플래시 HP-20 시스템(flashHP-20 system)에 전개한 후 100 ㎖의 물, 물 : 메탄올 혼합용매(2 : 1 -> 1 : 1) 500 ㎖, 및 메탄올 800 ㎖ 순으로 유출시키고, 5 ㎖씩 수집하였다. 각 유출액을 박층 크로마토그래피(TLC)상에 전개시켜 9개의 소분획물을(Fra1-Fra9)을 수득하였다. 9개의 소분획물은 맥문동 추출물과 부탄올 분획물과 동일한 용도로 사용할 수 있고, 이러한 효과를 나타내는 물질이 고농도로 존재하고 있기 때문에 용량을 감소시키거나 혹은 같은 용량으로 더 높은 생리활성을 나타낼 수 있다.

[실시예 4]

실시예 1의 맥문동 메탄올 추출물과 실시예 2의 맥문동 분획물들(에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획, 물 분획)을 각각 PBS(Phosphate buffered saline pH 7.2) 완충용액에 용해시켜 최종농도가 1.0 ㎎/㎖이 되도록 한 후 1회용 주사기를 이용한 막여과지(0.2 ㎛, millipore)로 여과하여 무균화하였다. 상기 시료가 PBS 완충용액에 완전히 용해되지 않을 경우 DMSO(dimetyl sulforoxide, Sigma, U.S.A)에 녹여 DMSO의 최종농도가 0.1 % 이하가 되도록 맞춘 후 무균화하였고, 이를 감압농축한 다음 분말화하였다.

[실시예 5]

소엽맥문동(Ophiopogon japonicus)을 구입하여 상기 실시예 1 및 실시예 4와 동일한 방법으로 추출물을 제조하였다.

[실시예 6] 정제 제조

상기 실시예 4의 맥문동 메탄올 추출물 250 ㎎을 부형제로 락토즈 260 ㎎과 아비셀(미결정 셀룰로오스) 35 ㎎, 용해보조제로 나트륨 전분 글리코네이트 15 ㎎,결합제로 L-HPC(Low- hydroxypropylcellulose) 80 ㎎을 섞어 U 형 혼합기에 넣고 20 분간 혼합하였다. 혼합완료 후 활탁제 마그네슘 스테아레이트 10 ㎎를 추가로 넣고 3 분간 혼합하였다. 정량시험과 항습도 시험을 거쳐 타정하고 필름 코팅하여, 1 정당 맥문동 추출물 250 ㎎을 함유하는 정제를 제조하였다.

또한 상기 실시예 4의 맥문동 부탄올 분획 분말 250 mg을 상기의 방법으로 정제로 제조하였다.

[실시예 7] 시럽제 제조

일정량의 물에 적당량의 백당을 용해시키고, 여기에 보존제로서 파라옥시메틸벤조에이트 80 ㎎ 및 파라옥시프로필벤조에이트 16 ㎎을 가하고 실시예 4의 맥문동 메탄올 추출물 4.5 g을 넣어 60 ℃로 유지시켜 완전히 용해시킨 후 냉각시키고 증류수를 가해 150 ㎖로 만들어 시럽제를 제조하였다.

[실시예 8] 캅셀제 제조

상기 실시예 4의 맥문동 메탄올 추출물 300 ㎎을 담체로서 락토즈 200 ㎎과 혼합시킨 후 경질 젤라틴 캅셀에 충진하여 캅셀제를 제조하였다.

[실험예]

상기 실시예 4의 맥문동 메탄올 추출물 및 맥문동 분획들(맥문동 부탄올 분획, 맥문동 에틸아세테이트 분획, 맥문동 물 분획)이 신경세포의 성장 또는 분화에 미치는 영향을 확인하였다.

(1) 세포주

실험에 사용된 세포주는 신경유사세포주(PC12)와 신경성상세포주(C6)이다.상기 PC12는 소태아혈청이 포함된 배지에서 분열하며, 신경성장인자가 포함된 배지에서 신경축색 성장(신경분화)을 보이나, 신경성장인자 및 소태아혈청이 없거나 고갈된 상태에서 세포사멸로 죽고, 이러한 세포사멸은 신경성장인자에 의해 억제되는 특징을 가지고 있다. 상기 C6는 신경성장인자의 합성을 유도하여 분비하는 세포주이다.

상기 세포의 배양은 완전배지(2.0 g/ℓ의 소듐 바이카보네이트, 5 %의 말혈청(HS), 10 %의 소태아혈청(FBS) 및 1 %의 페니실린-스트렙토마이신 항생제(10000 U/㎖)가 포함된 RPMI 1640 배지)에서 실시하였고, 상기 소태아혈청은 사용하기 전 55 ℃에서 30분간 비활성화시켜 사용하였다. 배양조건은 70 % 습도, 37 ℃, 혼합기체(O₂:CO₂= 95 %:5 %)이고, 배지는 10 ㎖씩 주 4회 교체해 주면서 주 1∼2회 계대 배양하였다.

실험에 대조군으로 사용된 신경성장인자는 NGF(nerve growth factor, Gibco BRL)에서 구입하여 사용하였다.

실험예 1

PC12 3x10⁴를 직경 100 mm의 배양용기(TPP, Switzerland)에 접종하고 완전배지에서 배양하였다. 배양한 1x10⁷cells/well의 세포들은 0.25 % 트립신-EDTA (Gobco BRL, USA)용액 500 ㎕를 처리하여 배양용기로부터 이탈시킨 후, 10 ㎖의 신선한 배지를 혼합하여 세포현탁액을 만들었다. 세포현탁액 20 ㎕에 0.4 % 트립판 블루를 포함하는 PBS 완충용액 10 ㎕을 혼합하여 염색한 후 세포수 측정기에서 살아있는 세포수를 계산하였다.

세포부착효소인 폴리-D-라이신(Sigma)을 50 ㎍/㎖로 PBS 완충용액에 희석한 다음, 6웰 세포 배양접시에 2 ㎖씩 첨가하여 37 ℃에서 1시간 방치하였다. 상기 세포를 PBS 완충용액(pH 7.2)로 세척하고, 1X10⁵cells/well의 농도로 희석하여 상기 배양접시에서 24시간 배양하였다.

상기 실시예 4의 맥문동 메탄올 추출물 및 맥문동 분획들(에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획, 물 분획) 각각을 10 ㎍/㎖로, 신경성장인자 50 ng/㎖을 각각 세포에 처리하고, 대조군으로 무처리군을 따로 두었다. 세포배양하면서, 2일마다 시료를 포함하는 배지로 교체하였다.

(1) 신경축색돌기성장 측정

배양 24시간이 지난 후부터 매일 일정한 시간에 실험군 당 10개의 세포를 무작위로 선정하여 위상차 현미경으로 세포체로부터 뻗은 신경축색돌기를 관찰하였고, 현미경 사진을 찍은 후에 사진상에서 그 길이를 측정하여 수치화하였다.(신경축색돌기 길이: 0 - 신경축색돌기가 보이지 않음, 1 - 세포중심체와 길이가 같음, 2 - 세포중심체 지름의 2배길이임, 3 - 세포중심체 지름 이상의 길이임) 또한 무처리군의 신경축색돌기 성장을 100 %로 하고, 각 실험군의 성장률을 평균+표준편차로 환산하였다. 그 결과는 하기 표 1에 기재되어 있다.

시료	신경축색돌기의 비율
대조군	100 %
신경성장인자	133+0.21 %(p<0.01)
맥문동 메탄올 추출물	146+0.10 %(p<0.01)

도 1은 맥문동 메탄올 추출물에 의한 PC12 세포주의 신경축색돌기 성장 길이를 나타낸 그래프이다. 1은 맥문동 부탄올 분획(10 ㎍/㎖), 2는 맥문동 에틸아세테이트 분획(10 ㎍/㎖), 3은 맥문동 물 분획(10 ㎍/㎖), 4는 맥문동 메탄올 추출물(10 ㎍/㎖)), 5는 신경성장인자(50 ㎍/㎖)), 6은 대조군이다. 그 결과, 신경성장인자 또는 맥문동 추출물들(메탄올 추출물, 에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획, 물 분획)은 신경축색돌기의 분화 및 성장을 유도하였으며, 특히 맥문동 부탄올 분획의 효과가 가장 우수하였다.

또한 상기와 동일한 실험방법으로 다양한 농도의 신경성장인자 처리군(2 ng/㎖, 5 ng/㎖, 10 ng/㎖, 30 ng/㎖, 50 ng/㎖)과 다양한 농도의 맥문동 부탄올 추출물 처리군(1 ㎍/㎖, 5 ㎍/㎖, 10 ㎍/㎖)의 신경축색성장정도를 비교하였다. 도 2는 신경성장인자 처리군의 신경축색돌기의 성장을 나타낸 것으로, 신경성장인자(NGF)의 농도에 비례하여 신경축색돌기가 성장함을 확인할 수 있었다. 또한 맥문동 부탄올 분획을 처리한 군은 도 3의 결과 같이 맥문동 부탄올 분획('MB'라 표기) 처리농도에 비례하여 신경축색돌기가 성장함을 확인할 수 있었다.

또한 맥문동의 부탄올 분획물(MB)을 처리한 세포에서는 신경성장인자에 비하여 부탄올 분획물에 의한 신경축색돌기의 성장이 촉진됨을 할 수 있었다. 즉, 신경성장 50 ng/ml을 처리한 세포군에서 보다 맥문동 부탄올 분획물 10 ㎍/㎖을 처리한 세포군이 신경축색돌기가 길게 측정되었다.

실험예 2

상기 실험예 1과 동일한 방법으로 PC12를 배양한 다음 소태아혈청고갈 배지, 즉 완전배지에서 소태아혈청을 제거한 배지에 신경성장인자(0, 2, 10, 30, 50 ng/ml) 또는 맥문동 부탄올 분획(10 ㎍/㎖)을 혼합한 다음 PC12에 처리하였다. 또한 대조군으로 소태아혈청고갈 배지에 PC12를 배양하였다. 세포배양을 6일간 배양한 후 배양용기에 자라고 있는 세포를 현미경상에서 관찰하고 세포사진을 촬영하였다.

신경성장인자 처리군의 세포사진은 도 4에 나타내었고, 맥문동 부탄올 분획 처리군의 세포사진은 도 5에 나타내었다. 도 4의 대조군(1)은 세포질이 변화되었고 핵이 응축되어 식별되었으나 신경성장인자 처리군(2, 3, 4, 5)은 농도가 증가할수록 신경축색돌기가 길게 성장함을 확인할 수 있었다. 즉 소태아혈청이 고갈된 배지에서 PC12는 세포사멸현상을 나타내지만 신경성장인자로 인하여 세포사멸이 저해됨을 다시 확인한 것이다.

도 5의 맥문동 부탄올 분획 처리군(B)는 소태아혈청이 고갈된 배지에서 배양한 대조군(A)의 세포사멸현상이 발견되지 않았고, 신경성장인자를 처리한 군(C)과 동일한 신경축색돌기의 성장이 관찰되었다. 즉 맥문동 부탄올 분획은 신경세포의 세포사멸을 억제하고, 신경축색돌기의 분화를 촉진함을 알 수 있었다.

실험예 3

PC12 세포를 완전배지에서 배양한 후 소태아혈청과 신경성장인자가 첨가되지 않은 배지로 교체하고, 세포를 추가 배양함으로써 세포자멸을 유도하였다. 그 후 PC12에 맥문동 분획물을 첨가하여 배양하면서 시간에 따른 세포의 형태적 변화 및세포사멸 발생유무를 확인하였다.

(1) LDH(lactate dehydrogenase) 검정

세포막이 상해를 입게 되면 사이토졸내에 존재하는 LHD효소가 밖으로 유출된다. 그러므로 세포가 상해를 입게 되면 점진적으로 배지밖으로 LDH가 유리됨으로써 증가되어 결국에는 세포사와 양적인 상관관계를 이루게 된다.

맥문동 메탄올 추출물, 맥문동 부탄올 분획, 맥문동 에틸아세테이트 분획 또는 신경성장인자를 PC12 세포처리하고 6일간 배양하였다. 각 배지를 30 ㎕씩 채집하여 96웰 플레이트에 두고 4 ℃에 보관하고 부탄올 분획물이 포함된 배지를 제거한 다음, 부탄올 분획물이 첨가되지 않은 새로운 배지로 교체하고 24시간 배양하였다. 배양후 다시 배지 30 ㎕를 취하여 96 웰 플레이트에 옮겼다. 이 실험은 맥문동의 부탄올 분획물을 처리한 후 세포생존률 변화와 제거한 후 세포생존률의 변화를 관찰하기 위하여 실시한 것이다.

LDH 검정을 실시하기 위하여, 배지가 있는 96 웰 플레이트에 NADH(β-Nicotinamide adenine dinucleotide, Sigma, USA) 용액(NADH 1.0 ㎎ + 0.75 소듐 피루베이트 1 ㎖) 30 ㎕을 넣고, 37 ℃ 배양기에서 30분간 반응시킨 후 발색시약(2,4-dinitrophenylhydrazine; Sigma, USA) 30 ㎕을 첨가하여 37 ℃에서 20분간 반응시켰다. 상기 반응액에 0.4 N NaOH 100 ㎕를 가하여 반응을 멈춘 뒤 5분 후에 405 nm파장에서 UV 흡광도를 측정하였다. UV 흡광도는 변형된 Koh 방법(Koh JY and Choi DW, 1987, Quantitative determination of glutamate mediated cortical neuronal injury in cell culture by lactate dehydrogenaseefflux assay.J Neurosci Methods. 1987 May;20(1):83-90)으로 LDH 생성량으로 환산한 결과, 맥문동 부탄올 분획물 또는 신경성장인자를 제거한 세포에서 LDH 생성량이 감소함을 알 수 있었다.

(2) MTT 검정

96 웰 플레이트에 PC12 세포 2 x 10⁴cells/well를 접종하고 배양하였다. 24시간 후, 시료(맥문동 부탄올 분획, 10 ㎍/㎖)를 포함하고, 소태아 혈청은 고갈된 배지를 PC12에 처리하고 2일간 배양하였다. 배양 후, 맥문동 분획물이 포함된 배지를 제거하고, 최종 농도 0.05 ㎎/㎖로 MTT(3-[4,5-Dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl teterazolium bromide, Sigma)를 맥문동 분획물과 소태아 혈청이 제거된 순수한 RPMI 배양 배지에 녹여서 150 ㎕을 세포에 처리한 다음 37 ℃ 배양기에서 4시간 동안 반응시켰다. MTT를 제거하고 각 웰에 DMSO 150 ㎕씩을 첨가하여 결정을 용해시켰다. 용해물은 ELISA 리더로 570 nm의 파장에서 UV 흡광도를 측정하였다. 신경성장인자 50 ng/㎖을 처리하였을 때 흡광도를 세포생존율 100 %로 하여 맥문동 분획물 처리한 실험군의 흡광도를 세포 생존율로 환산하였다.

도 6은 맥문동 추출물, 맥문동 부탄올 추출물, 맥문동 에틸아세테이트 추출물 및 신경성장인자를 처리하였을 때 세포생장률을 나타낸 그래프로, 시료를 처리하였을 때와 시료를 제거하였을 때의 세포생장률을 나타내었다. 도 6의 MC는 맥문동 추출물이고, ME는 맥문동 에틸아세테이트 분획물이고, MB는 맥문동 부탄올 분획물이고, P는 배양액만 처리한 것이고, N2는 신경성장인자 2 ng/㎖이고, N50은 신경성장인자 50 ng/㎖이다.

도 6의 결과로, 맥문동 에틸아세테이트 분획물 및 맥문동 부탄올 분획물을 처리한 후 제거한 세포에서 생존률이 감소하였고, 이로 맥문동이 세포사멸을 억제시킴을 알 수 있었다.

(3) 세포자멸확인

상기 결과에서, 맥문동을 제거하였을 때 관찰된 세포생존율 감소가 세포자멸에 의한 것인지 확인하였다.

세포자멸은 DNA 단편화(DNA fragmentation) 현상으로 확인하였다. 즉, 세포자멸로 인하여 DNA가 200 bp 정도의 단편으로 잘리는 것을 관찰하는 것이다.

PC12 세포 2.5∼5 x 10⁶cells/well를 100 mm 배양용기에 접종하고, 소태아혈청이 2 % 첨가된 소태아혈청 고갈배지에서 24시간 배양 후, 소태아 혈청을 완전히 제거하고, 신경성장인자도 첨가하지 않은 배지에서 배양하여 소태아혈청 결핍과 신경성장인자 결핍시 일어나는 세포자멸을 관찰하였다. 소태아혈청과 신경성장인자가 결핍된 배지에서 24시간 배양한 후, 배지를 제거하고 pH 균형을 위해서 PBS 완충액으로 세척하였다. 다시 소태아혈청이 결핍되고 시료(신경성장인자 50 ng/㎖ 또는 맥문동 부탄올 분획 10 ㎍/㎖)는 포함된 배지를 세포배양 플레이트에 넣어주고, 37 ℃ 배양기(5 % CO₂+ 95 % O₂)에서 6일간 배양하고, 2일 간격으로 시료를 포함하는 배지로 교체하였다. 소태아혈청결핍과 신경성장인자의 결핍배지로 세포자멸을 유도하였고, 유도된 세포자멸을 소태아혈청과 신경성장인자대신 맥문동 부탄올 분획이 첨가된 배지로 교체하여 배양하여 맥문동 분획이 세포자멸을 억제하여 정상적으로 세포가 생존하는 것을 관찰하였다. 이 실험을 위하여 신경자멸의 대표적인 검색방법인 DNA 단편화를 이용하여 실시하였다.

배양이 끝나고 세포를 수득한 다음 배양용기에 0.25 %의 트립신-EDTA를 1 ㎖씩 가하여서 세포를 이탈시켜 상기 배양액과 혼합하였다. 혼합물은 원심분리(1000 rpm, 5분)하여 상층액을 제거하고, 침전물에 500 ㎕의 용해완충액(5 mmol/ℓ Tris-HCl (pH 7.4), 5 mmol/ℓ EDTA, 0.5% Triton X-10)을 혼합하여 15분간 방치하였다. 이를 원심분리(12,000 rpm, 20분)하고 수득한 상층액에 RNase 1.0 ㎕를 처리한 다음 37 ℃에서 1시간 반응시켰다. 이어 프로테아제 1 ㎕와 SDS를 1 %로 가한 후 50 ℃에서 2시간 반응시켰다. 여기에 여기에 동량의 페놀-클로로포롬을 넣고 15초이상 혼합한 후 원심분리(12,000 rpm, 10분)하여 상층액을 수득하였다. 상층액에 1/10 부피의 3 M 소듐아세테이트와 2배 부피의 에탄올을 첨가하고, 상온에서 30분동안 정치한 후 원심분리(12,000 rpm, 4 ℃, 10분)하였다. 상층액을 제거하고 펠렛을 건조시킨 다음 20 ㎕ TE 완충용액을 가하여 DNA를 녹여냈다. 분리한 DNA는 10 ㎕를 전기영동하고, 단편화를 확인(Gel-DOC, photodoc system, Bio-Rad)하였다.

전기영동사진은 도 7에 나타내었다. 도 7의 A는 세포자멸하였을 때 DNA 단편화를 나타낸 것이고, B는 세포자멸이 발생되지 않았을 때의 DNA 전기영동결과이다. 레인 1은 신경성장인자 50 ng/㎖상에서 세포 배양 후 세포자멸을 유도한 세포군이고, 레인 2는 맥문동 부탄올 분획물 10 ㎍/㎖상에서 세포배양 후 세포자멸을 유도한 세포군이고, 레인 3은 완전배지에서 세포배양 후 세포자멸을 유도한 세포군이다. 또한 레인 4는 레인 1의 세포군에 신경성장인자 50 ng/㎖를 처리한 세포군이고, 레인 5는 레인 2의 세포군에 문동 부탄올 분획물 10 ㎍/㎖를 처리한 세포군이고, 레인 6은 레인 3의 세포군에 배양배지, 즉 맥문동 분획물이 첨가되지 않은 배지를 처리한 세포군이다. 도 7의 결과에서, 시료를 처리하지 않은 레인 1 내지 레인 3의 세포군은 자연사멸이 일어나 DNA가 단편화 되었음을 알 수 있었고, 반면에 시료를 처리한 레인 4 내지 레인 6의 세포군은 DNA 단편화가 일어나지 않아 자연사멸현상이 유도되지 않았음을 알 수 있다. 즉, 본 발명의 맥문동 부탄올 분획물이 세포의 자연사멸현상을 억제시킴을 알 수 있다.

(4) FACS 분석

PC12 세포를 완전배지에서 24시간 배양하고, 소태아혈청고갈된 RPMI 1640 (Gibco BRL) 배지로 교체하여 대조군으로 배양하여 세포사멸을 유도하였다. 또한 상기 교체배지에 신경성장인자 50 ng/㎖ 또는 맥문동 부탄올 분획물 10 ㎍/㎖을 각각 처리하여 배양하였다. 12시간 배양한 후 부유액이 포함된 세포현탁액을 원심분리(200g, 5분)하였다. 상층액이 제거된 세포에 100 ㎕의 아넥신 V-FITC 용액(10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 5 mM KCL, 1 mM MgCl₂, 1.8 mM CaCl₂)를 가하여 용해시킨 후 호일에 싸서 상온에서 5분 동안 배양하였다. 아넥신을 처리한 세포에 100 ㎕의 HEPES 완충용액, 20 ㎕의 PI(propidium iodide; 100 ㎍/㎖ HEPES buffer)를 혼합하여 FACS를 측정하였다.

상기 세포의 세포사멸을 분석한 FACS 결과는 도 8에 나타내었다. A는 대조군이고, B는 신경성장인자(NGF) 50 ng/㎖을 처리한 것이고, C는 맥문동 부탄올 분획물 10 ㎍/㎖을 처리한 것으로 12시간 이후에 측정한 것이다. 그래프의 하위왼쪽은 살아있는 생존 세포를 나타내며, 하위오른쪽은 세포자멸(apoptosis)을 나타내며 상위오른쪽은 세포사멸(necrosis)을 나타낸다. 그래프에 표시된 수치는 세포자멸(apoptosis)가 일어난 세포를 전체 검색한 세포의 비로 나타낸 것이다. 수치가 클수록 세포자멸(apoptosis)이 일어나 세포가 많은 것이다.

따라서, 도 8에서 맥문동 부탄올 분획물을 배양액에서 제거하면 세포자멸이 일어남을 알 수 있었다.

실험예 4

실시예 4의 맥문동 메탄올 추출물 및 맥문동 분획들(에틸아세테이트 분획, 부탄올 분획, 물 분획)에 의한 신경성장인자 유전자의 발현유도현상을 확인하기 위한 실험을 실시하였다.

(1) 리보뉴클레오타이드 (RNA) 분리

C6 아스트로사이트(astrocyte) 세포주는 신경성장인자를 비롯한 다양한 성장인자를 분비, 합성하는 뇌세포의 구성세포 중 하나이다. 그러므로 맥문동 부탄올 분획물이 C6세포에서 신경성장인자의 합성을 유도하는지 알아보기 위하여 C6세포를 100 mm의 세포배양접시에 배양하고, 소태아 혈청이 결핍된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 배지에서 24시간 배양한하였다. 배지를 제거하고 맥문동 부탄올 분획물(10 ㎍/㎖)이 첨가되고, 신경성장인자와 소태아혈청이 제거된 배지에서 12시간 배양하였다. 상층액을 제거하고 PBS 완충용액으로 세척한후, 1 ㎖의 트리졸 B 용액(Gibco BRL)을 세포에 처리하고 세포 용해물 1.5 ㎖을 21G 주사기상에서 균질화시켰다. 세포 용해물을 원심분리(4 ℃, 12,000 rpm, 10분)하고, 상층액에 동량의 클로로포롬을 첨가한 다음 15분 동안 상온에 방치한 후 원심분리(4 ℃, 12,000 rpm, 15분)하였다. 상층액(RNA)은 동량의 100 % 이소프로필 알코올에 혼합하고 15분동안 상온에 방치한 후 원심분리(4 ℃, 12,000 rpm, 15분)하였다. 상층액을 제거하고 얻은 RNA 침전물에 1.0 ㎖ 75 % 에탄올로 세척하고 건조시킨 후, 100 ㎕의 DEPC (diethylpyrocabonate) 용액에 용해시켰다. 용해물은 흡광도측정기(Bio-Rad, U.S.A.)를 사용하여 UV 260 nm와 240 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다.

(2) RT-PCR

상기에서 정제한 RNA에서 신경성장인자를 증폭시켰다. 서열번호 1/서열번호 2의 프라이머로 RT-PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)하였고, PCR 반응조건은 하기 표 3과 같다.

1 ㎍의 RNA는 반응용액(4 ㎕ 5 x 완충용액, 1 ㎕ 10 mM deoxynucleotide mixture, 1 ㎕ 20 uM oligo(dt)₁₅primer, 0.2 ㎕ 200 U/㎕ M-㎖V Reverse transcriptase, 2 ㎕ 0.1 M dithiothreitol, DEPC water로 최종부피 20 ㎕로 제조)상에서 PCR 하여 DNA를 합성하였다. 합성한 1 ㎕ DNA는 반응용액(10 x 완충용액, 2.5 ㎕, 2.5 mM Deoxynuclotide mixture 2 ㎕, 5 U/㎕Taq중합효소, 0.2 ㎕, 10 uM sens primer 1 ㎕, 10 uM anti-sens primer 1 ㎕, DEPC water로 최종부피 25 ㎕로 만듬)상에서 PCR(Perkin Elmer, U.S.A.)하여 870 bp의 신경성장인자 유전자를 증폭시켰다. 또한 대조군으로 서열번호 3/서열번호 4의 프라이머로 GAPDH 307 bp를 증폭시켰다.두 증폭실험의 조건은 표2와 같다.

전처리	95 ℃	3분	1 cycle
변성	95 ℃	30초	30 cycles
결합	62 ℃	30초
증폭	72 ℃	1분
후처리	72 ℃	7분	1 cycle

(3) 전기영동

1.5 % 한천젤(Gibco BRL)에 10 ㎕의 PCR 산물을 전기영동하고, EtBr(ethidium bromide)으로 염색하여 GEL-DOC(photodoc system, Bio-Rad)상에서 전기영동사진을 촬영하였다. 상기 전기영동사진은 도 9에 나타내었다. 도 9는 신경성장인자의 유전자 발현량을 나타낸 전기영동사진(A)과 이를 정량화하여 수치로 표시한 그래프(B)이다. M은 기준크기를 표시하고, 1은 신경성장인자 50 ng/㎖, 2는 맥문동 메탄올 추출물 10 ㎍/㎖, 3은 맥문동 부탄올 분획물 10 ㎍/㎖, 4는 배양액만 처리한 것이고, 하기 패널은 GAPDH의 PCR 결과이다. 도 9의 결과로 맥문동 메탄올 추출물 또는 맥문동 부탄올 분획물이 신경성장인자 유전자의 발현을 촉진시킴을 알 수 있었다.

실험예 5

맥문동이 신경성장인자 수용체인 p75 수용체 발현에 미치는 영향을 알아보기 위하여 실시하였다.

(1) 웨스턴 블롯

소태아혈청이 고갈된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium)배지 하에서 12시간 동안 C6 세포를 배양시킨 다음 1 % 소태아혈청 (FBS), 2 % 말혈청 (HS)이 첨가된 새로운 배지로 교체하면서 맥문동 부탄올 분획물을 10 ㎍/㎖로 처리하였다. 대조군은 신경성자인자를 50 ng/㎖의 농도로 처리하였다. 시료를 처리한 지 24시간 후에 배지를 제거하고 세포용해완충용액으로 세포를 용해시킨 다음 균질화하였다. 균질물은 원심분리(12,000 rpm, 10분)하고, 상층액을 웨스턴 블롯의 시료로 사용하였다.

상층액의 단백질을 정량하고 단백질 30 ㎍/㎖를 7 % SDS 폴리아크릴아마이드 젤상에서 전기영동하고, 분리된 단백질을 나이트로셀룰로우스 막에 이전시켰다. 상기 막을 5 % 지방결핍 분유(non-fat milk)가 포함된 TBST 완충용액에 12시간이상 담군 후 TBST완충용액으로 3회 세척하였다. 그 후 막은 항-p75 단일클론 항체(1:2000 희석, Zymed)과 실온에서 1시간 동안 반응시켰다. 반응이 끝난 뒤 막을 TBST 완충용액으로 10분씩 3회 세척한 후, HRP(horesdish peroxidase)가 표지된 항-마우스항체 IgG(1:5000 희석, Zymed)를 포함하는 TBST 완충용액상에서 1시간동안 반응시켰다. 상기 막은 TBST 완충용액으로 세척한 후 ECL 반응용액(Pierce, USA)에 2분간 반응시키고, X-레이 필름상에 감광하였다. 도 10은 웨스턴 사진으로 M은 크기마커이고, 레인 1은 신경성장인자를 50 ng/ml 처리한 것이고, 레인 2는 맥문동 추출물 10 ㎍/㎖을 처리한 것이고, 레인 3은 맥문동 부탄올 추출물 10 ㎍/㎖을 처리한 것이고, 레인 4는 맥문동 부탄올 분획물과 신경성장인자가 포함되지 않은 배지를 처리한 것이다. 상기 도 10으로부터 맥문동 부탄올 분획물을 처리한 군에서 신경성장인자 수용체의 발현량이 증가됨을 관찰할 수 있었다.

(2) 면역세포화학법(Immunocytochemistry)

PC12 세포를 완전배지상태로 유리 커버슬립(22 mm x 22 mm)에서 배양하였다. 24시간이 지난 후 맥문동 부탄올 분획 10 ㎍/㎖과 신경성자인자 (NGF) 50 ng/㎖을 각각 처리하였다. 48시간이 지난 후 세포를 2 % 고정액(포스페이트 완충액상의 파라포르알데하이드, pH 7.4)으로 실온에서 30분간 고정하고, PBS 완충용액으로 세척하였다. 이후 2 % BSA(Bovine serum albumin)와 0.1 % 트리톤 X-100 용액에 30분간 얼음위에서 반응시키고, 세척액(PBS 완충용액, 1 % BSA)으로 10분간 3회 세척하였다. 세포에 1차 항체 (항-p75, 1:2000 희석)를 1시간동안 반응시키고, 세척액(PBS 완충용액, 1 % BSA)으로 3회 세척한 후 텍사스-레드로 결합된 2차 항체(항-마우스 면역글로블린 G, 1:5000 희석)로 1시간 동안 반응시켰다. 세포는 세척하고 형광현미경으로 p75 수용체의 발현량을 촬영하였다.

형광현미경 사진은 도 11에 나타내었다. 도 11의 A는 시료 무처리군이고, B는 신경성장인자 처리군이고, C는 맥문동 부탄올 분획 처리군이다. 도 11에서 맥문동 부탄올 분획을 처리한 세포에서 신경성장 인자 수용체인 p75의 단백질 발현이 증가됨을 확인할 수 있었다. 이는 맥문동의 부탄올 분획물이 신경성장인자의 합성을 증가시킴으로써 이의 수용체의 발현량이 증가되었으며, 이러한 현상이 PC12 세포의 성장 및 분화를 유도한 것으로 추정된다.

실험예 6 동물실험

(1) 경구투여

ICR계 마우스(중앙실험동물)와 SD 마우스(Sprague Dawley)를 각각 10 마리씩 4군으로 나눈 다음 본 발명의 맥문동 추출물(맥문동 메탄올 추출물, 맥문동 부탄올 분획, 맥문동 에틸아세테이트 분획, 맥문동 물 분획)을 각각 500, 725, 1000 및 5000 mg/kg의 용량으로 경구투여하였다. 경구 투여후 2주간 독성 여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 한 마리도 사망하지 않았으며 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없음을 확인하였다.

(2) 복강투여

ICR계 마우스(중앙실험동물)와 SD 마우스(Sprague Dawley)를 각각 10 마리씩 4군으로 나눈 다음 본 발명의 맥문동 추출물(맥문동 메탄올 추출물, 맥문동 부탄올 분획, 맥문동 에틸아세테이트 분획, 맥문동 물 분획)을 각각 25, 250, 500 및 725 mg/kg의 용량으로 복강 투여하였다. 복강 투여후 24시간 동안 독성 여부를 관찰한 결과 4군 모두에서 한 마리도 사망하지 않았으며 외견상 대조군과 별다른 증상을 찾아볼 수 없음을 확인하였다.

(3) 수동적 학습능력 측정(Passive avoidance test)

하단에 두께 3 mm의 격자가 0.5 cm간격으로 설치되어 있으며 2개의 방으로 나누어진 박스(avoidance shuttle box, 40 X 20 X 20 cm, Gemini Co., San Francisco)에 ICR계 생쥐 (25-30g, 수컷)를 넣고 한 방을 밝게 하였다.

어두운 곳을 선호하는 생쥐가 밝은 방으로부터 어두운 나머지 한 방으로 들어가면 하단에 설치된 그리드(grid)를 통하여 전기자극(0.1mA/10g 체중)을 받게 되는 훈련을 1회 시행하였다. 치매는 스코플라민 (scopolamine)을 생쥐에 훈련 시행30분전에 투여하여 유발시켰다. 24시간 후 동일한 실험을 시행하여 생쥐가 밝은 방에 머무르는 시간을 측정하고, 이를 전일의 전기자극을 통한 훈련을 기억하는 지표로 하였다.

맥문동 부탄올 분획을 치매를 유발시키기 1시간 전에 투여하여 수동적 학습능력에 미치는 효과를 측정하였다. 도 12는 맥문동 부탄올 분획물이 수동적 인지기능을 증가시킨 것을 나타낸 그래프이다. 도 12의 그래프에서 스코플라민을 처리하여 치매를 유도한 경우 생쥐가 밝은 방에 머무르는 시간이 짧았고, 대조군(saline)을 투여한 생쥐는 일상적인 반응은 나타내었다. 그 반면에 치매를 유도한 후 맥문동 부탄올 분획을 처리한 생쥐는 밝은 방에 머무르는 시간이 증가하였다. 즉 생쥐의 인지기능이 개선되었음을 알 수 있었고, 이는 동물내에서의 신경성장인자의 발현량을 증가시킴으로써 나타난 결과이다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명의 맥문동 추출물은 신경세포의 성장 및 분화를 유도하고, 생존을 유지시키는 효과를 나타내어, 퇴행성 뇌질환에 중요한 역할을 하는 신경세포 축색돌기 성장 촉진 및 신경세포성장인자의 역할을 대체할 수 있을 뿐만 아니라 독성이 없는 천연약제로 사용할 수 있다.

<110> naturobiotech <120> Pharmaceutical composition of Ophiopogon japonicus having enhancement of the neurite outgrowth and neurotrophic effects <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NGF sense primer <400> 1 tggccagtgg tcgtgcagtc 20 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> NGF antisense preimer <400> 2 aagtcagcct cttgcagc 18 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH sense primer <400> 3 cggagtcaac ggatttggtc gtat 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH antisense primer <400> 4 agccttctcc atggtggtga agac 24

Claims (8)

1. 맥문동(Liriope platyphylla) 추출물 또는 소엽맥문동(Ophiopogon japonicus) 추출물을 포함하는 신경세포 보호용 조성물.
2. 삭제
3. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 탄소수 1 내지 5의 저급알콜, 물 및 유기용매로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 용매로 추출되어진 것인 조성물.
4. 맥문동(Liriope platyphylla) 추출물 또는 소엽맥문동(Ophiopogon japonicus) 추출물을 유효성분으로 포함하며;

   뇌졸증, 파킨슨 및 노인성 치매로 이루어진 군으로부터 선택되는 뇌신경질환에 대한 예방 및 치료용 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 맥문동 추출물을 0.1 내지 20 중량%로 포함하는 것인 조성물.
6. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 정제, 캅셀제, 용액제, 현탁제 또는 시럽제인 조성물.
7. 제 1항에 있어서, 상기 조성물의 1일 투여량은 체중 1 kg당 5 mg 내지 500 mg인 조성물.
8. 맥문동(Liriope platyphylla) 추출물 또는 소엽맥문동(Ophiopogon japonicus) 추출물을 유효성분으로 포함하는 신경성장인자 촉진용 조성물.