KR101286107B1

KR101286107B1 - 누룩에서 분리한 아스퍼질러스 오리재 ｙａ08 및 이를 이용한 발효주의 제조 방법

Info

Publication number: KR101286107B1
Application number: KR1020110086065A
Authority: KR
Inventors: 곽중기; 김기현; 양시영; 서민재; 여명재; 김용택
Original assignee: 롯데칠성음료주식회사
Priority date: 2011-08-26
Filing date: 2011-08-26
Publication date: 2013-07-15
Also published as: KR20130022352A

Abstract

본 발명은 전국 각지의 누룩으로부터 청주, 약주, 탁주 양조에 사용되는 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)곰팡이들을 선별배지에서 신규 분리하여 지미성분 및 착색물질을 적게 함유하는 곡물 발효주를 생산하기 위한 효소력가를 갖는 곰팡이 균주를 선발한 후 청주, 약주, 탁주의 주요 성분들을 생산하는 미생물 및 이를 이용한 청주, 약주, 탁주의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 전국 각지의 39종의 누룩으로부터 형태학적으로 아스퍼질러스 속의 곰팡이들을 분리하고, 간이 제국 후 추출액의 효소력가 중 α-아밀레이즈 및 글루코아밀레이즈 역가가 우수하나, 산 프로테아제 및 산 카복시펩티데이즈의 역가는 상대적으로 낮은 균주인 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)(KFCC 11516P)와 이 균주를 이용하여 지미성분이 적고, 유통 중 곡물발효주의 착색이 적게 일어나는 청주, 약주, 탁주의 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

누룩에서 분리한 아스퍼질러스 오리재 ＹＡ08 및 이를 이용한 발효주의 제조 방법{Method for Preparing Fermented Liquor Using Aspergillus oryzae YA08 from Nuruk}

본 발명은 신규 아스퍼질러스 오리재 균주, 이를 이용하여 발효하는 방법 및 발효과정을 거쳐 제조한 발효주에 관한 것이다.

전통주는 대부분 쌀을 비롯한 곡물을 주 원료로 사용하며, 제조 특성상 복합적인 맛과 향을 갖고 있는데 이러한 성분들은 발효 중 생성되는 아미노산이 중요한 역할을 하게 된다. 이러한 아미노산은 발효 중에는 fusel oil 성분의 전구체로 사용되어 너무 진한 향기성분을 내어 맛을 역하게 하며, 발효 후 아미노산 성분들이 다량 잔류하게 되면 맛을 너무 진하게 하는 지미성분으로 작용하게 된다. 또한 잔류된 아미노산 성분들은 유통 중 발효액의 당류와 반응하게 되어 마일라드 반응을 일으켜 착색이 일어나게 된다.

이러한 아미노산 성분들은 효소원으로 사용되는 입국의 곰팡이가 생성하는 프로티아제, 펩티다제 등에 의해 발효 중 생성되며, 일부는 효모가 생육에 이용하기도 하고, 이용하지 못한 성분들은 발효액에 잔류하게 된다. 일반적으로 아스퍼질러스 오리재가 분비하는 프로티아제, 펩티다제는 산 프로테아제, 산 카복시펩티데이즈로 알려져 있으며 곰팡이 균주에 따라 생성하는 프로타제의 역가차이는 다양하게 나타난다.

기존의 청주, 약주, 탁주에 사용하는 곰팡이의 경우 높은 균주를 사용하여 왔으나, 국내의 경우 단백질 분해효소가 양조에 적합한 역가를 보이는 균주를 선발하여 사용하지 못하고 있다(일본양조협회지, Vol. 79, 274-278, 1984).

본 발명은 누룩에서 분리한 곰팡이들을 이용하여 제국을 실시한 후 그 입국의 추출액의 α-아밀레이즈 및 글루코아밀레이즈의 역가가 우수하며 산 프로테아제, 산 카복시펩티데이즈 역가가 각각 1,000~2,000 및 1,000~4,000인 균주를 선발하고 제국을 통한 양조과정을 거쳐 얻어진 발효액의 아미노산 농도가 0.0375~0.15 g/100 ml(글리신 기준)의 발효액을 얻는 것을 목적으로 한다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 지미성분 저생성능을 가지는 신규 아스퍼질러스 오리재 YA08 균주를 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 상기의 발효 방법을 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 청주, 약주 또는 탁주를 제공한다.

본 발명에서 얻어진 아스퍼질러스 오리재 YA08를 사용하여 발효주를 제조함으로써 지미 성분인 아미노산이 적게 생성되어 맛이 단백하고, 유통 조건에서 착색이 적어 유통기간을 연장시킬 수 있는 질 좋은 청주, 약주, 탁주를 제조할 수 있다.

하기 본 발명에 대하여 구체적으로 설명하고자 한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 상기 아스퍼질러스 오리재 YA08은 KFCC 11516P이다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 아스퍼질러스 오리재 YA08 균주의 지미성분 저생성 특성을 이용하는 것을 특징으로 하는 청주, 약주 또는 탁주의 발효 방법을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 아스퍼질러스 오리재 YA08 균주는 제국 실시 후 입국 추출액의 α-아밀레이즈 및 글루코아밀레이즈의 역가가 각각 200-1000 및 50-300이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 아스퍼질러스 오리재 YA08 균주는 상기 균주가 형성하는 산 프로테아제 및 산 카복시펩티데이즈 효소 역가는 각각 1000-2000 및 1000-4000이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 아스퍼질러스 오리재 YA08 균주를 이용하여 제국을 통한 양조과정을 거쳐 얻어진 발효액의 아미노산 농도가 0.01~0.2 g/100 ml이다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 발효 방법은 증미 배지에서 발효시킨다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기의 발효 방법을 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 청주, 약주 또는 탁주를 제공한다.

본 발명은 전국 각지로부터 총 39종의 누룩을 수집하여 수집된 누룩들을 분쇄 후 1 g을 9 ㎖의 0.85% 멸균된 생리식염수에 현탁하고 세균이 자랄 수 없도록 클로람페니콜(100 ppm)을 첨가한 Difco Cooke Rose Bengal Agar 평판배지에 도말하여 25℃ 5~7일간 배양하여 곰팡이 콜로니로부터 곰팡이 174종을 분리하였다. 분리된 곰팡이를 2~3회 평판배지에 반복 도말하여 순수한 곰팡이 174종을 분리하였다. 분리된 곰팡이 콜로니의 형태 와 현미경을 통해 균사, 포자의 형태학 적인 특성으로 아스퍼질러스로 보이는 균주 58종을 순수분리 하였다. 분리된 곰팡이 균주들을 각각 플라스크를 이용한 간이 제국을 통해 균체를 증식시킨 입국을 pH 5.0 아세테이트 완충용액에 현탁하고 여과하여 효소용액을 제조 후 각각의 효소 역가를 측정하여 α-아밀레이즈 및 글루코아밀레이즈의 역가가 각각 200~1,000 및 50~300이고, 산 프로테아제, 산 카복시펩티데이즈 역가가 각각 1,000~2,000 및 1,000~4,000인 균주를 선발하고 제국을 통해 청주 발효를 실시한 결과 발효 속도는 기존 균주와 동일하면서 발효액의 아미노산 농도가 0.0375~0.15 g/100㎖(글리신 기준)의 낮은 수치를 보여 지미가 낮고, 착색이 적은 청주를 제조하는 방법에 관한 것이다.

입국 제조에 사용된 제국 조건은 다음과 같다.

증자한 곡류의 품온이 30~40℃가 되면 총미 대비 1 × 10⁵cells/g의 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)포자를 첨가하고 증자한 곡류의 표면에 고루 분포되도록 손으로 혼합한 후 광목천으로 보쌈 형태로 만들어 항온 항습기에 넣는다 항온 항습기의 설정온도 30~40℃에서 12시간 동안 배양한다. 그 후 온도를 30~37℃를 상승시켜 12시간 동안 배양한다. 그리고 12시간 동안 30~40℃의 온도를 상승시키고 4시간 동안 30~40℃로 온도를 낮춰서 유지시키면서 총 40시간의 배양을 종료한다. 총 경과시간 12시간째 보쌈을 해제한 후 1차 손질, 24시간째 중간손질, 36시간째 마감손질을 한 다음 40시간에 출국하여 입국을 완성한다.

본 발명에 사용된 각 효소의 측정 방법은 다음과 같다.

α-아밀레이즈 역가는 Wohlgemuth value를 측정하였다. 먼저 입국 10g을 50㎖의 0.2 M 아세테이트 완충용액(0.5% NaCl)로 실온(15~20℃)에서 3 시간 동안 추출한 후 원심분리(7,500 rpm, 10 min)한 상등액을 효소력가용 추출액으로 사용하였다. 코지 추출액 0.1 ㎖ 를 25℃의 2.0 ㎖ 의 0.04 M 아세테이트 완충용액(pH 5.0, 1% 수용성 전분 함유)에 첨가한다. 일정 시간 t 분 동안의 효소 반응 후 0.05 ㎖ 의 효소반응액을 5 ㎖ 의 2.5×10^-4M요오드 용액에 첨가한다. 전분-요오드 반응색을 670nm 에서의 투과율 Tt(%)로 측정한다.

효소력가 E(units/g 입국)는 다음의 식으로 계산된다.

D40^o _30'=12.75x(TtT₀)/t

실험에 사용된 시약은 다음과 같다.

1) 아이오딘 용액 (2.5 × 10^-4M요오드 용액)은 요오드화칼륨 (KI) 0.1 g을 먼저 물에 녹인 후 요오드 (I2) 0.0317 g을 녹이고 50 ㎖의 10%의 염산(35% 염산 14.3 ㎖ + 증류수 35.7 ㎖)을 가하여 1 ℓ 정용.

2) 1% 가용성 전분을 0.04M 아세테이트 완충용액에 녹인 후 pH 5.0 조정

- A액: 0.2 M 초산(Mw:60, SD:1.05)

- B액: 0.2 M 초산나트륨 용액

전분 5 g을 정확히 달고 약 50 ㎖에 혼탁하여 열수 150 ㎖에 넣고 교반/중탕하면서 용해한 후 A액과 B액을 혼합하여 pH 5.0이 되도록 조정한 후 가수하여 500 ㎖ 정용

글루코아밀레이즈 역가는 다음 방법으로 측정하였다. 전분용액 1 ㎖를 0.2 M 아세테이트 완충용액(pH 5.0) 0.2 ㎖에 첨가하여 40℃에서 5분간 예열한 후, 효소액 0.1 ㎖를 가하고 40℃에서 20분간 반응시킨다. 1 N 수산화나트륨용액 0.1 ㎖를 가한 후 즉시 냉각하여 반응을 정지시킨 후 30분간 정치시키고 1 N 염산용액 0.1 ㎖를 첨가하여 중화한다. 블랭크(black)의 경우 효소액 0.1 ㎖를 첨가하기 전 수산화나트륨 용액 1 N 0.1 ㎖를 첨가한다. 당화력은 가용성 전분으로부터 40℃, 60분간 1 mg의 포도당을 생성하는 역가를 1단위로 한다. 효소력가 E(units/g 입국)는 다음 식으로 계산하였다.

E = A * (60/t) * (1/0.1) * (1.5/0.1) * n / 1000

반응액의 글루코스 농도를 계산하기 위하여 GOPOD법을 사용하였다. 먼저 글루코스 측정 시약 3 ㎖를 40℃로 예열한다. 효소 반응액 0.1 ㎖를 첨가하여 잘 혼합한 뒤 40℃(또는 50℃)에서 20분간 반응시킨다. (표준는 샘플 대신 글루코스 표준 0.1 ㎖을, 블랭크(black)는 샘플 대신 증류수(또는 완충용액)을 0.1 ㎖ 넣는다.) 블랭크(black)로서 영점을 맞춘 뒤, 상온에서 510 nm 표준 및 샘플의 흡광도를 측정한다(표 1).

	블랭크(black)	Std	Sample
Chromogen 시약	3.0 ㎖	3.0 ㎖	3.0 ㎖
글루코스 표준		0.1 ㎖
Sample			0.1 ㎖
물 또는 완충용액	0.2 ㎖	0.1 ㎖	0.1 ㎖

- t: 반응 시간

- 1/0.1: 희석배수 (효소량)

- 1.5/0.1: 희석배수 (효소 반응액 채취량)

- n: 희석배수 1/(효소액 1 ㎖중 포함된 입국량 g)

산 카복시펩티데이즈 역가는 다음 방법으로 측정하였다. Cbz-Glu-Tyr 용액 1 ㎖을 시험관에 넣고 30℃에서 5분간 예열한 후 효소액 0.1 ㎖을 첨가하여 20분간 반응시킨다. 닌히드린 용액 0.5 ㎖ 을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 끓는 물에서 15분간 가열한 후에 급랭하여 상온에서 방치시킨 후 60% 에탄올 5 ㎖을 첨가하여 교반하였다. 5분간 정치한 후 10 ㎜ cell을 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다. 따로 효소액을 첨가하기 전에 닌히드린 용액을 첨가하여 상기의 조작을 동일하게 수행하여 블랭크(black)를 잡았다. 검량선은 타이로신 표준용액 (0 ~ 50 ㎍/㎖) 1 ㎖ 에 물 0.1 ㎖ 와 닌히드린 용액 0.5 ㎖ 을 첨가하여 상기와 동일하게 조작하여 작성한다.

실험에 사용된 시약은 다음과 같다.

1) 0.5 mM Cbz-Glu-Tyr 용액은 Cbz-Glu-Tyr 45 mg에 메탄올 10 ㎖을 가하여 용해한다. 다시 물 170 ㎖와 0.5 M 초산 완충액(pH 3.0) 20 ㎖을 가한다.

2) 닌히드린 용액은 분석할 때마다 A액과 B액을 동량 혼합하여 사용한다.

A액 : 닌히드린 4 g에 CH₃·OCH₂CH₂OH(2-메톡시에탄올)100 ㎖를 가하여

용해한다.

B액 : CH₃·OCH₂CH₂OH 90 ㎖ 과 0.01 M KCN 1 ㎖, 2 M 초산완충액(pH 5.0)

40 ㎖ 을 혼합.

3) 타이로신 표준액

L-타이로신 50 mg에 1 N 염산 1 ㎖을 가하고 1 L로 맞춘다. 본액 1 ㎖는 50 ㎍의 L-타이로신을 함유한다. 검량선 작성은 물을 첨가하여 0~50 ㎍/㎖로 한다. 산 카복시펩티데이즈의 단위는 Cbz-Glu-Tyr으로부터 30℃, 60분간 1 ㎍의 타이로신을 생성하는 활성을 1 단위로 한다.

효소력가 E(units/g 입국)는 다음 식으로 계산하였다.

E = A × 60/20(반응시간) × 1/0.1(효소량) × n

- A : (효소반응액의 흡광도 - 샘플 블랭크(black)의 흡광도)에서 구한 타이로신 함량(㎍)

- n: 희석배수 1/(효소액 1 ㎖중 포함된 코지량 g)

산 프로테아제 역가는 다음 방법으로 측정하였다. pH 3.0 카제인 용액 1.5 ㎖에 pH 3.0 완충액 1 ㎖ 및 효소액 0.5 ㎖를 가해 40℃의 항온조에서 60분간 작용시킨다(효소력가 강, 약에 따라 단축 또는 연장). TCA 3 ㎖를 가하여 반응을 정지시켜 침전을 여과한다. 그 여액 1 ㎖에 Na₂CO₃ 5 ㎖, 페놀 시약 1 ㎖를 가하여 40℃에서 30분간 발색한다. Casein 용액, 완충액을 40℃ 60분간 처리시킨 후에 효소액 0.5 ㎖를 가한 직후, 반응이 일어나지 않도록 즉시 TCA 3 ㎖를 첨가하여 침전을 그의 여액을 1 ㎖ 채취하여 같은 방법으로 발색시킨 것을 블랭크(black)라 한다.

실험에 사용된 시약은 다음과 같다.

1) pH 3.0 McIlvaine 완충액

- A액: Na₂HPO₄·12H₂O 14.33 g을 물에 용해하여 200 ㎖로 하여 0.2 M 인산나트륨 용액 제조

- B액: 무수 C₆H₈O₇ 19.2 g을 물에 용해하여 1000 ㎖로 하여 0.1 M 구연산 용액 제조

2) 2% 카제인 용액

카제인 10 g을 취하여 pH 3.0 카제인을 조제할 때는 10배 희석한 젖산을 25 ㎖를, 다시 증류수 약 250 ㎖를 가한후 완전히 백탁상으로 용해될 때까지 금망상에서 가열하면서 저어준다 (핫 플레이트에서 가열, 교반함). 한번 비등시킨후 냉각하여 목적하는 pH 3.0 McIlvaine 완충액 (이하 pH 완충액으로 약칭) 100 ㎖를 가하여 물로 500 ㎖로 한다.

3) 페놀 시약

Folin & Ciocalteu's 페놀 시약을 5배 희석하여 사용. 페놀 시약은 강알카리성 하에서 티로신, 트립토판 등과 반응하여 청색을 나타내므로 프로테아제 작용에 의하여 용해되는 질소물의 정량에 이용된다.

효소력가 E(units/g 입국)는 다음 식으로 계산하였다.

E = A * 1/0.5 * 6/1 * n

- A: 검량선상의 Tyr의 ㎍

- 1/0.5: 희석배수 (효소량)

- 6/1: 희석배수 (효소반응액 채취량)

- n: 희석배수(1/효소액 1㎖ 중 입국량 g)

검량선 작성 방법은 다음과 같다.

L-Tyr 10 mg을 1 N 염산 1 ㎖에 녹인후 D.W로 100 ㎖로 맞춘다. 1번의 용액을 0, 0.2, 0.4,…,1.0 ㎖를 넣고 D.W로 1 ㎖를 맞춘다. 각 시험관에 탄산나트륨 용액 5 ㎖, 페놀 시약 1 ㎖ 가하고 40℃, 30분간 발색한다. 대조구로는 L-Tyr을 넣지 않고 진행한다(660 ㎚ 흡광도 측정).

본 발명을 통하여 선발된 아스퍼질러스 오리재 균주들을 이용하여 최종 부피 3 L가 되도록 10~15 일간 정치 발효하여 수득한 발효액의 아미노산 농도를 정량 분석하여 아미노산 농도가 0.0375~0.15 g/100 ㎖(글리신 기준)이 되는 균주를 최종 선발하였고 이 균주의 ITS-5.8s rDNA 시퀀스를 Genbank Database를 통해 동정한 결과 아스퍼질러스 오리재로 확인 되어, 이를 아스퍼질러스 오리재 YA08로 명명하였다. 이 균주는 2011년 8월 한국미생물보존센터(KCCM, Korean Culture Center of Microorganisms) 에 기탁하여 KFCC 11516P호로 기탁 번호를 부여 받았다. 본 KFCC 11516P 균주는 일반 아스퍼질러스 오리재와 동일하게 Potato Dextrose Agar 평판 상에 배양한 집락의 색깔은 초기에는 백색, 분생자가 생긴 다음 황색 이후에는 점점 황록색으로 변화한다.

상기의 방법에 따라 선별된 개량 균주를 이용하여 증미를 주성분으로 하고 입국과 물, 소량의 당화효소를 첨가한 배지에서 통상의 방법으로 발효시켜 청주를 제조한다.

이하. 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

대조 균주 아스퍼질러스 오리재(히구치모야시社)와 본 발명의 선발 균주 YA08 (KFCC 11516P)을 38℃, 상대습도 85%의 조건으로 48시간 제국을 실시한 후 전분당화 효소들과 단백질 분해 효소를 측정한 결과로 대조 균주 및 선발 균주로 제조한 입국의 효소력가 비교는 하기 표 2과 같다.

균주명	α- 아밀레이즈	글루코아밀레이즈	산 카복시펩티데이즈	산 프로타아제
대조 균주	1,035	135	4,320	3,257
YA08	1,297	132	1,178	1,256

대조 균주보다 단백질 분해 효소력가가 낮으므로 발효액의 아미노산이 적게 생성될 것으로 판단하고 담금 실험을 진행하였다.

실시예 2

대조 균주 아스퍼질러스 오리재(히구치모야시社)와 본 발명의 선발균주 YA08 (KFCC 11516P)을 상기의 조건으로 제국을 실시한 후 효소 역가를 측정한 후. 청주 제조방법에 따라 15℃에서 세 차례에 걸쳐 증미, 입국, 담금수를 단계적으로 증가시켜 최종부피가 3 L 되도록 하였다. 이 후 12~15 일간 13~15℃에서 정치 발효하여 얻은 발효액을 원심 분리하여 상등액을 취하고 수득한 상등액을 0.45 ㎛ 여과지로 여과하여 얻은 부분을 아미노산 농도를 측정한 결과 대조 균주 및 선발균주의 주요 아미노산 농도의 비교는 하기 표 3와 같다.

균주명	아미노산 농도 (g/100㎖)
대조 균주	0.225
CB97 -144	0.075

입국의 단백질 분해 효소력가가 낮으므로 발효 중 생성되는 아미노산의 농도가 낮음을 알 수 있었다.

실시예 3

대조 균주 아스퍼질러스 오리재(히구치모야시社)와 본 발명의 선발균주 YA08 (KFCC 11516P)을 상기의 조건으로 제국을 실시한 후 효소 역가를 측정한 후. 청주 제조방법에 따라 15℃에서 세차례에 걸쳐 증미, 입국, 담금수를 단계적으로 증가시켜 최종부피가 3 L 되도록 하였다. 이 후 12~15 일간 13~15℃에서 정치 발효하여 얻은 발효액을 원심 분리하여 상등액을 취하고 수득한 상등액을 0.45 ㎛ 여과지로 여과하여 얻은 부분을 30병에 넣어 25℃, 50℃에 각각 4주 및 1주간에 보관하며 430nm에서 투과도(T%)를 측정한 결과 대조 균주 및 선발 균주를 활용한 발효액의 저장중 투과도 변화 비교는 하기 표 4 및 표 5와 같다.

25℃	0일차	1주차	2주차	3주차	4주차
대조 균주	95	93	90	86	83
YA08	97	96	95	92	90

50℃	0일차	1일차	2일차	4일차	7일차
대조 균주	95	92	85	81	77
YA08	97	96	92	89	86

상온보다는 고온의 조건에서 착색 정도가 심하였으므로 아미노산 농도가 낮을 수록착색이 지연됨을 알 수 있었다.

한국미생물보존센터(국내)

KFCC11516P

20110809

Claims

지미성분 저생성능을 가지는 기탁번호 KFCC 11516P의 아스퍼질러스 오리재 YA08 균주.
삭제
청구항 1의 아스퍼질러스 오리재 YA08 균주의 지미성분 저생성 특성을 이용하는 것을 특징으로 하는 청주, 약주 또는 탁주의 발효 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 아스퍼질러스 오리재 YA08 균주는 제국 실시 후 입국 추출액의 α-아밀레이즈 및 글루코아밀레이즈의 역가가 각각 200-1000 및 50-300 인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 아스퍼질러스 오리재 YA08 균주는 상기 균주가 형성하는 산 프로테아제 및 산 카복시펩티데이즈 효소 역가는 각각 1000-2000 및 1000-4000인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 아스퍼질러스 오리재 YA08 균주를 이용하여 제국을 통한 양조과정을 거쳐 얻어진 발효액의 아미노산 농도가 0.01~0.2 g/100 ml인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 3에 있어서, 상기 발효 방법은 증미 배지에서 발효시키는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 3 내지 청구항 7 중 어느 한 항의 발효 방법을 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 청주, 약주 또는 탁주.