KR101324811B1 - 식물섬유소화 효소가 증강된 액체국의 제조방법, 상기방법에 의해 제조되는 액체국, 및 그 액체국의 용도 - Google Patents

식물섬유소화 효소가 증강된 액체국의 제조방법, 상기방법에 의해 제조되는 액체국, 및 그 액체국의 용도 Download PDF

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Abstract

개시된 것은 고가의 식물섬유소화 효소 제제 또는 유전자 재조합 균주 사용의 필요 없이 액체 배양 배지를 사용하여 증강된 식물섬유소화 효소를 갖는 액체국을 제조하는 방법이다. 또한, 개시된 것은 액체국을 사용하여 건조 액체국 생성물 및 산업용 알콜 (에탄올) 을 제조하는 방법이다. 표면의 전부 또는 일부가 적어도 외피로 덮인 곡물을 함유하는 액체 배양 배지, 표면이 외피로 덮인 콩 및/또는 감자를 함유하는 액체 배양 배지 및 전처리(예를 들어, 세쇄 또는 분쇄)를 받지 않은 비름 및/또는 퀴노아를 함유하는 액체 배양 배지로부터 선택된 하나 이상의 액체 배양 배지에서 국균(배양 원료)을 배양하는 공정을 포함하는 액체국의 제조 방법으로서, 상기 액체 배양 배지 중의 배양 원료의 양을 조절하여 액체국에서 적어도 당아밀라제, 내산성 α-아밀라제 및 식물섬유소화 효소를 동시에 생산 및 축적시킨 액체국의 제조 방법; 액체 배양 배지를 사용한 건조 액체국 생성물의 제조 방법으로서, 상기 방법은 상기 언급한 방법에 의해 생산된 액체국을 건조하는 것을 특징으로 하는 방법; 및 액체국을 사용하여 발효 공정에 의해 에탄올을 제조하는 방법.
액체국, 국균, 발효, 식물섬유분해 효소

Description

식물섬유소화 효소가 증강된 액체국의 제조방법, 상기 방법에 의해 제조되는 액체국, 및 그 액체국의 용도{METHOD FOR PRODUCTION OF LIQUID KOJI HAVING ENHANCED PLANT FIBER DIGESTIVE ENZYME, LIQUID KOJI PRODUCED BY THE METHOD, AND USE OF THE LIQUID KOJI}
본 발명은 식물섬유분해 효소 예를 들어, 섬유소분해 효소 및 자일란분해 효소의 활성을 증강시킨 액체국을 제조하는 방법, 및 상기 방법에 의해 수득되는 액체국, 및 그 용도에 관한 것이다.
알콜 음료의 제조에 사용되는 국(麴)에는, 익히는(cooking) 등의 처리 후의 원료에 사상균의 포자를 접종시켜 배양한 고체국, 및 원료 및 다른 영양원을 물에 첨가하여 액체 배지를 제조하고 이어서 국균(麴菌)의 포자 또는 전배양한(pre-cultured) 국균의 균사체 등을 접종하여 배양한 액체국이 있다.
알콜 음료 예를 들어, 일본주(sake), 소주(shochu), 간장, 된장, 미림(sweet sake) 등과 같은 발효 음식의 통상적인 제조에는, 고체 배양 방법으로 제조한 고체국이라고 불리는 것이 널리 사용된다. 고체 배양 방법은 국균, 예를 들어 아스페르길루스 가와치(Aspergillus kawachii), 아스페르길루스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스페르길루스 니게르(Aspergillus niger), 아스페르길루스 오리자 에(Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 소야(Aspergillus sojae) 등의 포자를, 증자한(steam-cooked) 곡류와 같은 고체 원료에 분산시켜 국균을 고체 표면에서 증식시키는 배양 방법이다.
예를 들어, 소주의 제조에는, 아스페르길루스 가와치 및 아스페르길루스 아와모리와 같은 고체국이 널리 사용된다. 그러나, 고체 배양 방법은 원료 및 국균이 불균일하게 분산되는 배양계(culture system)이기 때문에, 온도, 수분 함량, 및 다양한 영양 성분이라고 하는 인자(factor)를 균일하게 하는 것이 어렵고, 배양 조절 면에서 매우 복잡하다. 게다가, 국의 제조는 종종 개방상태에서 수행되어서, 잡균으로부터 오염되는 것을 막기 위한 품질 관리 면에서의 주의도 요구된다. 그러므로, 고체 배양 방법은 대규모 제조에는 적절하지 않다.
반대로, 액체 배양 방법은 배양 조절 및 품질 관리가 쉬워서, 효율적인 제조에 적합하다. 그러나, 예를 들어, 효소 활성이 소주를 양조하기에 불충분하다는 등의 이유 때문에, 액체 배양 국균에 의해 수득되는 배양물은 거의 소주국으로 사용하지 않는다.
상기 언급한 이유에 추가로, 액체 배양 방법으로 수득된 배양물을 소주와 같은 발효 음식의 제조에 사용하지 않는 주요한 이유는, 액체 배양에서는 국균의 아밀라제 및 셀룰라제와 같은 효소 생산 거동이 고체 배양에서와 상당히 상이한 것으로 공지되어 있고, 생산성 또한 전반적으로 부족한 것으로 공지되어 있기 때문이다 (비-특허 문헌 1 및 2 참조).
소주와 같은 알콜 음료의 제조에서, 알콜은 일반적으로 동시에 일어나는 당 화 및 발효에 의해 생성된다. 그러므로, 국균에 포도당을 공급하는데 영향을 주는 국균의 당질분해 관련 효소, 특히 당아밀라제(glucoamylase) 및 내산성 α-아밀라제(acid stable α-amylase)는 알콜 발효에서 주요 효소(key enzyme)이다. 그러나, 액체 배양 방법으로 수득된 배양물에서 당아밀라제의 활성이 현저하게 낮고 생산 거동 또한 고체 배양에서의 그것과 상당히 상이하다는 것이 공지되어 있다 (비-특허 문헌 3 내지 6 참조).
국균의 당아밀라제 활성을 증가시키는 방법으로서, 균사체의 성장에 중점을 두면서 국균을 배양하는 방법 (특허 문헌 1 참조) 및 국균 배양액에 배초(焙炒)한 곡류를 첨가하는 방법 (특허 문헌 2 참조) 이 보고되었다. 특허 문헌 1 에 개시된 방법은 다공성 막 또는 공극을 갖는 포괄적인 고정화제에서 배양하여 당아밀라제를 인코딩하는 신규한 유전자 glaB 을 발현시켜, 효소 활성을 유도하는 것이다. 따라서, 상기 방법은 엄격한 관리 또는 특별한 배양 장치를 요구하기 때문에, 실용적이지 않다. 특허 문헌 2 에 개시된 방법은 적어도, 원료의 일부로서 배초한 곡류를 사용하는 액체 배지에 국균을 배양하는데, 상기 방법은 곡류를 배초하는 추가적인 생산 단계를 요구한다.
본 발명의 발명자는 국균이 거의 분해하지 않는 당류를 함유하는 액체 배지를 사용하여 국균을 배양하는 방법과 관련된 발명을 제공하였다 (특허 문헌 3 참조). 상기 발명에서의 국균을 액체 배양하는 것에 의해, 일본주와 같은 발효 음식을 생산하는데 사용될 수 있는, 당아밀라제와 같은 당 분해 효소의 활성이 높은 국균 배양물을 편리하고 저렴하게 수득할 수 있다.
한편으로는, 내산성 α-아밀라제에 대해서는 최근 분자 생물학적 분석이 상세하게 이루어지고 있다 (비-특허 문헌 7 참조). 상기 분석은 하기와 같이 보고한다: 백국균(白麴菌)은 각각 2개의 상이한 특징, 즉, 비내산성 α-아밀라제 및 내산성 α-아밀라제라는 2개의 상이한 아밀라제 유전자를 갖는다. 각 유전자의 발현 양식은 서로 매우 상이하다. 액체 배양에서, 비내산성 α-아밀라제는 충분히 생산되는 반면, 소주를 양조하는데 주요한 효소인 내산성 α-아밀라제는 거의 생산되지 않는다.
소주 제조에서는, 소주 매시(shochu mash)가 부패(putrefaction)되는 것을 막기 위해 낮은 pH 환경에서 양조한다. 비내산성 아밀라제는 낮은 pH 조건 하에 즉시 불활성화되기 때문에 소주 양조 중 해당작용에 거의 기여하지 못한다. 그러므로, 액체 배양 국균에 의한, 소주 양조 중에 해당작용에 기여한다고 여겨지는, 내산성 α-아밀라제를 높은 수율로 생산하는 것이 소주 제조를 위해 필수 불가결하다.
액체 배양 국균에서 내산성 α-아밀라제의 생산 거동은 상세하게 조사 보고되었다. 그러나, 상기 방법은 펩톤 및 구연산 완충 용액을 함유하는 합성 배지를 사용하고, 100 시간 이상의 배양 시간을 요구하여서, 실제 소주 양조에 적용하기는 어려울 수 있다 (비-특허 문헌 8 내지 10 참조).
본원 발명의 발명자들은 이미 소주를 제조하기에 필요한 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제 효소 활성을 충분히 갖는 액체국 제조 방법을 개발하였고, 상기 방법은 배양 원료로서 표면이 곡피로 덮인 곡류를 함유하는 액체 배지에서 백국균 및 /또는 흑국균을 배양하여 배양물에서 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제를 동시에 생성 및 축적시키는 것을 포함한다. 발명자들은 최초로 액체국을 사용하여 소주를 제조하는 데 성공했다 (예를 들어, 일본 특허 출원 번호 제 2004-350661 호의 명세서 참조).
한편, 일본주 및 소주의 생산성을 추가로 향상시키기 위해 국으로 제조하는 식물섬유분해 효소에 대한 조사를 실행했다. 일본주 제조 시 식물섬유분해 효소 예를 들어, 섬유소분해 효소, 자일란분해 효소, 및 펙틴분해 효소를 사용하는 경우 일본주 매시의 원료 이용률이 개선된다는 것이 보고되었다 (비-특허 문헌 11 및 12 참조).
트리코더마 비리드(Trichoderma viride)의 섬유소분해 효소 유전자를 도입하여 재조합 소주 국균을 생성하는 것 및 재조합 소주 국균으로 소주를 제조하는 것에 의해 소주에서 알콜 수율이 향상된다는 것 또한 보고되었다 (비-특허 문헌 13 참조).
상기 기재된 바와 같이, 일본주 또는 소주의 제조에 사용되는 식물섬유분해 효소의 생산성 향상은 일본주 또는 소주와 같은 발효 음식의 제조에서 효율을 증진시키는 데 매우 중요하다는 것이 널리 알려졌다.
그러나, 일본주 또는 소주의 제조에 고가의 식물섬유분해 효소를 사용하는 것은 비용을 증가시킬 수 있어서, 바람직하지 않다.
또한, 재조합 소주 국균을 사용하는 것은 소비자가 안전성 등을 걱정하게 할 수 있어, 역시 바람직하지 않다.
한편, 산업용 알콜로서의 에탄올은 음식 예를 들어, 미림, 식초 등을 제조하는 원료로서, 또는 산업화학물질 예를 들어, 향료, 세제 등을 제조하는 원료로서 사용된다. 추가로, 최근에 에탄올이 석유와 같은 화학 연료를 대체할 신규한 에너지원으로서 기여할 것이라고 기대되고 있다. 예를 들어, 가솔린과 3% 의 에탄올을 혼합하여 수득하는 E3 가솔린과 같은 알콜 연료에 대한 조사 및 개발이 진행되었다.
원료로서 곡류 또는 구근(tubers)을 사용하여 발효법에 의해 산업용 알콜을 제조하는 경우, 효소 제제 (액화 효소 또는 당질분해 효소)는 높은 효소 활성으로의 사용이 요구된다 (예를 들어, 비-특허 문헌 14 참조).
그러나, 효소 제제의 사용은, 고비용과 더불어, 매싱(mashing)이 고농도로 수행될 수 없다는 문제를 야기한다. 일반적으로 효소 제제로 제조하는 매시는 약 8% 의 알콜 함량을 갖는다. 따라서, 생산성을 향상시키기 위해서는 보다 고농도에서의 매싱이 기대된다.
효소 제제 대신에, 국균을 곡류 또는 콩의 표면에서 성장시키는 고체국을 사용하는 것을 고려할 수 있다. 그러나, 고체국은 특이적인 배양 형태, 즉, 고체 배양에서만 생산되기 때문에 대규모 제조에 적합하지 않다.
반대로, 국균이 액체 배지에서 배양되는 액체국은 배양 조절이 쉬워서, 효율적인 제조에 적합하다.
그러나, 액체국은 알콜 발효에 요구되는 효소 활성을 충분히 제공하지 못한다고 당업자에게 알려져 있어서, 실제 생산에 사용되는 예는 없다.
비-특허 문헌 1: Iwashita K. 등: Biosci. Biotechnol. Biochem., 62, 1938-1946(1998)
비-특허 문헌 2: Yuichi Yamane 등: 일본 양조협회지(Journal of the Brewing Society of Japan), 99, 84-92(2004)
비-특허 문헌 3: Hata Y 등: J. Ferment. Bioeng., 84, 532-537 (1997)
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비-특허 문헌 5: Ishida H 등: J. Ferment. Bioeng., 86, 301-307 (1998)
비-특허 문헌 6: Ishida H 등: Curr. Genet., 37, 373-379 (2000)
비-특허 문헌 7: Nagamine K 등: Biosci. Biotechnol. Biochem., 67, 2194-2202 (2003)
비-특허 문헌 8: Sudo S 등: J. Ferment. Bioeng., 76, 105-110 (1993)
비-특허 문헌 9: Sudo S 등: J. Ferment. Bioeng., 77, 483-489 (1994)
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비-특허 문헌 11: Yoshizawa 등. 일본 양조협회지, 76, 284-286 (1981)
비-특허 문헌 12: Fukuda 등. 생물공학회지(Journal of Bioscience and Bioengineering), 79, 299-302 (2001)
비-특허 문헌 13: Nomachi W 등., J. Biosci. Bioeng., 93(4), p382-387, 2002
비-특허 문헌 14: 양조의 사전, p352-371, 주식회사 아사쿠라 서점(Asakura Publishing, Co., Ltd.,),1988년 11월 1일 초판 발행
특허 문헌 1: 일본 특허 공개 제 (평)11-225746 A 호
특허 문헌 2: 일본 특허 공개 제 2001-321154 A 호
특허 문헌 3: 일본 특허 공개 제 2003-265165 A 호
[본 발명이 해결해야 할 과제]
본 발명의 발명자들은 상기 기재한 바와 같은 통상적인 문제점을 해결하기 위해 심도깊은 연구를 수행하였다.
그 결과, 본 발명의 발명자들은, 본 발명의 발명자들이 개발한, 배양원료로서 표면이 곡피로 덮인 곡류를 함유하는 액체 배지에서 백국균 및/또는 흑국균을 배양하여, 국균 배양물에서 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제를 동시에 생성 및 축적시키는 것에 의해 고활성의 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제를 갖는 액체국을 제조하는 방법 (예를 들어, 일본 특허 번호 제 2004-3506631호 참조)에 있어서, 상기 액체 배지 중에 사용되는 배양 원료의 양을 조절함으로써 식물섬유분해 효소의 활성이 증강될 수 있다는 것을 발견했다. 상기 발견에 따라, 본 발명은 완성되었다.
일본 특허 출원 번호 제 2004-350661 호의 명세서에 개시된 바와 같은 곡피를 갖는 원료로 액체국을 제조하는 경우, 식물섬유분해 효소의 고수율로의 생산 거동 또는 생산 방법은 공지되지 않았다는 것을 주목해야 한다. 추가로, 액체국을 사용한 소주의 제조도 전혀 보고되지 않았다.
본 발명의 제 1 양태의 목적은 고가의 식물섬유분해 효소 제제 또는 유전자 재조합 균주의 사용 없이 고체 배양 대신 액체 배양에 의해, 식물섬유분해 효소의 증강된 활성을 갖는 액체국을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
추가로, 본 발명의 제 1 양태의 또다른 목적은 식물섬유분해 효소의 증강된 활성을 갖는 액체국을 사용하여, 소주와 같은 발효 음식을 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
액체국은 액체 상태여서, 펌핑(pumping) 과 같은 그 조종이 용이하다는 장점이 있다. 그러나, 액체국을 감압 건조와 같은 방법으로 처리하여 수득한 건조물도, 액체국과 유사한 발효성이 얻어질 수만 있다면, 소주와 같은 발효 음식 제조의 효율화에 기여할 것이라고 여겨진다.
본 발명의 제 6 양태의 목적은 소주와 같은 발효 음식 제조의 효율화에 기여할 수 있는 액체국 건조물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
즉, 본 발명의 제 6 양태의 목적은 고활성의 당아밀라제, 내산성 α-아밀라제 및 식물섬유분해 효소를 갖고 추가로 조종면에서 우수한 액체국 건조물의 제조 방법을 제공하는 것이다.
추가로, 본 발명의 제 6 양태의 목적은 상기 기재된 바와 같은 액체국 건조물을 사용하여, 소주와 같은 발효 음식을 효율적으로 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 제 21 양태의 목적은 알콜 발효를 위해 요구되는 효소 활성을 충분히 갖는 액체국을 개발하여, 상기 액체국을 사용한 발효법에 의해 산업용 알콜 (에탄올) 을 효율적으로 제조하는 방법을 확립하는 것이다.
산업용 알콜 (에탄올) 을 제조하기 위해 사용되는 액체국은 고활성의 당분해 효소 예를 들어, 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제, 및 식물섬유분해 효소를 갖는 것이 요구된다. 그러나, 액체 배지에서 국균을 배양하여 높은 효소활성의 액체국을 수득하는 것에 의한 기술은 아직 개시된 바 없다. 다시 말해, 내산성 α-아밀라제는 일반적으로 액체 배양에 의해 발생되지 않는 효소로 언급되어와서, 높은 내산성 α-아밀라제 활성을 갖는 액체국은 아직 개발되지 않았다.
따라서, 상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 제 21 양태의 목적은 고활성의 당아밀라제, 내산성 α-아밀라제 및 식물섬유분해 효소를 갖는 액체국을 개발하고, 상기 액체국을 사용한 발효법에 의해 산업용 알콜 (에탄올) 을 효율적으로 제조하는 방법을 확립하는 것이다.
[과제를 해결하기 위한 수단]
본 발명의 제 1 양태에 따르면, 배양 원료로서 표면의 전부 또는 일부가 적어도 곡피로 덮인 곡류를 함유하는 액체 배지, 배양 원료로서 표면이 외피로 덮인 콩 및/또는 구근을 함유하는 액체 배지 및 배양 원료로서 전처리 예를 들어, 세쇄(grinding) 및 분쇄를 하지 않은 비름(amaranthus) 및/또는 퀴노아(quinoa)를 함유하는 액체 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 액체 배지에서 국균을 배양하는 것에 의해 식물섬유분해 효소의 증강된 활성을 갖는 액체국을 제조하는 방법으로서, 상기 액체 배지 중에 사용된 배양 원료의 양을 조절하여 국균 배양물에서 적어도 당아밀라제, 내산성 α-아밀라제 및 식물섬유분해 효소를 동시에 생성 및 축적시킨 액체국의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 2 양태에 따르면, 발명의 제 1 양태에 있어서, 식물섬유분해 효소가 섬유소분해 효소 및/또는 자일란분해 효소를 포함하는 액체국의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 3 양태에 따르면, 발명의 제 1 양태에 있어서, 국균이 백국균 및/또는 흑국균을 포함하는 액체국의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 4 양태에 따르면, 발명의 제 1 양태에 있어서, 배양 원료로서 표면의 전부 또는 일부가 적어도 곡피로 덮인 곡류를 함유하는 액체 배지, 배양 원료로서 표면이 외피로 덮인 콩 및/또는 구근을 함유하는 액체 배지 및 배양 원료로서 전처리 예를 들어, 세쇄 및 분쇄를 하지 않은 비름 및/또는 퀴노아를 함유하는 액체 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 액체 배지에서 국균을 배양하는 것에 의해 액체국을 제조하는 방법으로서, 상기 액체 배지 중에 사용된 배양 원료의 양을 1.4 내지 1.8 (w/vol)로 조절하고, 배양 조건을 37 ℃, 42 시간으로 하여, 국균 배양물에서 적어도 당아밀라제, 내산성 α-아밀라제 및 식물섬유분해 효소를 동시에 생성 및 축적시킨 액체국의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 5 양태에 따르면, 제 1 양태 내지 제 4 양태 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득되는 액체국이 제공된다.
본 발명의 제 6 양태에 따르면, 발명의 제 5 양태에 따른 액체국을 건조시키는 것을 포함하는, 액체 배지로 액체국 건조물을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제 7 양태에 따르면, 본 발명의 제 6 양태에 따른 방법에 의해 수득되는 액체국 건조물이 제공된다.
본 발명의 제 8 양태에 따르면, 발명의 제 5 양태에 따른 액체국을 사용하는 것을 포함하는 효소 제제의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 9 양태에 따르면, 제 8 양태에 따른 방법에 의해 수득되는 효소 제제가 제공된다.
본 발명의 제 10 양태에 따르면, 배양 원료로서 표면의 전부 또는 일부가 적어도 곡피로 덮인 곡류를 함유하는 액체 배지, 배양 원료로서 표면이 외피로 덮인 콩 및/또는 구근을 함유하는 액체 배지 및 배양 원료로서 전처리 예를 들어, 세쇄 및 분쇄를 하지 않은 비름 및/또는 퀴노아를 함유하는 액체 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 액체 배지에서 국균을 배양하는 것에 의해 효소를 제조하는 방법에 있어서, 상기 액체 배지 중에 사용된 배양 원료의 양을 조절하여 국균 배양물에서 적어도 당아밀라제, 내산성 α-아밀라제 및 식물섬유분해 효소를 동시에 발생 및 축적시킨 효소의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 11 양태에 따르면, 발명의 제 10 양태에 있어서, 식물섬유분해 효소가 섬유소분해 효소 및/또는 자일란분해 효소를 포함하는 효소의 제조 방법이제공된다.
본 발명의 제 12 양태에 따르면, 발명의 제 10 양태에 있어서, 국균이 백국균 및/또는 흑국균을 포함하는 효소의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 13 양태에 따르면, 발명의 제 10 양태에 있어서, 배양 원료로서 표면의 전부 또는 일부가 적어도 곡피로 덮인 곡류를 함유하는 액체 배지, 배양 원료로서 표면이 외피로 덮인 콩 및/또는 구근을 함유하는 액체 배지 및 배양 원료로서 전처리 예를 들어, 세쇄 및 분쇄를 하지 않은 비름 및/또는 퀴노아를 함유하는 액체 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 액체 배지에서 국균을 배양하는 것에 의해 효소를 제조하는 방법으로서, 상기 액체 배지 중에 사용된 배양 원료의 양을 1.4 내지 1.8% (w/vol)로 조절하고, 배양 조건을 37 ℃, 42 시간으로 하여, 국균 배양물에서 적어도 당아밀라제, 내산성 α-아밀라제 및 식물섬유분해 효소를 동시에 생성 및 축적시킨 효소의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 14 양태에 따르면, 제 10 양태 내지 제 13 양태 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득되는 효소가 제공된다.
본 발명의 제 15 양태에 따르면, 발명의 제 5 양태에 따른 액체국을 사용하는 것을 포함하는, 발효 음식의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 16 양태에 따르면, 발명의 제 15 양태에 따른 발효 음식의 제조 방법으로서, 상기 발효 음식이 소주인 방법이 제공된다.
본 발명의 제 17 양태에 따르면, 발명의 제 7 양태에 따른 액체국 건조물을 사용하는 것을 포함하는 발효 음식의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 18 양태에 따르면, 발명의 제 9 양태에 따른 효소 제제를 사용하는 것을 포함하는 발효 음식의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 19 양태에 따르면, 발명의 제 14 양태에 따른 효소를 사용하는 것을 포함하는 발효 음식의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 20 양태에 따르면, 제 15 양태 내지 제 19 양태 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득되는 발효 음식이 제공된다.
본 발명의 제 21 양태에 따르면, 발명의 제 5 양태에 따른 액체국을 사용하는 것을 포함하는 에탄올의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 22 양태에 따르면, 발명의 제 7 양태에 따른 액체국 건조물을 사용하는 것을 포함하는 에탄올의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 23 양태에 따르면, 발명의 제 9 양태에 따른 효소 제제를 사용하는 것을 포함하는 에탄올의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 24 양태에 따르면, 발명의 제 14 양태에 따른 효소를 사용하는 것을 포함하는 에탄올의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 25 양태에 따르면, 제 21 양태 내지 제 24 양태 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득되는 에탄올이 제공된다.
[발명의 효과]
본 발명의 제 1 양태에 따라, 고가의 식물섬유분해 효소 제제 또는 유전자 재조합 균주의 사용 없이 고체 배양 대신 액체 배양에 의해, 식물섬유분해 효소 예를 들어, 섬유소분해 효소 (셀룰라제) 및 자일란분해 효소의 증강된 활성을 갖는 액체국을 제조할 수 있다.
추가로, 본 발명의 제 1 양태에 따라, 식물섬유분해 효소의 증강된 활성을 갖는 액체국을 사용하여, 소주와 같은 발효 음료를 효율적으로 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제 1 양태에 따라, 예를 들어, 소주가 발효 음식으로서 제조되는 경우에, 소주 매시의 점도가 감소되어 가동성은 현저하게 향상될 것이 기대된다. 추가로, 알콜 수율의 증가와 같은 원료 이용률의 향상 또한 기대되어, 소주와 같은 발효 음식의 제조에 있어 추가의 효율화가 유도된다.
본 발명의 제 6 양태에 따라, 높은 활성의 당아밀라제, 내산성 α-아밀라제 및 식물섬유분해 효소를 갖고, 추가로 조종면에서 용이한 액체국 건조물을 제조할 수 있다.
생성물은 건조물이어서, 기대치 않은 제조에도 시의적절하게 대응할 수 있다는 장점이 있다.
추가로, 상기 특색 때문에, 액체국 건조물은 다양한 발효 음식을 효율적으로 제조하는 데 사용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 제 6 양태에 따라 제조된 액체국 건조물의 사용에 의하면, 미건조 액체국 또는 통상의 고체국을 사용하는 것에 의해 수득될 수 있는 소주 매시와 거의 동등한 정도의 발효성이 수득될 수 있고, 제조된 소주는 관능적으로도 손색없이, 미건조 액체국 또는 고체국을 사용하여 제조한 소주와 거의 동등한 정도의 품질을 갖는다.
추가로, 본 발명의 제 21 양태에 따라, 액체국을 사용하여 발효법에 의해 에탄올을 제조하는 방법이 제공된다.
상기 방법에 따라, 통상적인 고체국을 사용한 발효에 의해 에탄올을 제조하는 방법으로 수득한 에탄올과 거의 같은 정도로 높은 알콜 함량을 갖는 매시를 제조할 수 있게 된다. 높은 알콜 함량을 갖는 매시의 제조는 규모의 축소 및 에너지 절약에 기여할 수 있다.
본 발명의 제 21 양태에 따라, 알콜 발효를 위해 요구되는 효소 활성을 충분히 갖는 액체국을 사용한 발효법에 의해 산업용 알콜 (에탄올) 을 효율적으로 제조할 수 있다.
[도면의 간단한 설명]
수반된 도면에서:
도 1 은 실시예 2 에 사용된 상이한 양의 현맥을 갖는 다양한 액체국을 사용한 대맥 소주의 제조에서 발효 공정을 나타내는 그래프이고;
도 2 는 실시예 2 에 사용된 상이한 양의 현맥을 갖는 다양한 액체국을 사용하여 수득된 대맥 소주 매시의 매시 점도 측정 결과를 나타내는 그래프이며; 및
도 3 은 중량의 누진적(cumulative) 감소에 따른, 실시예 4 에서의 미건조구 및 건조구 중 발효 공정을 나타내는 그래프이다.
[본 발명을 수행하기 위한 최상의 구현예]
이 후, 본 발명은 상세하게 기재될 것이다.
본 발명의 제 1 양태는 배양 원료로서 표면의 전부 또는 일부가 적어도 곡피로 덮인 곡류를 함유하는 액체 배지, 배양 원료로서 표면이 외피로 덮인 콩 및/또는 구근을 함유하는 액체 배지 및 배양 원료로서 전처리 예를 들어, 세쇄 및 분쇄를 하지 않은 비름 및/또는 퀴노아를 함유하는 액체 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 액체 배지에서 국균을 배양하는 것에 의해 식물섬유분해 효소의 증강된 활성을 갖는 액체국을 제조하는 방법으로서, 상기 액체 배지 중에 사용된 배양 원료의 양을 조절하여 국균 배양물에서 적어도 당아밀라제, 내산성 α-아밀라제 및 식물섬유분해 효소를 동시에 생성 및 축적시킨 액체국의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제 1 양태에서, 배양 원료로서 표면의 전부 또는 일부가 적어도 곡피로 덮인 곡류를 함유하는 액체 배지, 배양 원료로서 표면이 외피로 덮인 콩 및/또는 구근을 함유하는 액체 배지 및 배양 원료로서 전처리 예를 들어, 세쇄 및 분쇄를 하지 않은 비름 및/또는 퀴노아를 함유하는 액체 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 액체 배지를 사용하였고, 국균은 상기 액체 배지에서 배양하였다. 그러므로, 곡류에서 전분의 당화에 많은 시간이 걸리고, 배양계로의 당류의 방출 속도가 억제되어, 액체국의 효소 활성은 증강된다.
본 발명의 제 1 양태에서, 액체국의 배양 원료로 사용되는 곡류의 예는 대맥, 나맥(裸麥), 쌀, 밀, 메밀, 피, 조, 기장, 고량, 옥수수 등을 포함한다. 배양 원료는 표면의 전부 또는 일부가 적어도 곡피로 덮인 형태일 것을 요구한다. 미정백물 또는 적어도 곡피가 낟알의 표면에 남아있는 정도까지 정백된 정맥 비율 이상의 것 등을 사용할 수 있고, 현미, 현맥 등을 또한 사용할 수 있다. 쌀의 경우에, 현미, 왕겨(chaffs)가 모두 남아 있는 쌀 및 부분적으로 남아 있는 쌀을 사용할 수 있다.
곡류가 대맥인 경우, 미정백의 정백 비율 100 % 의 것, 또는 미정백의 정백 비율을 100 % 로 하고, 미정백의 정백 비율(100%)로부터 대맥의 곡피 비율 (일반적으로 7 내지 8 %) 을 뺀 비율, 즉 약 92% 내지 93% 정도의 정백 비율 이상의 것을 사용할 수 있다.
본원에서, "정백 비율" 이라는 용어는 곡류을 정백한 후에 남아 있는 곡류의 분율을 의미한다. 예를 들어, "정백 비율 90%" 라는 용어는 곡류의 표면층 부분의 곡피 등을 10% 깎아내는 것을 의미한다. 추가로, 본 발명에서, "현맥" 이라는 용어는 미정백의 대맥으로부터 곡피가 낟알의 표면에 남아있는 정도까지 정백된 것까지, 즉 정백 비율 90% 이상의 것을 포함한다. 추가로, "곡피" 라는 용어는 곡류 입자의 표면을 덮는 바깥 부분을 나타낸다.
본 발명의 제 1 양태에서, 액체국의 배양 원료로서 사용된 콩 및 구근의 예는 대두, 팥, 고구마 등이다. 이들 배양 원료는 그들의 외피 위의 흙만 씻어 내고, 절단, 분쇄 등의 과정은 거치지 않는다.
본 발명의 제 1 양태에 있어서, 액체국의 배양 원료로서 사용된 "비름"은 비름속 비름과에 속하는 식물의 일반명이다. 곡류 중, 비름은 단백질 함량이 높고, 아미노산 중의 하나인 리신의 함량은 대두와 거의 동일하다. 게다가, 비름은 정제된 쌀과 비교할 때, 많은 양의 칼슘, 철, 및 섬유소를 함유한 영양가 높은 곡류이다. 원산지는 남/중앙 아메리카, 인도, 히말라야, 및 네팔의 특정 지역이다. 반대로, 퀴니아는 아가타(Agatha)과의 일년생 풀이고, 주로 페루 남부 및 볼리비아 서부에 위치한 안데스와 같은 고지에서 재배한다. 퀴니아는 미네랄, 비타민, 단백질 및 식이 섬유가 풍부하다.
배양 원료로서 사용되는 비름 및 퀴니아는 단독으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 이들 배양 원료는 세쇄 또는 분쇄와 같은 전처리 없이 바로 액체 배지를 제조하는데 사용될 수 있다.
상기-언급된 배양 원료 중 하나를 단독으로 사용하거나, 또는 그들 중 둘 이상의 조합을 하기의 액체 배지를 제조하는데 사용한다.
즉, 배양 원료는 물과 혼합하여 액체 배지를 제조한다.
본 발명에서, 액체 배지에 사용하는 배양 원료의 양을 조절할 필요가 있다.
일반적으로, 배양 원료량이 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제가 균형 잡힌 방법으로 생성 및 축적될때의 양보다 약간 적은 경우 식물섬유분해 효소 예를 들어, 섬유소분해 효소(셀룰라제) 및 자일란분해 효소(자일라나제)가 증강된다.
액체 배지에 사용되는 배양 원료량은 국균이 배양되는 동안 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제가 선택적으로 생성 축적되고, 동시에 식물섬유분해 효소 예를 들어, 섬유소분해 효소(셀룰라제) 및 자일란분해 효소(자일라나제)가 증강되는 범위 내이다.
특히, 예를 들어, 대맥 또는 나맥을 배양 원료로 사용하는 경우, 물에 대해 대맥 또는 나맥을 1 내지 20% (w/vol) 첨가한 액체 배지로 제조된다. 미정백의 대맥 또는 나맥을 사용하는 경우, 보다 바람직하게는, 8 내지 10% (w/vol) 첨가한 액체 배지로 조제된다. 배양 원료로서 95%-정백된 대맥 및 나맥을 사용하는 경우, 보다 바람직하게는, 1 내지 4% (w/vol) 첨가한 액체 배지로 제조된다.
본 발명의 제 4 양태에 기재된 바와 같이, 배양 조건이 37 ℃, 42 시간인 경우, 대맥 또는 나맥을 1.4 내지 1.8% (w/vol) 또는 바람직하게는 1.4 내지 1.7% (w/vol) 물에 첨가한 액체 배지로 제조된다. 원료로서 미정제 대맥 또는 나맥을 사용하는 경우 및 95%-정백된 대맥 또는 나맥을 사용하는 경우 동일하게 적용된다.
왕겨가 제거된 현미를 배양 원료로 사용하는 경우, 물에 대해 현미를 1 내지 20% (w/vol), 바람직하게는 5 내지 13% (w/vol), 또는 보다 바람직하게는 8 내지 10% (w/vol) 첨가한 액체 배지로 제조된다.
콩을 배양 원료로 사용하는 경우, 물에 대해 콩을 1 내지 10% (w/vol), 또는 바람직하게는, 대두를 8 내지 10% (w/vol) 또는 팥을 1 내지 2% (w/vol) 첨가한 액체 배지로 제조된다. 구근을 배양 원료로 사용하는 경우, 물에 대해 구근을 1 내지 10% (w/vol) 첨가한 액체 배지로 제조된다.
비름을 배양 원료로 사용하는 경우, 물에 대해 비름을 1.5 내지 15% (w/vol), 바람직하게는 2 내지 10% (w/vol), 또는 보다 바람직하게는 2 내지 8% (w/vol) 첨가한 액체 배지로 제조된다. 퀴노아를 배양 원료로 사용하는 경우, 물에 대해 퀴노아를 1.5 내지 7% (w/vol), 바람직하게는 2 내지 6% (w/vol), 또는 보다 바람직하게는 2 내지 4% (w/vol) 첨가한 액체 배지로 제조된다.
혼합에 사용되는 배양 원료량은 사용하는 배양 원료의 종류, 배양 원료의 정제 정도 등에 따라 다양할 수 있기 때문에 적절하게 선택될 수 있다.
국균을 배양 원료가 상기 언급된 범위 내에서 첨가된 액체 배지에서 배양하는 경우, 소주와 같은 발효 음식의 제조에 사용하기에 충분한 효소 활성(당아밀라제 활성 및 내산성 α-아밀라제 활성)을 갖고, 동시에 섬유소분해 효소(셀룰라제) 및 자일란분해 효소(자일라나제)와 같은 식물섬유분해 효소가 증강된 액체국을 제조할 수 있다.
사용되는 배양 원료의 양이 상한치를 초과하면, 섬유소분해 효소(셀룰라제) 및 자일란분해 효소(자일라나제)와 같은 식물섬유분해 효소가 증강된 액체국을 수득할 수 없다. 추가로, 배양액의 점도가 올라가고, 국균을 호기 배양하기 위해 필요한 산소 또는 공기의 공급이 불충분해진다. 배양물에서 산소 함량이 감소하고, 배양 과정을 제한하는 것은 바람직하지 않다. 반대로, 사용되는 원료의 양이 하한치를 만족시키지 못하면, 목적하는 효소가 고수율로 생산되지 않는다.
배양 원료에 포함된 전분은 배양 전에 호화(gelatinized)될 수 있다. 전분을 호화 하는 방법은 특별히 한정되지 않고, 증기법(steaming method) 및 배초법(roasting method) 등을 포함하는 통상적인 방법 중 어느 것에 따라 행할 수 있다. 후술하는 액체 배지를 멸균하는 단계에서, 고온고압 멸균에 의해 전분의 호화온도 이상으로 가열하는 경우에는, 상기 처리에 의해 전분의 호화도 동시에 행하여진다.
상기-언급된 배양 원료에 추가로 유기물, 무기염 등도 영양원으로 액체 배지에 적절하게 첨가하는 것이 바람직하다.
첨가물은 국균의 배양을 위해 일반적으로 사용되는 물질인 이상 특별히 한정되지 않는다. 유기물의 예는 쌀겨(rice bran), 밀기울(wheat bran), 농축발효 옥수수 침출물(corn steep liquor), 대두박(soybean cake) 및 탈지대두(defatted soybean)를 포함한다. 무기염의 예는 수용성 화합물, 예를 들어 암모늄염, 질산염, 칼륨염, 인산염, 칼슘염, 및 마그네슘염 등을 포함한다. 둘 이상의 유기물 및/또는 무기염을 동시에 사용할 수 있다. 이들의 첨가량은 국균의 증식을 촉진하는 정도라면 특별히 한정되지 않는다. 유기물의 첨가량은 바람직하게는 0.1 내지 5% (w/vol) 및 무기염의 첨가량은 바람직하게는 0.1 내지 1% (w/vol) 이다.
수득된 국균의 액체 배지는 따라서 필요한 경우 멸균처리될 수 있고, 처리 방법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 121 ℃ 에서 15 분간 행해지는 고온고압 멸균법일 수 있다.
멸균 액체 배지를 배양 온도까지 냉각하고 이어서 국균을 액체 배지에 접종한다.
본 발명의 제 1 양태에서 사용하는 국균은 전분분해 효소를 생산할 수 있는 효소, 바람직하게는 당분해효소 및 내산성 α-아밀라제를 생산할 수 있는 국균이다. 국균의 특정 예는 아스페르길루스 가와치와 같은 백국균, 아스페르길루스 아와모리 및 아스페르길루스 니게르와 같은 흑국균, 및 아르페르길루스 오리자에 및 아르페르길루스 소야와 같은 황국균을 포함한다.
백국균, 흑국균, 및 황국균은 단독으로 사용할 수 있고, 또는 둘 이상의 조합으로도 사용할 수 있다. 백국균 및 흑국균은 단독으로, 또는 그들 모두가 조합으로 사용되는 것이 바람직하다.
상기 국균은 단일 균주에 의한 배양 또는 동종 또는 이종의 둘 이상의 균주에 의한 혼합 배양 어느쪽에도 사용할 수 있다. 포자 또는 전배양하여 수득된 균사체 형태를 사용하는 것이 허용될 수 있다. 그러나, 균사체를 사용하는 것이 대수증식기(logarithmic growth)에 필요로 하는 시간이 짧아지기 때문에 바람직하다. 액체 배지에 접종되는 국균의 양은 특별히 한정되지 않지만, 액체 배지의 1 ml 당 포자의 수는 약 1 x 104 내지 1 x 106 개 정도일 수 있다. 균사체의 경우는, 전배양액을 약 0.1 내지 10% 접종하는 것이 바람직하다.
국균의 배양 온도는 생육에 영향을 미치지 않는한 특별히 한정되지는 않지만, 바람직하게는 25 내지 45 ℃, 보다 바람직하게는 30 내지 40 ℃ 에서 행하는 것이 좋다. 배양 온도가 낮으면, 국균의 증식이 늦어지기 때문에 잡균에 의한 오염이 일어나기 쉬워진다. 따라서, 배양 시간은 24 내지 72 시간의 범위로 하는 것이 바람직하다.
배양 장치는 액체 배양을 행할 수 있는 것이면 된다. 국균은 호기배양되어야 한다. 따라서, 산소 또는 공기가 배지로 공급될 수 있는 호기적 조건 하에서 배양을 행하여야 한다. 추가로, 배양 중에는 배지를 교반시켜 원료, 산소, 및 국균이 장치 내에 균일하게 분포될 수 있도록 하는 것이 바람직하다. 교반 조건 및 통기량에 대해서는, 호기 배양 환경이 유지되는 한 어떤 조건이라도 되고 따라서 배양 장치, 배지의 점도 등에 따라 적절하게 선택할 수 있다.
상기 언급한 배양 방법에 의한 배양으로, 액체국에서 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제와 같은 효소가 동시에 균형잡힌 방식으로 생성되고, 동시에 식물섬유분해 효소 예를 들어, 섬유소분해 효소(셀룰라제) 및 자일란분해 효소(자일라나제)의 활성이 증강된다.
본 발명에서 액체국은 배양물 자체, 원심 분리 등에 의해 배양물로부터 수득된 배양액, 그들의 농축 또는 건조물 등이다.
상기 언급한대로, 상기 언급한 배양 방법에 따라, 효소 예를 들어, 당아밀라제, 내산성 α-아밀라제, 섬유소분해 효소, 및 자일란분해 효소가 고수율로 수득된다.
그러므로, 본 발명의 제 10 양태에 기재된 효소 제조 방법은 실질적으로 상기 기재된 액체국 제조 방법과 동일하다.
본 발명의 제 5 양태에 따른 액체국은 본 발명의 제 1 양태에 따른 방법에 의해 생산될 수 있다.
본 발명의 제 1 양태에 따른 제조 방법으로 수득된, 본 발명의 제 5 양태에 따른 액체국은 본 발명의 제 15 양태에 기재된 바와 같이, 발효 음식 예를 들어, 소주, 일본주, 간장, 된장 및 미림을 제조하는데 적절하게 사용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 제 16 양태에 기재된 바와 같이 소주를 제조하는 경우에 소주 매시를 매싱하는 단계; 일본주를 제조하는 경우에, 효모 또는 일본주 매시를 매싱하는 단계; 간장을 제조하는 경우에, 담금(piling) 단계; 된장을 제조하는 경우에, 매싱 단계; 미림을 제조하는 경우에, 매싱 단계에 있어서 고체국 대신 액체국을 사용할 수 있다.
상기-언급된 액체국을 사용하여 소주와 같은 발효 음식을 제조하는 경우에는, 전체 공정을 액상에서 행할 수 있다. 전체 공정을 액상에서 행하는 발효 음식의 제조 방법으로는, 예를 들어, 소주를 제조하는 경우, 옥수수, 밀, 쌀, 감자, 사탕수수 등을 원료로 사용하고, 약 80 ℃ 로 가열된 상기 원료를 내열성 효소 제제를 사용하여 녹여 액화한 후, 상기 액체국 및 효모를 첨가함으로써 매시가 알콜 발효되도록 하며, 이어서 상압 증류법 또는 감압 증류법 등에 의해 증류하여 제조하는 방법을 들 수 있다.
본 발명의 제 1 양태에 따른 방법에 의해 수득되는 액체국은 높은 효소 활성을 가져서, 효소 제제, 소화제 등과 같은 의약품으로도 이용될 수 있다. 이러한 경우, 수득되는 국균의 배양물을 통상적 방법으로 목적하는 범위로 농축, 정화하고 적절한 부형제, 증점제, 감미료 등을 첨가할 수 있다.
본 발명의 제 6 양태에 따라, 상기 언급한대로 수득된 액체국을 건조하는 것을 포함하는 액체국 건조물을 제조하는 방법이 제공된다.
바람직한 건조 방법은 동결 건조, 및 효소의 불활성이 거의 일어나지 않기 때문에 특히, 진공 동결 건조가 보다 바람직하다. 진공 동결 건조는 통상적인 방법에 의해 수행될 수 있다. 진공 동결 건조를 위한 조건은 특별히 제한되지 않지만, 일반적으로, 전동결이 -10℃ 내지 -40℃ 의 온도에서 1 내지 6 시간 동안 수행될 수 있고, 이어서 건조는 5 내지 30℃ 에서 10 내지 30 시간 동안 1 토르(Torr) 이하의 진공 상태에서, 또는 바람직하게는 0.7 토르 이하에서 수행될 수 있다.
이러한 방법으로, 의도하는 액체국 건조물을 제조할 수 있다.
본 발명의 제 6 양태에 따른 제조 방법에 의해 수득된, 본 발명의 제 7 양태에 따른 액체국 건조물은 본 발명의 제 17 양태에 기재된 발효 음식의 제조를 위해 안정적으로 사용될 수 있다.
예를 들어, 일본주를 제조하는 경우에, 효모 또는 일본주 매시를 매싱하는 단계; 소주를 제조하는 경우에, 소주 매시를 매싱하는 단계; 간장을 제조하는 경우에, 담금(piling) 단계; 된장을 제조하는 경우에, 매싱 단계; 미림을 제조하는 경우에, 매싱 단계에 있어서 고체국 또는 액체국 대신에 액체국 건조물을 사용할 수 있다.
액체국 건조물을 사용하여 발효 음식을 제조하는 경우, 액체국 건조물을 변형없이 효소 제제로 사용할 수 있고, 증맥(蒸麥), 효모균체 및 액체국을 혼합하고 이어서 건조하여 수득한 생성물을 사용할 수도 있고, 또는 다양한 건조 원료를 혼합하여 수득한 제제를 사용할 수도 있다. 상기 기재한 바와 같이, 원료를 일종의 키트로 통합하는 경우, 키트는 소주와 같은 발효 음식이 물의 첨가로 제조될 수 있는 간단한 스타터(starter) 가 된다.
상기 언급한 액체국 건조물을 사용하여 발효 음식을 제조하는 경우, 모든 공정을 액상에서 행할 수 있다. 전체 공정을 액상에서 행하는 발효 음식의 제조 방법으로는, 예를 들어, 소주를 제조하는 경우, 옥수수, 밀, 쌀, 감자, 사탕수수 등을 원료로 사용하고, 약 80 ℃ 로 가열된 상기 원료를 내열성 효소 제제를 사용하여 녹여 액화한 후, 상기 액체국 및 효모를 첨가함으로써 매시가 알콜 발효되도록 하며, 이어서 상압 증류법 또는 감압 증류법 등에 의해 증류하여 제조하는 방법을 들 수 있다.
상기 언급한 제조 방법에 의해 수득한 액체국은 본 발명의 제 21 양태에 따른 발효법에 의한 에탄올 제조에 사용할 수 있다. 에탄올 제조에서, 산업용 알콜 (에탄올) 은 고체국 대신 액체국을 사용한다는 것을 제외하고는 산업용 알콜 (에탄올) 을 생산하는 공지된 방법에 따라 제조한다.
발효법에 따라 에탄올을 제조하는 방법의 예는 하기에 제시되어 있다.
에탄올 제조에 사용하는 원료는 전분 함유 원료일 수 있고, 그들의 예는 예를 들어 대맥, 나맥, 쌀, 밀, 메밀, 피, 조, 기장, 고량 및 옥수수와 같은 곡류; 및 구근 예를 들어, 고구마 및 카사바 (cassava) 를 포함한다.
발효법에 의한 에탄올의 제조는 저온 연속 증자 장치와 같은 연속된 증자 장치를 사용하여 행할 수 있다. 첫번째로, 소주 효모와 같이 에탄올을 제조할 수 있는 효모, 상기 언급한 원료 및 물을 액체국에 첨가하여 매싱을 행한다. 필요하다면 유산(乳酸)을 사용할 수 있다.
매싱 후, 혼합물을 저온에서 증자하고 약 20 내지 30℃ 의 온도에서 발효하여, 일차 매싱 이후의 이차 매싱을 행할 수 있다.
본 발명의 제 21 양태의 경우, 어떠한 효소 제제도 사용되지 않고 액체국만 사용된다 하더라도, 발효의 완결 이후 수득되는 매시는 18 내지 20% 의 높은 알콜 함량을 갖는다.
발효의 완결로 수득되는 매시를 저밀증류기와 같은 증류기, 바람직하게는 연속 증류기로 증류할 수 있고, 거기에서 불순물을 제거하고 매시를 농축할 수 있다. 그 결과, 알콜 농도 95% 이상을 갖는 고품질의 산업용 알콜 (에탄올) 을 제조할 수 있다.
본 발명의 제 21 양태에 따라, 발효 완결 후 수득된 매시가 이미 18 내지 20% 의 높은 알콜 함량을 갖기때문에, 스케일 축소 및 에너지 절약과 같은 효과를 얻을 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예 등과 관련하여 보다 구체적으로 설명할 것이다. 그러나, 본 발명은 이러한 실시예 등에 의해 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
식물섬유분해 효소의 활성이 증강된 국균 배양물 (액체국) 의 제조
(I) 국균 배양물 (액체국) 의 제조
1)전배양 방법: 65% 정백맥 (스털링, 호주산) 8g 및 100ml 물을 500ml 배플 부착 삼각 플라스크에 채우고 121 ℃에서 15분간 오토클레이브 멸균하여 전배양 배지를 수득하였다. 전배양 배지에 백국균 (아스페르길루스 가와치 NBRC4308) 을 1x106/ml 로 접종하고 37 ℃ 에서 진탕 속도 100 rpm 으로 24시간 동안 배양하여 전배양액을 수득하였다.
2)본배양 방법: 0.2 % (w/vol) 의 질산 칼륨 및 0.3% (w/vol) 의 인산 2수소 칼륨을 함유하는 물에 표 1에 나타낸 바와 같이 2.0, 1.9, 1.8, 1.7, 1.6, 1.5 및 1.4% (w/vol) 의 조합비로 현맥 (95% 정백맥 (스털링, 호주산))을 첨가하여 일곱 개의 액체 배지를 준비하였다.
각 액체 배지 3,000 ml 를 5,000 ml 자르 퍼멘터(jar fermentor) (B. E. 마 루비시(Marubishi)사 제조)에 투입하고, 전체를 121 ℃에서 15분간 오토클레이브 멸균하여, 본배양 배지를 수득하였다. 상기 언급한 30 ml 의 전배양액을 각각 본배양 배지에 접종하였다.
그 이후, 37 ℃ 에서 진탕 속도 300 rpm, 통기량 0.5 vvm 에서 42시간 동안 배양하여 국균 배양물 (액체국) 을 수득하였다.
(II) 효소 활성의 측정 방법
섹션 (I) 에서 수득된 국균 배양물 (액체국) 을 당 분해 효소인 당아밀라제 (GA), 내산성 α-아밀라제 (ASAA), 셀룰라제 (CEL), 및 자일라나제 (XYL) 의 각 수율을 위해 측정하였다. 표 1 은 상이한 양의 현맥을 함유하는 액체 배지에서 국균을 배양하여 수득하는 각 국균 배양물 (액체국) 에서의 당아밀라제 (GA), 내산성 α-아밀라제 (ASAA), 셀룰라제 (CEL), 및 자일라나제 (XYL) 의 수율을 나타낸다.
당아밀라제 (GA) 활성은 당화력 분별 정량 키트 (긱코만제)를 사용하여 측정하였다. 내산성 α-아밀라제 (ASAA) 활성 측정을 위해, Sudo S 등: J. Ferment. Bioeng., 76, 105-110 (1993), Sudo S 등: J. Ferment. Bioeng., 77, 483-489 (1994), 및 Shigetoshi Sudo 등: 일본 양조협회지(Journal of the Brewing Society of Japan), 89, 768-774 (1994)에 기재된 방법을 약간 변형하였다. 즉, 산으로 배양물을 처리하여 비내산성 α-아밀라제를 불활성화시킨 후, 이어서 내산성 α-아밀라제의 활성을 α-아밀라제 측정 키트 (긱코만제)로 측정하는 것이다. 보다 구체적으로, 배양액 1 ml 에 100mM 아세트산 완충액 (pH 3) 9 ml 를 첨가하고 37 ℃ 에서 한시간 동안 산처리 한 후에, α-아밀라제 측정 키트 (긱코만제)로 측정하였다.
이어서 식물섬유분해 효소인 셀룰라제 및 자일라나제의 활성을 측정하였다.
첫번째로, 셀룰라제 (CEL) 활성은 카르복시메틸 셀룰로오스 (이후, CMC로 축약) 를 기질로서 효소적 가수분해하여 생성되는 환원당이 DNS (3,5-디니트로살리실산) 과 반응하고, 540 nm 의 흡광증가를 정량하는 방법으로 측정하였다. 보다 구체적으로, 1% CMC 기질용액 (시그마-알드리치(Sigma-Aldrich)사의 상품명 low viscosity 를 100mM 아세트산 완충용액 (pH 5) 에 용해시킴) 1ml 에 배양액 1 ml 을 첨가하고, 40 ℃ 에서 정확히 10 분간 효소반응을 시켰다. 그 이후, 0.75% 디니트로살리실산, 1.2% 수산화 나트륨, 22.5% 주석산 칼륨 나트륨 4수화물 및 0.3% 젖당 1수화물을 함유하는 4ml 의 DNS시약을 첨가하여 잘 혼합하고, 반응을 종료하였다. 반응정지액에 함유된 환원 당량을 정량하기 위해, 반응정지액을 중탕기에서 정확히 15 분간 가열하였다. 계속하여, 실온까지 냉각시킨 후, 540nm 의 흡광도를 측정하는 것으로 포도당에 상응하는 환원 당량을 정량하였다. 1 단위 셀룰라제 (CEL) 활성은, 1 분간 1 μ몰의 포도당에 상응하는 환원당을 생성하는 효소량으로 나타내었다. 구체적으로, 1 단위 셀룰라제 활성은 10 분간 40 ℃ 의 반응 조건 하에서 1 분간 1 μ몰의 포도당에 상응하는 환원당을 생성하는 효소량으로 나타내었다.
이어서, 자일라나제 (XYL) 활성은 오트 스펠츠(oat spelts) 유래 자일란을 기질로서 효소적 가수분해하여 생성되는 환원당이 DNS 와 반응하여, 540 nm 의 흡 광증가를 정량하는 방법으로 측정하였다. 보다 구체적으로, 1% 자일란 기질용액 (시그마-알드리치사 제조의 오트 스펠츠로부터의 자일란을 200mM 아세트산 완충용액 (pH 4.5) 에 용해시킴) 1.9 ml 에 배양액 0.1 ml 을 첨가하고, 40 ℃ 에서 정확히 10 분간 효소반응을 시켰다. 그 이후, 0.75% 디니트로살리실산, 1.2% 수산화 나트륨, 22.5% 주석산 칼륨 나트륨 4수화물 및 0.3% 젖당 1수화물을 함유하는 4ml 의 DNS시약을 첨가하여 잘 혼합하고, 반응을 종료하였다. 반응정지액에 함유된 환원 당량을 정량하기 위해, 반응정지액을 중탕기에서 정확히 15 분간 가열하였다. 계속하여, 실온까지 냉각시킨 후, 540nm 의 흡광도를 측정하는 것으로 자일로즈에 상응하는 환원 당량을 정량하였다. 1 단위 자일라나제 활성은, 10 분간 40 ℃ 의 반응 조건 하에서 1 분간 1 μ몰의 자일로즈에 상응하는 환원당을 생성하는 효소량으로 나타내었다.
표 1 에 나타낸 바와 같이, 사용된 현맥의 양에 따라 다양한 효소의 생성 균형이 변화한다는 것을 확인하였다. 특히, 셀룰라제 (CEL) 및 자일라나제 (XYL) 의 활성은 현맥사용량 1.8 % 이하를 함유하는 시험구에서 현저하게 증가한다는 것을 알았다. 특히, 1.7 % 시험구에서는, 당아밀라제 (GA) 및 내산성 α-아밀라제 (ASAA) 가 균형잡힌 방법으로 생성되면서, 셀룰라제 (CEL) 및 자일라나제 (XYL) 도 균형잡힌 방법으로 고생성되었다.
따라서, 당아밀라제 (GA) 및 내산성 α-아밀라제 (ASAA) 이외의 효소의 활성, 특히 셀룰라제 (CEL) 및 자일라나제 (XYL) 와 같은 식물섬유분해 효소의 활성은 현맥사용량을 미조정하여 증강시킬 수 있다는 것을 밝혔다.
Figure 112008019604664-pct00001
실시예 2
식물섬유분해 효소가 증강된 국균 배양물 (액체국) 을 사용한 알콜 발효
실시예 1 에서, 현맥 2.0% (w/vol), 1.7% (w/vol) 및 1.4% (w/vol) 을 첨가한 액체 배지로 배양하여 수득한 국균 배양물 (액체국) 을 사용하여 알콜 발효를 행했다.
대조구로 2.0% (w/vol), 본 발명의 1 구로 1.7% (w/vol), 본 발명의 2 구로 1.4% (w/vol) 의 양의 현맥을 첨가하여 제조한 액체 배지로 국균을 배양하여, 실시예 1 에서와 같이 국균 배양물을 각각 수득하였다. 70 ml 의 각 국균 배양물을 표 2 에 나타낸 매싱 조합에서 총 184.6 g 대맥 매싱을 위해 사용하였다. 일차 매싱 5 일, 이차 매싱 2 일 및 삼차 매싱 13 일을 포함하는 삼공정 매싱에서 발효 온도를 25℃ 로 유지하였다.
첨가 대맥으로서, 호주산 65 % 정백 스털링을 물로 세정하고 이어서 60 분간 잠금, 30분간 배수 및 이어서 35 분간 쪄서 사용하였다. 추가로, 42.4 g 의 첨가 대맥을 일차 매싱에 공급하였다. 효모로서 소주 효모 (카고시마 효모)를 사용하고, 50 μl 의 소주 효모를 접종하여 30℃, 48 시간 동안 YPD 배지에서 정량적으로 배양하였다.
Figure 112008019604664-pct00002
도 1 은 발효 공정을 나타낸다. 발효 공정은 모든 시험구에서 순조롭게 진행되었다. 특히, 다양한 효소가 균형잡힌 방법으로 생성되는 1.7% 사용구에서 활동적으로 진행되었다. 최종 결과 매시는 2.0% 사용구 (대조구) 에 대해 18.0%, 1.7% 사용구 (본 발명의 1) 에 대하여 19.2% 및 1.4% 사용구 (본 발명의 2) 에 대하여 18.6% 의 알콜 함량을 갖는다. 즉, 1.7% 사용구 (본 발명의 1) 에서 높은 알콜 함량이 관찰되었다.
추가로, 도 2 는 최종 매시를 회전식 점도계로 측정한 점도 결과를 나타낸다. 도 2 로부터 증명되는 바와 같이, 셀룰라제 (CEL) 및 자일라나제 (XYL) 중 어느 하나의 활성을 증강시키는 각, 1.7% 사용구 (본 발명의 1) 에서의 점도 및 1.4% 사용구 (본 발명의 2) 에서의 점도는 2.0% 사용구 (대조구) 와 비교할 때 현저히 감소하였다. 셀룰라제 (CEL) 및 자일라나제 (XYL)의 활성에 의해, 원료로서 대맥에 다량 포함된 식물섬유가 분해되기 때문에 상기 감소가 일어나는 것으로 여겨진다. 매시의 점도 감소는 매시의 유동성 향상, 송액의 용이화 및 증류 작용의 효율화와 같은 커다란 효과를 제공하는 것으로 여겨진다.
상기 결과로부터, 액체 배지가 배양 원료로서 표면의 전부 또는 일부가 적어도 곡피로 덮인 곡류를 함유하고 상기 액체 배지 중 국균 배양에 사용된 배양 원료의 양을 조절하여 국균 배양물에서 적어도 당아밀라제, 내산성 α-아밀라제와 함께 셀룰라제 (CEL) 및 자일라나제 (XYL)와 같은 식물섬유분해 효소를 동시에 생성 및 축적시킬 수 있다는 것을 밝혔다. 식물섬유분해 효소의 활성이 증강된 국균 배양물 (액체국) 을 사용하여 알콜 발효를 수행하는 경우, 수득된 알콜량이 증가될 뿐 아니라, 매시 점도는 감소된다는 것을 확인하였다. 따라서, 생산에 있어 효율의 현저한 촉진 가능성이 제공된다.
매시는 이어지는 단독 증류로 대맥 소주를 제조할 수 있고, 연속적인 증류로 산업용 알콜 (에탄올) 을 용이하게 제공할 수 있다.
실시예 3
국균 배양 건조물의 제조
(I) 국균 배양물 (액체국) 의 제조
1) 전배양 방법: 65% 정백맥 (스털링, 호주산) 8g 및 100ml 물을 500ml 배플 부착 삼각 플라스크에 채우고 121 ℃에서 15분간 오토클레이브 멸균하여 전배양 배지를 수득하였다. 전배양 배지에 백국균 (아스페르길루스 가와치 NBRC4308) 을 1x106/ml 로 접종하고 37 ℃ 에서 진탕 속도 100 rpm 으로 24시간 동안 배양하여 전배양액을 수득하였다.
2)본배양 방법: 2.0% (w/vol) 의 98% 정백맥(스털링, 호주산), 0.2 % (w/vol) 의 질산 칼륨 및 0.3% (w/vol) 의 인산 2수소 칼륨을 함유하는 액체 배지를 제조하였다. 액체 배지 3,000 ml 를 5,000 ml 자르 퍼멘터(jar fermentor) (B. E. 마루비시사 제조)에 투입하고, 전체를 121 ℃에서 15분간 오토클레이브 멸균하여, 본배양 배지를 수득하였다. 상기 언급한 30 ml 의 전배양액을 각각 본배양 배지에 접종하였다. 그 이후, 37 ℃ 에서 진탕 속도 300 rpm, 통기량 0.5 vvm 로 42시간 동안 배양하여 국균 배양물 (액체국) 을 수득하였다.
(II) 국균 배양 (액체국) 건조물의 제조
섹션 (I) 에서 수득한 200 ml 의 국균 배양물 (액체국) 을 -30℃ 에서 2 시간 동안 전동결시켰다. 그 이후, 결과물을 25℃ 에서 24 시간 동안 0.5 토르의 진공 상태에서 건조하여, 2.7 g 의 국균 배양 (액체국) 건조물, 즉, 국균 배양물의 진공 동결 건조물을 수득할 수 있다.
(III) 효소 활성의 측정 방법
섹션 (I) 에서 수득한, 미건조 국균 배양물 (액체국), 즉 미건조물 및 섹션 (II) 에서 수득한 건조 국균 배양물 (액체국), 즉 건조물을 당아밀라제 (GA) 및 내산성 α-아밀라제 (ASAA) 의 수율을 위해 측정하였다.
당아밀라제 (GA) 활성은 당화력 분별 정량 키트 (긱코만제)를 사용하여 측정하였다. 내산성 α-아밀라제 활성 측정을 위해, Sudo S 등: J. Ferment. Bioeng., 76, 105-110 (1993), Sudo S 등: J. Ferment. Bioeng., 77, 483-489 (1994), 및 Shigetoshi Sudo 등: 일본 양조협회지(Journal of the Brewing Society of Japan), 89, 768-774 (1994)에 기재된 방법을 약간 변형하였다. 즉, 산으로 배양물을 처리하여 비내산성 α-아밀라제를 불활성화시킨 후, 이어서 내산성 α-아밀라제의 활성을 α-아밀라제 측정 키트 (긱코만제)로 측정하는 것이다. 보다 구체적으로, 배양액 1 ml 에 100mM 아세트산 완충액 (pH 3) 9 ml 를 첨가하고 37 ℃ 에서 한시간 동안 산처리 한 후에, α-아밀라제 측정 키트 (긱코만제)로 측정하였다.
국균 배양 (액체국) 건조물, 즉, 건조물의 효소 활성을 국균 배양 (액체국) 건조물 270 mg 을 10 mM 아세트산 완충액 (pH 5) 20 ml 에 용해하여 수득한 물질로 측정하였다.
표 3 은 섹션 (I) 에서 수득한 미건조물 및 섹션 (II) 에서 수득한 건조물에서의 효소 활성 결과 측정치를 나타낸다.
표 3 에 나타낸 바와 같이, 액체국은 액체국이 동결 건조되더라도 효소 활성을 잃지 않고, 따라서 액체국의 건조물은 소주 매싱을 위해 충분히 사용될 수 있다는 것을 확인하였다.
Figure 112008019604664-pct00003
실시예 4
국균 배양물 (액체국) 을 사용한 알콜 발효
실시예 3 에서 각각 수득한 미건조물 및 건조물 (미건조구 및 건조구로 각각 나타내는)을 사용하여 알콜 발효를 행했다.
실시예 3 에서 각각 수득한 100 ml 의 미건조물 또는 1.35 g 의 건조물을 표 4 및 5 에 각각 보이는 바와 같은 매싱 조합으로 총 3.7 g 대맥 매싱을 위해 사용하였다. 일차 매싱 4 일 및 이차 매싱 17 일을 포함하는 이공정 매싱에서 발효 온도를 25℃ 로 유지하였다.
첨가 대맥으로서, 호주산 65 % 정백 스털링을 물로 세정하고 이어서 60 분간 잠금, 30분간 배수 및 이어서 35 분간 쪄서 사용하였다. 효모로서 소주 효모 (카고시마 효모)를 사용하고, 50 μl 의 소주 효모를 접종하여 30℃, 48 시간 동안 YPD 배지에서 정량적으로 배양하였다.
Figure 112008019604664-pct00004
Figure 112008019604664-pct00005
도 3 은 매시 중량의 누진적 감소에 의해 수득되는, 미건조구 및 건조구에서의 매시의 발효 공정을 나타낸다.
결과적으로, 도 3 로부터 증명되는 바와 같이, 미건조물로의 매싱을 나타내는 미건조구 및 건조물로의 매싱을 나타내는 건조구 사이에서 발효 공정과 관련하여 차이가 거의 없다는 것이 관찰되었다.
수득된 최종 매시에서 알콜 함량은 미건조구에서 19.6% 및 건조구에서 19.4% 였다. 따라서, 발효는 두 시험구 모두에서 용이하게 진행되었다.
실시예 5
현미 국균 배양물 (액체국) 을 사용한 에탄올의 제조
현미 국균 배양물 (액체국) 의 제조
1) 전배양 방법: 90% 정백미 (코시히카리(Koghihikari)) 8g 및 100ml 물을 500ml 배플 부착 삼각 플라스크에 채우고 121 ℃에서 15분간 오토클레이브 멸균하여 전배양 배지를 수득하였다. 전배양 배지에 백국균 (아스페르길루스 가와치 NBRC4308) 을 1x106/ml 로 접종하고 37 ℃ 에서 진탕 속도 100 rpm 으로 24시간 동안 배양하여 전배양액을 수득하였다.
2)본배양 방법: 8g 의 왕겨만 제거된 현미 (코시히카리), 0.2 g 의 질산칼륨, 0.3 g 의 인산 2수소 칼륨, 및 100 ml 의 물을 500ml 배플 부착 삼각 플라스크에 채우고 121 ℃에서 15분간 오토클레이브 멸균하여 본배양 배지를 수득하였다(본 배양 배지 5 플라스크를 제조하였다). 1 ml 의 각 전배양액을 본배양 배지에 접종하고 이어서 37 ℃ 에서 진탕 속도 100 rpm, 72시간 동안 배양하여 현미 국균 배양물 (액체국) 을 수득하였다.
표 6 에는 생성 현미 국균 배양물 (액체국) 의 효소 활성을 나타낸다.
표 6 에서 나타내는 바와 같이, 생성 현미 국균 배양물 (액체국) 이 양호한 당아밀라제 및 내산성 α-아밀라제 활성을 갖는다는 것을 확인하였다.
Figure 112008019604664-pct00006
(II) 영양 (Feeding) 및 발효
영양 조합을 표 7 에 나타냈다. 소주 효모 (카고시마 효모)를 30℃에서 하루동안 10 ml 의 YPD 배지에서 배양하였다. 그 이후, 1 ml 의 효모 배양액을 원심분리하고, 조제한 효모를 멸균수로 2 회 세정하였다. 회수한 효모 전량을 효모로 사용하였다.
섹션 (I) 에서 수득한 현미 국균 배양물 (액체국), 상기 언급한 효모, 첨가 쌀 (코시히카리 정백미), 90% 유산 및 물을 연속 증자 장치에 투입하였다. 발효 조건은 25℃ 일정온도에서 16 일간 행하였다. 일차 매싱으로부터 3일 후, 이차 매싱을 행하였다.
Figure 112008019604664-pct00007
상기 기재한 대로 수득한, 발효 완결 이후의 현미 국균 배양물 (액체국) 의 매시는 알콜 함량 19.1% 를 갖는다.
(III) 산업용 알콜 (에탄올) 의 제조
섹션 (II) 에서 수득한, 발효의 완결 이후의 현미 국균 배양물 (액체국) 의 매시를 저밀증류기(HP-1000T 특형, 시바타(sibata)과학주식회사제조)로 연속적으로 증류하여, 산업용 알콜 (에탄올) 을 회수할 수 있었다.
수득한 산업용 알콜 (에탄올) 은 알콜 함량 95.3% 을 가졌다.
추가로, 원료로서 현미를 사용한 국균 배양물 (액체국) 을 사용하는 경우 높은 알콜 함량을 갖는 매시를 또한 제조할 수 있었다. 결과적으로, 품질의 손실 없는 산업용 알콜 (에탄올) 을 제조할 수 있었다.
상기 기재한 바와 같이, 본 발명에 따라서, 국균 배양물 (액체국) 을 사용하여 산업용 알콜 (에탄올) 을 제조할 수 있다는 것을 밝혔다.
본 발명의 제 1 양태에 따라, 고가의 식물섬유분해 효소 제제 및 유전자 재조합 균주의 사용 없이 고체 배양 대신 액체 배양에 의해, 식물섬유분해 효소 예를 들어, 섬유소분해 효소 (셀룰라제) 및 자일란분해 효소의 증강된 활성을 갖는 액체국을 제조할 수 있다.
추가로, 본 발명의 제 6 양태에 따라, 당아밀라제, 내산성 α-아밀라제, 및 식물섬유분해 효소의 높은 활성을 갖고 추가로 조종면에서 용이한 액체국 건조물을 생산할 수 있다. 추가로, 생성물이 건조 상태여서, 기대치 않은 제조에도 시의적절하게 대응할 수 있다는 장점이 있다.
본 발명의 제 21 양태에 따라, 알콜 발효를 위해 요구되는 효소 활성을 충분히 갖는 액체국을 사용한 발효법에 의해 산업용 알콜 (에탄올) 을 효율적으로 제조할 수 있다.
따라서, 본 발명은 음식의 제조 분야, 화학 산업 분야 및 에너지 산업 분야에서 효율적으로 이용될 것으로 기대된다.

Claims (32)

  1. 배양 원료로서 표면의 전부 또는 일부가 적어도 곡피로 덮인 곡류를 함유하는 액체 배지, 배양 원료로서 표면이 외피로 덮인 콩, 구근, 또는 이들 모두를 함유하는 액체 배지 및 배양 원료로서 전처리하지 않은 비름, 퀴노아, 또는 이들 모두를 함유하는 액체 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 액체 배지에서 국균을 배양하는 것에 의해 식물섬유분해 효소의 증강된 활성을 갖는 액체국을 제조하는 방법으로서, 상기 액체 배지 중에 사용된 배양 원료의 양을 조절하여 국균 배양물에서 적어도 당아밀라제, 내산성 α-아밀라제 및 식물섬유분해 효소를 동시에 생성 및 축적시킨 액체국의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 식물섬유분해 효소가 섬유소분해 효소, 자일란분해 효소, 또는 이들 모두를 포함하는 액체국의 제조 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 국균이 백국균, 흑국균, 또는 이들 모두를 포함하는 액체국의 제조 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 배양 원료로서 표면의 전부 또는 일부가 적어도 곡피로 덮인 곡류를 함유하는 액체 배지, 배양 원료로서 표면이 외피로 덮인 콩, 구근, 이들 모두를 함유하는 액체 배지 및 배양 원료로서 전처리하지 않은 비름, 퀴노아, 또는 이들 모두를 함유하는 액체 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 액체 배지에서 국균을 배양하는 것에 의해 액체국을 제조하는 방법으로서, 상기 액체 배지 중에 사용된 배양 원료의 양을 1.4 내지 1.8% (w/vol)로 조절하고, 배양 조건을 37 ℃, 42 시간으로 하여, 국균 배양물에서 적어도 당아밀라제, 내산성 α-아밀라제 및 식물섬유분해 효소를 동시에 생성 및 축적시킨 액체국의 제조 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는 액체국.
  6. 제 5 항에 따른 액체국을 건조시키는 것을 포함하는, 액체 배지로 액체국 건조물을 제조하는 방법.
  7. 제 6 항에 따른 방법에 의해 수득되는 액체국 건조물.
  8. 제 5 항에 따른 액체국을 사용하는 것을 포함하는 효소 제제의 제조 방법.
  9. 제 8 항에 따른 방법에 의해 수득되는 효소 제제.
  10. 배양 원료로서 표면의 전부 또는 일부가 적어도 곡피로 덮인 곡류를 함유하는 액체 배지, 배양 원료로서 표면이 외피로 덮인 콩, 구근, 또는 이들 모두를 함유하는 액체 배지 및 배양 원료로서 전처리하지 않은 비름, 퀴노아, 또는 이들 모두를 함유하는 액체 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 액체 배지에서 국균을 배양하는 것에 의해 효소를 제조하는 방법에 있어서, 상기 액체 배지 중에 사용된 배양 원료의 양을 조절하여 국균 배양물에서 적어도 당아밀라제, 내산성 α-아밀라제 및 식물섬유분해 효소를 동시에 생성 및 축적시킨 효소의 제조 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 식물섬유분해 효소가 섬유소분해 효소, 자일란분해 효소, 또는 이들 모두를 포함하는 효소의 제조 방법.
  12. 제 10 항에 있어서, 국균이 백국균, 흑국균, 또는 이들 모두를 포함하는 액체국의 제조 방법.
  13. 제 10 항에 있어서, 배양 원료로서 표면의 전부 또는 일부가 적어도 곡피로 덮인 곡류를 함유하는 액체 배지, 배양 원료로서 표면이 외피로 덮인 콩, 구근, 또는 이들 모두를 함유하는 액체 배지 및 배양 원료로서 전처리하지 않은 비름, 퀴노아, 또는 이들 모두를 함유하는 액체 배지로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 액체 배지에서 국균을 배양하는 것에 의해 효소를 제조하는 방법으로서, 상기 액체 배지 중에 사용된 배양 원료의 양을 1.4 내지 1.8% (w/vol)로 조절하고, 배양 조건을 37 ℃, 42 시간으로 하여, 국균 배양물에서 적어도 당아밀라제, 내산성 α-아밀라제 및 식물섬유분해 효소를 동시에 생성 및 축적시킨 효소의 제조 방법.
  14. 제 10 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득되는 효소.
  15. 제 5 항에 따른 액체국을 사용하는 것을 포함하는, 발효 음식의 제조 방법.
  16. 제 15 항에 따른 발효 음식의 제조 방법으로서, 상기 발효 음식은 소주를 포함하는 방법.
  17. 제 7 항에 따른 액체국 건조물을 사용하는 것을 포함하는 발효 음식의 제조 방법.
  18. 제 9 항에 따른 효소 제제를 사용하는 것을 포함하는 발효 음식의 제조 방법.
  19. 제 14 항에 따른 효소를 사용하는 것을 포함하는 발효 음식의 제조 방법.
  20. 제 15 항에 따른 방법에 의해 수득되는 발효 음식.
  21. 제 5 항에 따른 액체국을 사용하는 것을 포함하는 에탄올의 제조 방법.
  22. 제 7 항에 따른 액체국 건조물을 사용하는 것을 포함하는 에탄올의 제조 방법.
  23. 제 9 항에 따른 효소 제제를 사용하는 것을 포함하는 에탄올의 제조 방법.
  24. 제 14 항에 따른 효소를 사용하는 것을 포함하는 에탄올의 제조 방법.
  25. 제 21 항에 따른 방법에 의해 수득되는 에탄올.
  26. 제 16 항에 따른 방법에 의해 수득되는 발효 음식.
  27. 제 17 항에 따른 방법에 의해 수득되는 발효 음식.
  28. 제 18 항에 따른 방법에 의해 수득되는 발효 음식.
  29. 제 19 항에 따른 방법에 의해 수득되는 발효 음식.
  30. 제 22 항에 따른 방법에 의해 수득되는 에탄올.
  31. 제 23 항에 따른 방법에 의해 수득되는 에탄올.
  32. 제 24 항에 따른 방법에 의해 수득되는 에탄올.
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