KR100248912B1

KR100248912B1 - 고활성 단백질 분해효소 생산을 위한 아스퍼질러스 오리재 변이 주의 제조방법

Info

Publication number: KR100248912B1
Application number: KR1019970034754A
Authority: KR
Inventors: 변재형; 김두상; 남택정; 김형락
Original assignee: 대한민국
Priority date: 1997-07-18
Filing date: 1997-07-18
Publication date: 2000-03-15
Also published as: KR19990011607A

Abstract

본 발명은 고활성 단백질분해효소 생산을 위한 아스퍼질러스 오리재(Aspergi llus oryzae)변이주 및 그 배양액을 이용한 단백질 가수분해물의 제조방법을 제공하므로서 식품, 의약품 및 섬유산업 등의 여러 산업분야에서 널리 이용하여 각종 효과와 잇점을 득할 수 있도록 한 것인 바, 본 발명은 단백질 식품의 이용 및 가공에 기여할 수 있는 단백질 분해효소의 역가를 높이기 위하여 누룩, 메주, 젓갈 및 토양의 시료로 부터 아스퍼질러스 오리재 균주를 분리하여 이 친주를 대상으로 하여 변이처리후, 폴리엔계 항생물질 내성주를 선택하므로서 고활성 단백질 분해효소 산생변이주를 발굴하고, 상기 고활성 단백질 분해효소산생 변이주 배양액을 단백질소재에 작용시켜 아미노산과 글루탐산을 고 농도로 함유하는 단백질가수분해물을 제조토록 한 것에 요지가 있음.

Description

[발명의 명칭]

고활성 단백질분해효소 생산을 위한 아스퍼질러스 오리재 변이주의 제조방법

[발명의 상세한 설명]

[발명의 목적]

본 발명은 고활성 단백질분해효소 생산을 위한 아스퍼질러스 오리재(Asp ergillus oryzae) 변이주 및 그 배양액을 이용한 단백질 가수분해물의 제조방법에 관한 것이다.

[발명이 속하는 기술분야 및 그 분야의 종래기술]

최근 생명공학의 발전과 더불어 식품, 의약품 및 섬유산업에 이르기까지 효소자원의 수요는 급격히 증가하고 있으며, 다양한 생물로부터 새로운 많은 효소가 발견되고 있을 뿐만 아니라, 효소의 이용분야도 점차 증대되고 있다.

산업적 이용을 위한 효소의 개발 생산에는 미생물이 주로 이용되고 있으며, 그 이유는 비교적 짧은 시간에 값싼 원료배지로써 목적 효소의 생산이 가능하고, 배양기법에 응용에 따라서는 효소 생산이 능률적인 변이균주의 개발이 가능하기 때문이다. (Aunstrup, 1979; Frost and Moss, 1987; Knorr 등, 1985; 木住, 1986).

아스퍼질러스 오리재는 증미, 간장, 청주, 미림,각주 등의 양조에 예로부터 사용되어온 코지 곰팡이이다.

아스퍼질러스 오리재가 생산하는 단백질분해효소는 우리나라의 전통적인 발효조미료인 간장, 된장 등의 제조에 이용되어 왔다. 이 같은 아스퍼질러스 오리재의 배양중 프로테아제나 피티다제 등 단백질분해효소의 활성을 상승시키는 것은 조미료의 공업적 생산에 있어서 대단히 중요하다.

따라서 이전에는 X-선 조사, 자외선 조사, 돌연변이제를 이용한 변이육종에 관하여는 많은 보고가 있다. (井口信義; 農化., 29, 73, (1955) : 井口信義, 山本喜志郞; 農化, 29, 394, (1955) : Sekine, H. S. Nasuno and T. Nakadai ; J. Ferment. Technol., 49, 544, (1971) : Nakadai, T. and S. Nasuno ; J. Ferment. Technol., 55, 273, (1977)).

근년 바실러스속의 균체외효소 생상균을 변이처리하고, 그 후, 판코마이신, 리스 토세틴 등의 세포막 합성 저해제인 항생물질을 혼용함으로서 프로테아제, 세룰라제등 세포외 효소의 생산량을 2-4배 향상시키는 방법에 관하여도 적지 않은 보고가 있다. (Ito, S. Y. Ohta, M. Shimooka, M. Takajwa, K. Ozaki, S. Adachi and K. Okamoto; Agric. Biol. Chem., 55(9), 2387, (1991) : 日本特公., 平1-222771

), 반코마이신 내성변이주에 의해 세포의 효소의 고활성화하는 흔히 사용되는 방법이다. (Kawahara, H. et al., ; Biosci. Biochem., (1993))

그러나 진핵생물에 있어서 항생물질내성 균주의 보고는 페니실리움속에 속하는 미코페놀산 생산주의 폴리엔계 항생물질 내성주를 선택하는 것으로 우수한 미코페놀산 생산주를 얻는 것 (日本特開昭53-11588호), 사카로마이세스속에 속하는 효모의 폴리엔계 항생물질 내성변이주가 냉동내성에 우월하다는 보고가 있으나 (日本特開昭 59-203441호), 효소활성의 상승을 목적으로 한 항생물질 내성균주에 관한 보고는 없었다.

[발명이 이루고자 하는 기술적 과제]

본 발명은 단백질 식품의 이용 및 가공에 기여할 수 있는 단백질 분해효소의 역가를 높이기 위하여 누룩, 메주, 젓갈 및 토양 등의 시료로부터 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 균주를 분리하여, 이 친주를 대상으로 하여 변이처리후, 폴리엔계 항생물질 내성주를 선택함으로서 고활성 단백질분해효소 산생 변이주를 발굴하고, 이 고활성 단백질분해효소 산생 변이주 배양액을 단백질소재에 작용시켜 아미노산과 글루탐산을 고농도로 함유하는 단백질가수분해물을 제조코져 하는 것이다.

[발명의 구성 및 작용]

본 발명의 아스퍼질러스 오리재의 폴리엔계 항생물질내성주(이하 내성주로 약칭함)는 각종의 단백질 분해효소를 생상하는 아스퍼질러스 오리재에 돌연변이제로서 종래로부터 많이 사용된 니트로소 구아니딘과 에칠메틸설폰산을 작용시켜 이들 균주를 폴리엔계 항생물질을 함유하는 한천배지 상에 배양하여 여기에 생육하는 내성주를 얻는다.

돌연변이의 유발에 관해서는 변이제로서 상기의 니트로소구아니딘과 에칠에틸설폰산 이외에 하이드록실아민 등의 일반적으로 사용하는 다른 화학물질, 또는 자외선, X-선 등의 조사, 또는 변이처리 없는 자연돌연변이에 의해 얻을 수 있다.

본 내용에서 "내성"이 있는 미생물은 친주의 최소생육저지농도 이상의 폴리엔계 항생물질이 존재하는 환경하에서 생육 가능한 성질을 획득하는 것을 말한다.

따라서 돌연변이주 중에서 내성주를 선택하는 것이 친주의 최소생육저지농도를 측정하여, 이 농도이상의 폴리엔계 항생물질을 함유하는 한천배지상에 돌연변이주를 배양하여 균집락을 형성한 균주를 취하는 것이 좋다.

예로서 암포테리신 B를 폴리엔계 항생물질로서 사용하는 경우 아스퍼질러스 오리재의 최소생육저지 농도인 약 20 μg/ml의 암포테리신 B를 함유하는 한천배지상에 돌연변이주를 배양하여 균집락을 형성한 균주를 취하는 것이 좋다.

그리고, 본 발견의 내성주로부터 단백질분해효소의 고활성변이주를 취득하는 방법에 관해서는 예로서 탈지대두분말, 인산수소칼륨을 함유하는 한천배지에서 내성주의 포자현탁액을 1~10μℓ씩 도말하고, 30℃, 4~8일간 배양하여 탈지대두분말이 분해되어 투명대를 형성하는 부분(분해 할로(halo))의 반경과 균사 반경의 비로부터 고활성변이주를 선택한다.

내성주 중에 생육불량균주, 또는 단백질분해활성이 낮은 균주를 제거하여 고활성변이주를 효율적으로 선택한다. 여기에서 배지 중에 혼성하는 단백질은 목적에 따라 카제인, 소맥분, 젤라틴, 탈지분유 등을 같은 방법으로 사용할 수 있다.

이렇게 하여 얻어진 본 발명의 고활성변이주의 대표적인 예로서는 아스퍼질러스 오리재 0-1을 친주로 하여 이것으로부터 유도된 암포테리신 B (이하 AMB로 약칭함)내성의 아스퍼질러스 오리재 U-1 및 E-1이 유도되었다. 이 고활성변이주의 주된 균체학적 성상은 그 친주와 비교해 볼 때 프로테아제활성이 14~38배정도 증가하였다.

본 발명의 고활성변이주의 배양물은 액체배양, 또는 고체 배양물을 지칭한다. 통상적으로는 관리가 용이한 액체배양법이 선택된다.

이러한 배양물이 각종의 분해효소를 함유케하는 것은 액체배양 또는 고체배양물을 각각 사용하는 것이 좋으나, 배양물로부터 필요에 따라 효소를 분리, 정제하여 사용할 수도 있다. 즉, 액체 배양물을 원심분리, 또는 여과 등에 의해 균체를 분리하고, 그 균체 및 배양액으로부터 통상의 분리수단, 예로서, 염석법, 등전점 침전법, 용매 침전법 등에 의해 단백질을 침전시키고, 한외여과법에 의해 농축하여 효소액으로 할 수 있으며, 또한 통상의 정제법에 의해 분리 채취한 정제품을 단독, 또는 조합하여 사용할 수도 있다.

또한, 고체배양에서 효소를 추출후 같은 방법으로 분리 정제하여 각각 추출한 효소액, 정제한 효소를 단독 또는 조합하여 사용할 수도 있다.

여기에 이런 배양물에 시판효소제제, 예로서 단백질가수분해효소, 세포벽분해효소, 글루타미나제 등을 함유한 효소액에 있어서는 목적에 따라 정제한 효소제제를 가하는 것이 좋다.

다음으로 본 발명의 고활성변이주 배양물을 작용시킨 단백질로서 예를 들면 대두, 소맥, 콘밀, 카제인, 어단백 등이 대상으로 될 수 있다.

경웅에 따라, 탈지 또는 팽화 등의 가공을 실시하여 얻어진 단백질, 또는 원료로부터 분리된 단백질도 좋다.

고활성변이주의 배양물을 단백질에 작용시키는 조건에 관하여 서술하면 고활성변이주위 배양물을 탈지대두, 분리대두단백 등에 혼합하여 5~60℃, 6~240시간 반응시키고, 반응 중에 방부의 목적으로 식염, 에탄올 등을 첨가한다.

반응종료 후 미반응의 원료단백질, 균체 등의 불용물은 원심분리나 여과 등 종래의 분리법에 따라 제거하고, 생성된 각종 단백질 분해액의 글루탐산 및 유리아미노산의 함량은 효소법에 의한 글루탐산, 오피에이법에 의한 유리아미노산 측정법 및 전 질소함량 측정법 등으로 구한다.

[실시예]

Ⅰ. 실험재료 및 시약

본 발명에서 균주 분리용으로 사용한 시료 중 누룩과 메주는 1993년 6월 6일 부산시 부산진구 부전동 부전시장에서, 어류(고등어, 정어리, 멸치, 오징어)와 젓갈류(새우젓, 멸치젓, 꼴뚜기젓)는 1993년 7월 17일 부산시 수영구 남천동 남천해변시장에서 각각 구입한 것을 시료로 하였다. 그리고 토양은 1993년 7월 17일 부산시 남구 대연동 부경대학교 구내의 잔디밭에서 채취하였다.

본 실험에서 누룩, 메주, 어류·젓갈류 및 토양 등에서 단백질분해효소 산생 미생물을 분리하였으며, 검색과정을 거쳐 단백질분해효소 생산능이 강한 균주를 순수분리하였다.

본 발명에 사용된 배지 중 단백질분해효소 산생미생물의 검색배지로서는 탈지분유 한천배지(탈지분유 5%, agar 1%)를 사용하였다. 그리고,아스퍼질러스 오리재의 배양에는 Ushijima 등(1991)의 방법에 따라 완전배지(complete medium)로서 8% 맥아즙 배지 (pH 6.0), 최소배지(minimal medium)는 짜펙독스(Czapek Dox) 배지(NaNO₃0.3%, K₂HPO₄0.1%, MgSO₄, 7H₂O 0.05%, KCL 0.05%, FeSO₄, 7H₂O 0.001%, 설탕 3%)를 사용하였다.

그리고, 고체배지는 위의 액체배지에 1.5%의 한천을 첨가하여 조제하였다.

방법

가. 균주의 분리

본 실험에서 균주는 아래의 방법으로 분리하였다. 즉, 각 5g의 균주분리용 시료에 0.1% Tween # 80 용액을 100 ml 가하여 초음파 세척기(주파수 47 kHz, 5 min)로써 현탁시켜 살균한 거어즈로서 여과하였다.

이 여액을 0.1% Triton X-100을 함유한 최소 한천 평판배지에 각각 도말하여 30℃에서 3일간 배양하여 균총 주위의 투명환이 큰 균주들을 취하였다.

분리된 균주는 다시 최소액체배지에 각각 접종하고, 30℃에서 3일간 배양 후에 원심분리하여 균체를 제거한 다음, 상등액을 아주카제인 기질로써 단백질 분해능을 측정·비교하였다.

나. 단백질분해효소 산생균주의 선발

단백질분해효소 산생 미생물의 검색은 위에서 분리한 균주를 30℃에서 7일간 배양한 사면배지에 0.1% Tween #80 5 ml를 가한 후, 1g의 탄산칼슘을 가하여 격렬하게 교반하였다. 이를 무균적으로 흡인연과(glass filter 17G2)후, 여액을 원심분리(3,000 × g, 10분) 하고 잔사에 멸균 증류수를 가하여 포자수가 약 1× 10⁶/ml의 포자 현탁액을 얻었다.

이 포자 현탄액 0.1 ml씩을 각각 취하여, 단백질분해효소 활성 검색 배지 (1% 탈지분유, 0.2% 효모엑기스, 0.2% 카자미노산, 0.1% Triton X-100을 함유하는 최소한천 평판배지)에 도말하고 30℃에서 3일간 배양하여 투명환이 큰 균주를 얻었다.

상기에 얻은 각 균주는 1% 탈지분류를 함유한 최소액체배지에 각 1 백금이씩 접종하여 30℃에서 3일간 진탕 배양하고 균체를 제거(원심분리; 3,000 × g, 20분)한후에, 각 배양액 중 단백질 분해능이 가장 높은 균주 아스퍼질러스 오리재 0-1을 선별하였다.

다 . 선별균주의 보존

선별된 균주의 보존은 최소한천사면배지에 각각 도말하여 30℃에서 3일간 배양하고, 4℃에 보존하면서 2개월마다 계대배양하여 본 실험에 사용하였다.

라. 균주의 개량방법

자외선 조사에 의한 변이 유발; 위와 같은 방법으로 보관된 균주를 완전배지에 배양 (30℃, 7일)하여 포자 현탁액 (포자수 약 1× 106/ml)을 얻은 다음, 이 포자 현탁액 5 ml을 페트리접시 (

9 cm)에 취하여 자외선등 (Matsushita electronic 제, GL-20, 20W)으로 시간별로 조사 (거리 15cm)시켰다. 자외선 조사를 마친 포자현탁액을 최소 한천배지에 도말하여 3일간 배양 후, 각각의 균총을 멸군한 0.1% Tween # 80 용액에 현탁시켜 포자 현탁액을 얻었다.

에칠메틸설폰산에 의한 변이 유발; 아스퍼질러스 오리재 0-1균의 포자를 100 mM의 인산완충액 (pH 7.2)에 현탁(포자수 약 1×10⁶/ml)한 후, 이 현탁액에 에칠메틸설폰산을 0.5M 되게 가하여, 시간별로 배양(37℃)하였다. 원심분리(3,000×g, 10min)후, 포자를 100 mM 티오술폰산 나트륨을 함유한 100 mM 인산 완충액 (pH 7.2)로서 포자 현탁액을 얻었다.

AMB 내성주의 선택방법; 위의 변이처리과정을 거친 포자현탁액을 AMB의 최소 생육저지 농도인 50 μg/ml 함유 감자포도당 한천배지에 각각 도말하여 30℃, 5~8일간 배양하였다. 생육한 콜로니를 PDA 사면배지에 각각 채취하여 30℃, 3~8일간 배양하는 조작에 의해 AMB내성주를 약 200주를 얻었다.

마. 단백질분해효소의 측정

단백질분해효소 활성의 측정방법으로서는 아조카제인을 기질로 사용하는 측정법에 따른다.

즉, 2%의 아조카제인 0.25 ml와 0.2M 트리스-염산 완충액 (pH 7.5) 1ml를 혼합하여 45℃에서 5분간 반응시킨 후, 여기에 효소용액(배양물에서 균체를 제거한 것)을 10~100μl를 가하여 45℃에서 10분간 반응시킨다.

여기에 10% 삼염화초산용액을 1 ml 가하여 반응 정지시키고 원심분리하여 상층액의 흡광도를 측정함으로서 배양물의 효소활성을 구한다.

이때 효소단위는 흡광도가 0.1 상승시키는 효소의 양을 1 Unit 로 정의한다.

Ⅲ. 실험결과

가. 아스퍼질러스 오리재의 AMB에 대한 최소생육저지농도

친주인 아스퍼질러스 오리재 0-1의 포자현탁액을 각 농도의 AMB를 함유하는 감자·포도당 한천배지(이하 PDA 배지로 약칭함)에 도달하여 AMB의 최소생육저지농도를 구한다.

즉, AMB를 첨가한 PDA 배지에 위의 아스퍼질러스 오리재 0-1의 포자현탁액을 도말하여 30℃에서 5일간 배양하여 배지표면의 균사의 생육을 눈으로 관찰한다.

이 결과를 표1에 나타내었다.

[표 1]

+++, 발육상태 매우 양호; +, 발육상태 양호; ±; 발육상태 불량; -, 성장않음

이 결과에서 알 수 있듯이 아스퍼질러스 오리재 0-1의 최소생육저해 농도는 20 μg/ml였다.

나. AMB 내성주에서 고활성 단백질분해효소 산생 균쥬를 선택

AMB내성주에서 고활성 단백질분해효소 산생 균쥬를 선택한 실시예를 다음에 서술한다.

위에서 얻어진 AMB 내성주의 포자현탁액을 표 2에서 나타낸 탈지대두분말을 함유하는 배지 A에 각각 2μℓ씩을 도말하여 30℃, 5~7일간 배양한다.

균사집락의 주위에 탈지대두분말의 분해에 의한 투명대(할로)의 반경과 균사집락의 반경과의 비(이하 분해할로비로 약칭함)를 230주에 대하여 측정하여 친주의 분해할로비 보다 5% 이상 큰 균주를 선택하였다.

그 결과를 표 3에 나타내었다.

[표 2]

탈지대두분해할로에 사용된 배지조성 : 배지 A

[표 3]

이 결과에서 알 수 있듯이 AMB 내성주의 분해할로비의 상승률의 경우는 변이처리만 한 것 보다 높았다.

여기에 분해할로비가 상승한 AMB 내성주에 관해서는 표 4에 표시한 액정배지 B에 접종하여 30℃, 48시간 진탕배양하여 원심분리후 상층을 단백질분해효소활성을 측정하였다.

이 결과를 표 5에 나타내었다.

[표 4]

[표 5]

이 표에서 알 수 있듯이 AMB 내성주의 액체배양 상층의 단백질분해효소활성은 변이처리만 한 변이주에 비교하면 친주보다 고활성변이주의 수가 많았으며, 또한 이활성의 최고치는 친주에 비하여 최고 38배에 달했고, 변이처리만한 변이주에 비하여 약 10배 정도 높았다.

나, 단백질 가수분해물을 제조

다음으로 고활성변이주의 배양물을 단백질 소재에 작용시켜 단백질 가수분해물을 제조하는 방법의 실시예를 적는다.

이하의 모든 조작은 무균적으로 행하였다.

실시예 2의 분해할로비가 가장 큰 고활성변이주의 액체배양물 20 ml를 5g 의 탈지대두분말에 0.1M 수산화나트륨 7.5ml를 가하여 멸균(121℃, 15분)후 중화한 것에 첨가하여 에탄올 6ml와 혼합하여 30℃에서 5일간 반응시키고, 다음으로 50℃에서 4시간동안 반응시켰다. 이 반응물을 원심분리한 상층에 대하여 전질소, 오피에이법에 의한 유리아미노산 함량의 측정을 하여 친주와 비교하였다.

이 결과를 표 6에 나타내었다.

[표 6]

[발명의 효과]

이상에서 살펴본 바와 같이 본 발명은 단백질 식품의 이용 및 가공에 기여할수 있는 단백질 분해효소의 역가를 높이기 위하여 누룩, 메주, 젓갈 및 토양의 시료로부터 아스퍼질러스 오리재 균주를 분리하고 이 친주를 대상으로 하여 변이처리후, 폴리엔계 항생물질 내성주를 선택하므로서 고활성 단백질 분해효소 산생변이주를 발굴하여 상기 고활성 단백질 분해효소산생 변이주 배양액을 단백질소재에 작용시켜 아미노산과 글루탐산을 고 농도로 함유하는 단백질가수분해물을 제조할 수 있게 되므로서 식품, 의약품 및 섬유산업 등의 여러 산업분야에서 널리 이용하여 각종 효과와 잇점을 득할 수 있는 것이다.

Claims

단백질 식품의 이용 및 가공에 기여할 수 있는 단백질 분해효소의 역가를 높이기 위하여 누룩 메주, 젓갈 및 토양 등의 시료로부터 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae) 균주를 분리하고, 상기에서 얻은 친주(포자현탁액)를 대상으로 자외선 조사하여 우수한 포자현탁액을 취하고, 이에 에칠메틸설폰산을 가하여 그중 가장 우수한 포자현탁액을 취하는 방법의 변이처리후 폴리엔계 항생물질 AMB(암포테리신B) 내성주를 선택하므로서 고활성 단백질 분해효소산생 변이주를 발굴하고, 이의 고활성 단백질 분해효소 산생변이주 배양액을 단백질 소재에 작용시켜 아미노산과 글루탐산을 고농도로 함유하는 단백질가수분해물을 제조토록 하는 것을 특징으로 하는 고활성 단백질분해효소 생산을 위한 아스퍼질러스 오리재 변이주의 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 아스퍼질러스 오리재 변이주의 배양액을 단백질소재에 작용시키는 것을 특징으로 하는 고활성 단백질분해효소 생산을 위한 아스퍼질러스 오리재 변이주의 제조방법.