KR102010844B1 - 아스퍼질러스 속 균주 및 리조푸스 속 균주의 혼합 배양 방법 - Google Patents

아스퍼질러스 속 균주 및 리조푸스 속 균주의 혼합 배양 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아스퍼질러스 속 균주 및 리조푸스 속 균주의 혼합 배양 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 방법으로 배양된 아스퍼질러스 속 균주 및 리조푸스 속 균주의 균복합체와 상기 균복합체를 접종하여 제조된 누룩은 우수한 α-아밀라아제 활성 및 아미노산 생성 효과를 나타냄으로써, 본 발명의 방법에 따라 배양된 아스퍼질러스 속 균주 및 리조푸스 속 균주의 균복합체는 고품질의 탁주 제조를 위한 누룩을 제조하는데 유용하게 사용될 수 있다.

Description

아스퍼질러스 속 균주 및 리조푸스 속 균주의 혼합 배양 방법{MIXED CULTURE METHOD OF ASPERGILLUS SP. AND RHIZOPUL SP.}
본 발명은 아스퍼질러스 속 균주 및 리조푸스 속 균주의 혼합 배양 방법에 관한 것이다.
우리나라에서는 오랜 과거부터 누룩을 사용하여 만든 술이 주종을 이루어 왔으므로, 누룩은 술 빚기에 없어서는 안될 중요한 재료이다. 예로부터 전해오는 누룩의 제조방법은 자연에 존재하는 야생균들이 보리나 밀의 반죽에 부착하여 성장하고 활성하는 것을 이용하였다. 이와 같이, 자연에 존재하는 야생균들이 부착하여 성장함으로써 완성된 재래누룩을 이용하여 제조된 전통주는 다양한 종류의 야생균에 의해 생성되는 다양하고 풍부한 향미성분에 의해 술의 풍미가 조화롭다는 장점이 있다.
그러나, 자연에 존재하는 야생균을 이용한 재래누룩의 제조는 주위 자연환경에 의한 영향을 받기 때문에 제조 자체가 어려울 수 있다는 문제가 있다. 또한, 누룩의 당화력이나 접착되는 야생 효모의 알코올 발효능이 균일하지 않아 이를 사용하여 제조된 술의 품질이 일정하지 않을 수 있다. 따라서, 입국을 이용하여 막걸리를 제조하는 방법도 연구되고 있으나, 입국 제조과정에서 시간과 온도의 조절이 어렵다. 이에, 최근에는 상기와 같은 재래누룩의 단점을 보완하고자, 곰팡이를 이용하여 생산된 높은 당화력의 조효소제를 사용하는 방법이 시도되고 있다. 그러나, 단순히 조효소제를 첨가하면 제조 과정에서 유산 생성이 미비하여 제조된 막걸리의 신맛이 부족하고 맛이 단순되며, 오염되기 쉽다는 문제가 있다. 또한, 이와 같은 문제점을 해결하기 위해, 번식력이 강하고 산을 생성하는 유산균을 이용하여 쌀 개량 누룩을 제조하고, 상기 제조된 개량 누룩을 이용하여 막걸리를 제조하는 방법이 대한민국 공개특허 제10-2010-0136813호에 개시되어 있다.
이에, 본 발명자들은 전통주의 제조에 사용할 수 있는 누룩을 개발하기 위해 노력하던 중, 리조푸스 델레마 26-4 균주 및 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주를 분리 및 동정하고, 상기 두 균주를 혼합하여 배양한 경우와 상기 혼합 배양한 균주를 이용하여 제조된 누룩에서 α-아밀라아제 활성 및 아미노산 생성이 증가함을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
대한민국 공개특허 제10-2010-0136813호
본 발명의 목적은 아스퍼질러스 속 균주 및 리조푸스 속 균주의 혼합 배양 방법 및 상기 방법으로 배양된 균복합체를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균복합체가 접종된 종국을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 종국을 이용한 누룩 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 누룩을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 1) 아스퍼질러스 속 균주를 배양 배지에 접종하고 1 내지 10일 동안 배양하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 배양 배지에 리조푸스 속 균주를 접종하고 1 내지 7일 동안 배양하는 단계를 포함하는 아스퍼질러스 속 균주 및 리조푸스 속 균주의 혼합 배양 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 배양된 아스퍼질러스 속 균주 및 리조푸스 속 균주의 균복합체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균복합체가 접종된 종국을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 종국을 전분질 원료에 접종하여 발효시키는 것을 포함하는 누룩 제조방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 누룩을 제공한다.
본 발명에 따른 방법으로 배양된 아스퍼질러스 속 균주 및 리조푸스 속 균주의 균복합체와 상기 균복합체를 접종하여 제조된 누룩은 우수한 α-아밀라아제 활성 및 아미노산 생성 효과를 나타냄으로써, 본 발명의 방법에 따라 배양된 아스퍼질러스 속 균주 및 리조푸스 속 균주의 균복합체는 고품질의 탁주 제조를 위한 누룩을 제조하는데 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 아스퍼질러스 오리재 78-5(S10) 및 리조푸스 델레마 26-4(S4)를 1:1, 2:1, 4:1 또는 8:1의 부피비로 혼합하여, pH 4의 배양 배지 및 20℃의 온도에서 배양하였을 때 pH 및 총산도를 확인한 그래프이다.
도 2는 아스퍼질러스 오리재 78-5(S10) 및 리조푸스 델레마 26-4(S4)를 1:1, 2:1, 4:1 또는 8:1의 부피비로 혼합하여, pH 4의 배양 배지 및 20℃의 온도에서 배양하였을 때 α-아밀라아제(A) 및 산성 단백질분해효소(B)의 활성을 확인한 그래프이다.
도 3은 아스퍼질러스 오리재 78-5(S10) 및 리조푸스 델레마 26-4(S4)를 4:1의 부피비로 혼합 배양한 균복합체를 이용하여 제조된 누룩의 α-아밀라아제(A) 및 산성 카복실펩티다아제(B)의 활성을 확인한 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 1) 아스퍼질러스 속 균주를 배양 배지에 접종하고 1 내지 10일 동안 배양하는 단계; 및 2) 상기 단계 1)의 배양 배지에 리조푸스 속 균주를 접종하고 1 내지 7일 동안 배양하는 단계를 포함하는 아스퍼질러스 속 균주 및 리조푸스 속 균주의 혼합 배양 방법을 제공한다.
상기 아스퍼질러스 속 균주는 아스퍼질러스 오리재, 아스퍼질러스 파라시티쿠스, 아스퍼질러스 웬티, 아스퍼질러스 클라바투스, 아스퍼질러스 자포니쿠스, 아스퍼질러스 포에티더스, 아스퍼질러스 나이거, 아스퍼질러스 아와모리, 아스퍼질러스 투비젠시스, 아스퍼질러스 카와치, 아스퍼질러스 루추엔시스, 아스퍼질러스 코레아누스 및 아스퍼질러스 우사미로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 구체적으로, 상기 아스퍼질러스 속 균주는 아스퍼질러스 오리재 균주일 수 있고, 상기 아스퍼질러스 오리재 균주는 수탁번호 KACC93274P로 기탁된 것일 수 있다.
상기 배양은 통상의 기술분야에서 곰팡이를 배양하는데 사용할 수 있다고 공지된 배양 배지라면 어떤 것을 사용하여도 무관하나, 구체적으로 밀기울 배지를 배양 배지로서 사용하여 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 배양 배지는 밀기울 배지일 수 있다. 상기 배양 배지는 pH 2 내지 6, 구체적으로 pH 2.5 내지 5.5, 더욱 구체적으로 pH 3 내지 5일 수 있다. 상기 배양 배지의 pH가 2 미만 6 초과인 경우에는 접종된 아스퍼질러스 속 균주 및 리조푸스 속 균주의 활성이 저하될 수 있다. 또한, 상기 단계 1)의 배양은 1 내지 10일, 구체적으로 3 내지 7일, 더욱 구체적으로 4 내지 6일 동안 수행될 수 있다. 상기 단계 1)의 배양에서 접종된 아스퍼질러스 속 균주는 함께 배양할 리조푸스 속 균주에 비해 증식 속도가 느리기 때문에, 두 종류의 균이 비슷한 수로 증식되게 하기 위하여 아스퍼질러스 속 균주를 먼저 접종하여 일정 기간 동안 배양한 뒤 리조푸스 속 균주를 접종할 수 있다.
상기 리조푸스 속 균주는 리조푸스 오리재, 리조푸스 호모타리쿠스 및 리조푸스 마이크로스포루스로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상일 수 있다. 구체적으로, 상기 리조푸스 속 균주는 리조푸스 오리재 균주일 수 있고, 상기 리조푸스 오리재 균주는 수탁번호 KACC93273P로 기탁된 것일 수 있다.
상기 단계 2)의 배양은 아스퍼질러스 속 균주 및 리조푸스 속 균주가 성장하는 속도가 다른 것에 기초하여 아스퍼질러스 속 균주를 접종하고, 1 내지 10일동안 배양한 뒤, 리조푸스 속 균주를 접종하는 것일 수 있다. 상기 단계 2)의 배양은 상기 서술한 바와 같은 이유로, 1 내지 7일, 구체적으로 2 내지 5일, 더욱 구체적으로 2 내지 4일 동안 수행될 수 있다.
본 발명에 따른 아스퍼질러스 속 균주 및 리조푸스 속 균주의 혼합 배양 방법은 아스퍼질러스 속 균주 및 리조푸스 속 균주를 1 내지 8:1의 부피비, 구체적으로 2 내지 7:1의 부피비, 더욱 구체적으로 3 내지 6:1의 부피비로 접종할 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 누룩으로부터 리조푸스 델레마 26-4 균주 및 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주를 분리 및 동정하고, 이를 국립농업과학원에 기탁하였다. 상기 리조푸스 델레마 26-4 균주 및 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주를 이용하여 누룩을 제조하기 위해, 먼저 상기 두 균주를 혼합 배양하는 조건을 확립한 결과, pH 4의 배양 배지에 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주를 접종하고 20℃에서 5일 동안 배양한 뒤, 여기에 리조푸스 델레마 26-4 균주를 접종한 뒤 3일을 더 배양하여 아스퍼질러스 오리재 78-5 및 리조푸스 델레마 26-4 균주의 균복합체를 수득하였다. 상기 균복합체 및 이로 제조한 누룩의 효소 활성을 측정한 결과, 상기 균복합체 및 누룩은 높은 α-아밀라아제 활성을 나타내었다(도 2 및 3 참조).
따라서, 상기로부터 본 발명의 혼합 배양 방법은 아스퍼질러스 속 균주 및 리조푸스 속 균주의 혼합 배양에 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 방법으로 배양된 아스퍼질러스 속 균주 및 리조푸스 속 균주의 균복합체를 제공한다.
상기 균복합체는 상술한 바와 같은 아스퍼질러스속 균주 및 리조푸스 속 균주의 혼합 배양 방법으로 수득할 수 있다. 이때, 상기 배양은 아스퍼질러스 속 균주를 배양 배지에 접종하고 1 내지 10일 동안 배양한 뒤, 여기에 리조푸스 속 균주를 접종하고 1 내지 7일 동안 더 배양하는 것일 수 있다. 상기 배양은 pH 2 내지 6인 배양 배지를 사용하여 15 내지 25℃의 온도에서 수행될 수 있다.
일례로, 상기 아스퍼질러스 속 균주는 아스퍼질러스 오리재 균주, 구체적으로 수탁번호 KACC93274P로 기탁된 아스퍼질러스 오리재 균주일 수 있다. 한편, 상기 리조푸스 속 균주는 리조푸스 델레마 균주, 구체적으로 수탁번호 KACC93273P로 기탁된 리조푸스 델레마 균주일 수 있다. 상기 아스퍼질러스 속 균주 및 리조푸스 속 균주는 1 내지 8:1의 부피비로 접종되어 배양될 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 균복합체가 접종된 종국을 제공한다.
상기 용어, "종국"은 쌀알 누룩을 제조하기 위해 사용되는 씨앗을 의미한다. 상기 종국의 제조를 위하여, 본 발명의 방법에 따라 제조된 아스퍼질러스 속 균주 및 리조푸스 속 균주의 균복합체는 통상의 기술자에 의해 적정한 양으로 접종될 수 있다. 본 발명에 따른 균복합체가 접종된 종국은 통상의 기술분야에 잘 알려진 조건 및 방법에 따라 발효될 수 있으며, 이때 접종한 균주가 포자를 충분히 형성할 수 있도록 적절한 발효 온도 및 기간을 유지할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 종국을 전분질 원료에 접종하여 발효시키는 것을 포함하는 누룩 제조방법을 제공한다.
상기 종국은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다.
상기 전분질 원료는 쌀, 보리, 밀, 호밀, 귀리, 조, 기장, 수수 및 메밀쌀과 같은 곡류, 옥수수, 고구마와 같은 서류, 또는 이의 혼합물일 수 있다. 본 발명에 따른 방법으로 수득된 종국은 통상의 기술분야에 공지된 조건 및 방법으로 전분질 원료에 접종될 수 있고, 그 발효 조건 또한 통상의 기술자에 의해 적절히 선택될 수 있다.
나아가, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 누룩을 제공한다.
상기 누룩은 상술한 바와 같은 특징을 가질 수 있다. 일례로, 본 발명의 방법에 따라 배양된 아스퍼질러스 속 균주 및 리조푸스 속 균주의 균복합체를 접종하여 제조된 종국을 이용하여 제조된 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 아스퍼질러스 속 균주는 아스퍼질러스 오리재 균주, 구체적으로 수탁번호 KACC93274P로 기탁된 아스퍼질러스 오리재 균주일 수 있다. 한편, 상기 리조푸스 속 균주는 리조푸스 델레마 균주, 구체적으로 수탁번호 KACC93273P로 기탁된 리조푸스 델레마 균주일 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 1. 곰팡이의 분리 및 동정
2009년부터 2012년까지 국내 각 지역으로부터 누룩을 수집하고, 이를 4℃에 보관하면서 곰팡이균을 직접 분리방법 또는 희석평판 분리방법으로 분리하였다.
구체적으로, 직접 분리방법은 누룩의 표면에서 직접 곰팡이 포자를 채취하여 배지에 접종하였다. 한편, 희석평판 분리방법은 10 g의 누룩을 90 ㎖의 생리식염수에 현탁하고, 현탁된 누룩을 십진 희석법으로 희석한 뒤, 상기 희석액을 배지에 도말하였다. 이때, 배지는 DG18(Oxoid, UK)을 사용하였다. 상기 곰팡이균이 접종 또는 도말된 배지를 5 내지 7일 동안 배양하여 서로 다른 종류의 곰팡이균을 포자 색, 형태 등을 기준으로 육안으로 구분하였다. 상기 분리된 곰팡이균을 MEB 액체 배지(Difco, 미국)를 이용하여 28℃에서 7일 동안 배양하여 곰팡이균의 균사체를 수득하였다. 수득된 균사체를 동결건조시킨 뒤, 동결건조된 균사체를 파쇄하였다. 이후, DNA 추출 키트(Qiagen DNeasy Plant Mini Kit, Germany)를 이용하여 파쇄된 균사체로부터 게놈 DNA를 분리하였다. 분리된 DNA의 5.8S rRNA 유전자 및 β-튜블린 유전자를 통상의 기술분야에 공지된 방법으로 PCR하여, 염기서열을 제노텍(한국)에 의뢰하여 분석하였다. 이때, PCR에 사용된 프라이머는 하기 표 1에 기재된 바와 같다.
표적 유전자 프라이머 서열(5'→3') 서열번호
ITS ITS 1 TCCGTAGGTGAACCTGCGG 서열번호 1
ITS 4 TCCTCCGCTTATTGATATGC 서열번호 2
β-튜블린 Bt2a GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC 서열번호 3
Bt2b ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC 서열번호 4
그 결과, 분리된 26-4 및 78-5 곰팡이균은 각각 리조푸스 델레마 및 아스퍼질러스 오리재에 속하는 균주임을 확인하였다. 동정된 리조푸스 델레마 26-4 균주는 기탁번호 KACC93273P로, 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주는 기탁번호 KACC93274P로 2017년 2월 28일자로 국립농업과학원에 각각 기탁하였다.
실험예 1. 리조푸스 델레마 및 아스퍼질러스 오리재 균주의 혼합 배양
실시예 1에서 분리 및 동정한 리조푸스 델레마 26-4 균주 및 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주를 다음과 같은 방법으로 혼합 배양하였다.
먼저, 거칠게 분쇄된 50 g의 밀기울에 1,000 ㎖의 증류수를 첨가하여 5%(w/v)의 밀기울 배지를 제조하였다. 제조된 밀기울 배지를 미라클로스(miracloth, Calbiochem 475855, EMD Biosciences Inc., 독일)를 이용하여 여과한 뒤, 배지의 pH를 4로 적정하였다. 이때, pH의 적정에는 1N HCl 또는 1N NaOH를 사용하였다. pH를 적정한 배지를 배양용 삼각플라스크에 나누어 담고, 121℃에서 15분 동안 고압증기멸균 하여 밀기울 배지를 준비하였다. 한편, 상기 리조푸스 델레마 26-4 균주 및 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주는 -70℃에 동결보존된 바이알을 녹여서 PDA 평판배지에 플레이트 하나 당 5 ㎕씩 도말하였다. 도말된 PDA 평판배지를 28℃에서 배양하였다. 리조푸스 델레마 26-4 균주는 4일, 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주는 7일 동안 배양하여 형성된 포자를 멸균수 및 스프레더(spreader)를 이용하여 회수하였다. 회수된 포자를 솜을 넣어 멸균한 주사기로 여과하여 포자 현탁액을 수득한 뒤, 수득된 포자 현택액을 계수하여 각 균주가 106 CFU/㎖가 되도록 희석하였다. 희석된 리조푸스 델레마 26-4 균주 및 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주를 부피비를 기준으로 1:1, 1:2. 1:4 또는 1:8의 비율로 혼합하여 상기 준비된 300 ㎖의 밀기울 배지에 접종하였다. 접종은 균주가 전체 배지 부피의 1%(v/v)가 되도록 하였고, 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주를 접종하여 5일 동안 배양한 뒤, 리조푸스 델레마 26-4 균주를 접종하여 3일 동안 배양하였다. 배양은 20℃에서 수행되었고, 대조군으로는 리조푸스 델레마 26-4 균주 또는 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주만을 접종하였다.
실험예 2. 리조푸스 델레마 및 아스퍼질러스 오리재 균주의 혼합 배양액의 이화학적 특성 확인
실험예 1에서 혼합 배양한 배양액을, 배양 첫날부터 하루에 한번씩 채취하여 총산도 및 pH를 측정하였다.
구체적으로, 혼합 배양액을 4℃ 및 10,000 g의 조건으로 10분 동안 원심분리한 뒤, 상층액만 취하여 이를 여과함으로써(syringe filter 25CS045AS, Advantec, Toyo Roshi Kaisha Ltd., 일본) 균체를 제거하였다. 먼저, 균체가 제거된 배양액의 pH를 pH 측정기(Benchtop pH meter Orion Star A211, Thermo Scientific Co., 미국)를 이용하여 측정하였다. pH를 측정하고, 5 ㎖의 배양액을 다른 튜브에 옮겨 2~3방울의 페놀프탈레인 지시약을 떨어뜨린 뒤, 이의 pH를 중화하는데 소모되는 0.1 N NaOH의 부피를 측정하였다. 측정 결과를 하기 수학식 1에 대입하여 총산도를 계산하였다. 그 결과, 측정된 pH 및 총산도를 도 1에 나타내었다.
Figure 112017094081767-pat00001
도 1에 나타난 바와 같이, 리조푸스 델레마 26-4 균주 및 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주를 부피비를 기준으로 1:4로 혼합하여 배양한 경우가 배지의 pH를 크게 벗어나지 않으면서도 총 산도 또한 안정적이었다(도 1). 이로부터 상기 조건에서 배양된 균주가 다른 비율로 혼합하여 배양된 경우에 비해 안정적인 배양이 가능함을 확인하였다.
실험예 3. 리조푸스 델레마 및 아스퍼질러스 오리재 균주의 혼합 배양액의 효소활성 확인
3-1. α-아밀라아제의 활성 확인
실험예 1에서 혼합 배양한 배양액을, 배양 첫날부터 하루에 한번씩 채취하여 전분-요오드 복합체 분석법을 기반으로 α-아밀라아제 활성을 측정하였다.
구체적으로, 40 ㎕의 2%(w/v)에 동량의 혼합 배양액을 첨가하고 50℃의 항온수조에서 30분 동안 반응시켰다. 여기에 20 ㎕의 1 M 염산용액을 첨가하여 반응을 정지시키고, 100 ㎕의 요오드 용액을 첨가하여 발색시켰다. 이때 사용된 요오드 용액은, 1 ℓ의 물에 0.0317 g의 요오드, 0.1 g의 요오드화칼륨 및 50 ㎖의 10%(v/v) 염산을 첨가하여 제조하였다. 상기 발색된 반응액을 150 ㎕ 취하여 96-웰 플레이트(SPL Life Science Co. Ltd., 한국)에 넣고, 570 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
한편, 대조군인 전분 표준곡선은 전분을 0 내지 20 ㎎/㎖의 농도로 제조한 가용성 전분용액을 시료로서 사용하여 측정된 흡광도 값을 이용하여 얻었다. 이때, α-아밀라아제 활성은 가용성 전분용액에서 50℃의 온도에서 60분 동안 1 ㎎의 전분을 분해하는 효소 1 ㎖의 활성을 1 유닛(unit)으로 정의하여 하기 수학식 2를 이용하여 계산하였다.
Figure 112017094081767-pat00002
그 결과, 도 2A에 나타난 바와 같이, 리조푸스 델레마 26-4 균주 및 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주를 부피비를 기준으로 1:4로 혼합하여 배양한 경우에 가장 우수한 α-아밀라아제 활성을 나타내었다(도 2A). 이로부터 상기 조건에서 배양된 균주가 다른 경우에 비해 더욱 우수한 발효 활성을 나타냄을 알 수 있었다.
3-2. 산성 단백질분해효소의 활성 확인
실험예 1에서 혼합 배양한 배양액을, 배양 첫날부터 하루에 한번씩 채취하여 산성 단백질분해효소(acidic protease) 활성을 측정하였다.
구체적으로, 0.15 ㎖의 0.5%(w/v) 카제인 용액 및 0.1 ㎖의 맥바인 완충액을 혼합하여 40℃의 항온수조에서 5분 동안 예열하였다. 이때, 맥바인 완충액은 0.2 M 인산-2-나트륨 용액 및 0.1 M 구연산 용액을 1:4의 부피비로 혼합하고 pH 3으로 적정하여 제조하였다. 예열된 혼합액에 0.05 ㎖의 실험예 1의 배양액을 첨가하고, 이를 40℃의 온도에서 60분 동안 반응시켰다. 상기 반응액에 0.3 ㎖의 TCA(trichloroacetic acid) 용액을 첨가해 반응을 정지시키고, 여과하여 침전물을 제거하였다. 0.1 ㎖의 상기 여과물에 0.5 ㎖의 0.4 M 탄산나트륨 용액 및 0.1 ㎖의 페놀시약(Folin&Ciocalteu's phenol reagent F9252, Sigma-Aldrich Co. LLC., 미국)을 첨가하여 40℃에서 30분 동안 발색시켰다. 발색된 반응액 150 ㎕를 96-웰 플레이트에 넣고, 660 ㎚의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
한편, 대조군인 티로신 표준곡선은 특급 L-티로신을 20 내지 100 ㎍/㎖의 농도로 제조한 티로신 표준용액을 시료로서 사용하여 측정된 흡광도 값을 이용하여 얻었다. 이때, 산성 단백질분해효소의 활성은 단백질에서 40℃의 온도에서 60분 동안 1 ㎍의 티로신을 생성하는 효소 1 ㎖의 활성을 1 유닛(unit)으로 정의하여 하기 수학식 3을 이용하여 계산하였다.
Figure 112017094081767-pat00003
그 결과, 도 2B에 나타난 바와 같이, 리조푸스 델레마 26-4 균주 및 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주를 부피비를 기준으로 1:4 또는 1:8로 혼합하여 배양한 경우가 우수한 산성 단백질분해효소 활성을 나타내었다(도 2B). 이로부터 상기 조건에서 배양된 균주를 이용하여 주류를 제조하면 아미노산의 생성을 높임으로써 맛이 향상된 주류를 제조할 수 있음을 알 수 있었다.
제조예 1. 리조푸스 델레마 및 아스퍼질러스 오리재 균주의 혼합 배양물을 이용한 누룩의 제조
2015년산 철원 오대쌀을 세척하고, 세척을 시작한 시간부터 2시간 동안 수침하였다. 수침 후, 쌀의 수분 함유율이 31~33%가 되도록 1시간 동안 탈수하고, 증기가 올라오기 시작할 때 쌀을 넣어 50분 동안 증자하였다. 증자한 증미를 35℃까지 냉각하여 고두밥을 제조하고, 수분 함량이 전체 중량 대비 35 중량%가 되도록 하였다. 여기에 실험예 1에서 1:4의 부피비로 혼합 배양한 리조푸스 델레마 26-4 균주 및 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주의 혼합 배양액을 전체 종국 중량 대비 1 중량%로 접종하였다. 이를 두꺼운 수건으로 보쌈하여 제국기(Mini-15, Yaegaki Food Co., 일본) 및 제국실의 습도를 85%, 온도를 35℃로 유지하면서 43 내지 60시간 동안 발효시켰다. 발효된 누룩을 건조기(DS-80-3, Dasol Scientific Co., 한국)를 이용하여 45℃에서 24시간 동안 건조시켜 수분이 10 내지 12% 함유된 쌀알 누룩을 제조하였다.
비교예 1. 리조푸스 델레마 균주를 이용한 누룩의 제조
리조푸스 델레마 26-4 균주 및 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주의 혼합 배양액 대신 리조푸스 델레마 26-4 균주를 사용한 것을 제외하고는, 상기 제조예 1과 동일한 조건 및 방법으로 쌀알 누룩을 제조하였다.
비교예 2. 아스퍼질러스 오리재 균주를 이용한 누룩의 제조
리조푸스 델레마 26-4 균주 및 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주의 혼합 배양액 대신 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주를 사용한 것을 제외하고는, 상기 제조예 1과 동일한 조건 및 방법으로 쌀알 누룩을 제조하였다.
실험예 4. 누룩의 이화학적 특성 확인
혼합 배양액 대신 제조예 1, 비교예 1 및 비교예 2에서 제조된 누룩을 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 2와 동일한 방법 및 조건으로 누룩의 pH 및 총산도를 측정하여 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다. 이때 누룩은, 10 g의 누룩에 50 ㎖의 증류수를 첨가하여 이를 실온에서 3시간 동안 교반하여 수득된 누룩 침출물로서 이용하였다. 상기 수득된 침출물을 여과하여 누룩 시료로서 사용하였고, 대조군으로서 시판중인 쌀입국(조은곡식, 한국)을 사용하였다.
이때, 아미노산도는 10 ㎖의 누룩 시료에 0.1 N의 NaOH를 첨가하여 시료의 색이 담홍색이 될때까지 중화시킨 뒤, 여기에 5 ㎖의 중성 포르말린 용액을 첨가하여 유리된 산의 적정 시(pH 8.3)까지 소모되는 0.1 N의 NaOH의 부피(㎖)로 나타내었다.
누룩 pH 총산도(%) 아미노산도(㎖)
비교예 1 3.73±0.07 0.09±0.03 0.26±0.04
비교예 2 5.38±0.13 0.67±0.07 1.73±0.06
제조예 1 5.71±0.11 0.05±0.01 1.47±0.02
대조군 3.13±0.06 0.69±0.01 1.08±0.03
그 결과, 표 2에 나타난 바와 같이, 제조예 1에서 제조된 누룩의 pH가 약산성으로 유지되고, 아미노산도가 시판중이 누룩과 유사한 경향을 나타내었다. 다만, 총산도의 경우, 제조예 1에서 제조된 누룩이 대조군에 비해 낮았으며, 이는 리조푸스 델레마 균주에 의한 것으로 생각되었다(표 2).
실험예 5. 누룩의 효소활성 확인
5-1. α-아밀라아제의 활성 확인
α-아밀라아제 분석 키트(Kikkoman, 일본)를 사용하여 실험예 4와 동일한 조건 및 방법으로 수득된 누룩 침출물로부터 α-아밀라아제의 활성을 측정하였다.
구체적으로, 상기 α-아밀라아제 분석 키트에 포함된 기질 용액 및 효소 용액을 각각 0.5 ㎖씩 혼합한 1 ㎖의 반응용액을 시험관에 넣고 37℃에서 5분 동안 예열하였다. 여기에 0.1 ㎖의 누룩 침출물을 첨가하여 37℃에서 10분 동안 반응시킨 뒤, 2 ㎖의 반응 정지액을 첨가하였다. 반응이 정지된 반응액을 10 ㎜의 셀(cell)로 옮겨 담아 400 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 블랭크(blank)는 1 ㎖의 반응용액을 시험관에 넣고 37℃에서 15분 동안 예열한 뒤, 0.1 ㎖의 누룩 침출물 및 2 ㎖의 반응 정지액을 첨가하여 반응이 정지된 반응액의 흡광도를 동일한 파장에서 측정하여 얻은 값을 사용하였다.
이때, 1분 당 N-2-클로로-4-니트로페닐65-아자이드-65-데옥시-β-말토펜타오사이드(N-2-chloro-4-nitrophenyl65-azide-65-deoxy-β-maltopentaoside)가 1 μmol의 2-클로로-4-니트로페놀로 유리되는 역가를 1 U(unit/g)으로 정의하여 하기 수학식 4를 이용하여 계산하였다.
Figure 112017094081767-pat00004
그 결과, 도 3A에 나타난 바와 같이, 리조푸스 델레마 26-4 균주 및 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주를 부피비를 기준으로 1:4로 혼합하여 배양한 경우에 가장 우수한 α-아밀라아제 활성을 나타내었다(도 3A).
5-2. 산성 카복실펩티다아제의 활성 확인
산성 카복실펩티다아제 분석 키트(Kikkoman, 일본)를 사용하여 실험예 4와 동일한 조건 및 방법으로 수득된 누룩 침출물로부터 α-아밀라아제의 활성을 측정하였다.
구체적으로, 상기 산성 카복실펩티다아제 분석 키트에 포함된 1 ㎖의 기질 용액을 시험관에 넣고 37℃에서 5분 동안 예열하였다. 여기에 0.1 ㎖의 누룩 침출물을 첨가하여 37℃에서 10분 동안 반응시킨 뒤, 2 ㎖의 반응 정지액을 첨가하였다. 반응이 정지된 반응액에 0.1 ㎖의 정량효소액을 첨가하고 20분 동안 반응시키고, 0.1 ㎖의 정량발색액을 첨가하여 10분 동안 반응시켰다. 상기 반응액을 10 ㎜의 셀(cell)로 옮겨 담아 460 ㎚에서 흡광도를 측정하였다. 블랭크(blank)는 1 ㎖의 기질용액을 시험관에 넣고 37℃에서 15분 동안 예열한 뒤, 0.1 ㎖의 누룩 침출물 및 2 ㎖의 반응 정지액을 첨가하고, 이후는 상기와 동일하게 처리된 반응액의 흡광도를 동일한 파장에서 측정하여 얻은 값을 사용하였다.
이때, 1분 당 카보벤조시-L-티로실-L-알라닌(carbobenzoxy-L-tyrosyl-L-alanine)이 1 μmol의 L-알라닌으로 유리되는 역가를 1 U(unit/g)으로 정의하여 하기 수학식 5를 이용하여 계산하였다.
Figure 112017094081767-pat00005
그 결과, 도 3B에 나타난 바와 같이, 리조푸스 델레마 26-4 균주 및 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주를 부피비를 기준으로 1:4로 혼합하여 배양한 경우가 대조군에 비해 아미노산 생성이 우수하였으며, 이로부터 상기 균주를 이용하면 맛이 향상된 주류를 제조할 수 있음을 알 수 있었다.
국립농업과학원 KACC93273P 20170227 국립농업과학원 KACC93274P 20170227
<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> MIXED CULTURE METHOD OF ASPERGILLUS SP. AND RHIZOPUL SP. <130> 2017P-03-030 <160> 4 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS 1 <400> 1 tccgtaggtg aacctgcgg 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ITS 4 <400> 2 tcctccgctt attgatatgc 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bt2a <400> 3 ggtaaccaaa tcggtgctgc tttc 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bt2b <400> 4 accctcagtg tagtgaccct tggc 24

Claims (15)

1) 수탁번호 KACC93274P로 기탁된 아스퍼질러스 오리재(aspergillus oryzae) 78-5 균주를 배양 배지에 접종하고 1 내지 10일 동안 배양하는 단계; 및
2) 상기 단계 1)의 배양 배지에 수탁번호 KACC93273P로 기탁된 리조푸스 델레마(Rhizopus delemar) 26-4 균주를 접종하고 3 내지 4일 동안 배양하는 단계를 포함하고,
상기 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주 및 리조푸스 델레마 26-4 균주가 3.5 내지 4.5:1의 부피비로 접종되는, 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주 및 리조푸스 델레마 26-4 균주의 혼합 배양 방법.
삭제
삭제
삭제
삭제
제1항에 있어서, 상기 배양 배지가 밀기울 배지인, 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주 및 리조푸스 델레마 26-4 균주의 혼합 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 배양 배지가 pH 2 내지 6인, 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주 및 리조푸스 델레마 26-4 균주의 혼합 배양 방법.
제1항에 있어서, 상기 단계 1)의 배양이 3 내지 7일 동안 수행되는, 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주 및 리조푸스 델레마 26-4 균주의 혼합 배양 방법.
삭제
제1항에 있어서, 상기 배양이 15 내지 25℃의 온도에서 수행되는, 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주 및 리조푸스 델레마 26-4 균주의 혼합 배양 방법.
삭제
제1항의 방법으로 배양된 아스퍼질러스 오리재 78-5 균주 및 리조푸스 델레마 26-4 균주의 균복합체.
제12항의 균복합체가 접종된 종국.
제13항의 종국을 전분질 원료에 접종하여 발효시키는 것을 포함하는 누룩 제조방법.
제14항의 방법으로 제조된 누룩.
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