CN114854594B - 一种食醋复合直投菌种保护剂的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种食醋复合直投菌种保护剂的制备方法，包括(1)培养基配置、(2)活化培养、(3)醋酸菌的固定化、(4)芽孢菌的固定化、(5)固定化菌体制备的效果评价、(6)固定化菌体的复配、(7)复配固定化菌体的冻干保护与(8)包装。本发明改进获得了固定化菌体的制备配方、固定化菌体的复合配方与复合固定化菌体的冻干保护剂配方。本发明应用于传统食醋酿造，以菌体固定化技术、优化的保护剂配方处理菌种，能减少冷冻干燥对菌种的损伤，提高菌种的抗冻能力，从而提高菌种的冷冻干燥存活率以及活菌总数。

Description

一种食醋复合直投菌种保护剂的制备方法
技术领域
本发明涉及微生物应用和食品酿造领域，尤其涉及一种食醋复合直投菌种保护剂的制备方法。
背景技术
酿制食醋依据发酵技术的不同，可以分为单一菌种发酵酿制而成的食醋和多菌种发酵酿制的食醋。其中，中国及其他东南亚国家主要使用多菌种发酵技术，多用于传统固态发酵食醋的酿制。传统固态发酵多为天然开放式的环境，发酵菌种由于受到温度、含氧量、压力等外界不利因素的影响，存活率会降低，导致食醋发酵的效果达不到预期，从而影响成品食醋的质量。而且这些投放的菌种多由上一代以种醅(或种子液)形式带入，存在发酵前需要扩大培养、成本高、不易携带等不利于现代化规模化生产的缺点。
真空冷冻干燥技术是一种在真空条件下通过升华原理除去冷冻中固体水分的有效干燥方法。通过该技术将食醋直投菌种制备成直投式菌粉，进一步对两种或两种以上的菌粉复配而获得食醋复合直投式菌剂，可以在很大程度上减少低温和脱水对菌种细胞的损伤，其细胞活力和稳定性也能够长期保持。在菌粉制备工艺中冷冻干燥保护剂的添加至关重要。为了更有效地克服多菌种发酵不稳定的问题，改善和强化产品的质量，寻求优化的冻干保护剂配方就成为了不少科研工作者的研究热点。
近年来随着科学技术的发展，细胞固定化技术的发展已迈入快车道，广泛应用于食品、医药、发酵工业以及废水处理等领域。其中，包埋法是通过把细胞外包埋入固定化载体空隙内，产生凝胶珠使细胞粘附于材料内部的一类方法；吸附法是一类利用细胞和载体之间的静电、表面张力、范德华应力、生物粘附能力等的影响，使细胞固定于载体表层和内部形成生物膜的方法。这二种方式的好处是成本低、生产简便、可回收再利用、对细菌的危害性较低、固定化细菌密度高、反应条件较温和。目前在直投式菌剂制备过程中，在菌悬液中加入保护剂直接冻干的冻干前处理方式较为常见，但对于冻干前进行菌体固定化处理以保护菌种的研究和报道较少，尤其在食醋酿造领域，而且对于将固定化处理过的菌体进行复配后加入优化的冻干保护剂的相关研究报道更少。
醋酸杆菌是食醋酿造的主要产酸菌，醋酸发酵过程中积累的乙酸会对醋酸菌的生长造成不良作用，从而使总酸产量降低，使成品食醋的酸性风味减少。在食醋发酵中的芽孢杆菌虽然丰度不及醋酸菌、乳酸菌，但是发挥着不可忽视的作用，其所具有耐高温、耐乙酸、耐乙醇等优良特性以及产酸性质可以很好地适应醋酸发酵的酸度高、温度高的特点。因此，保护醋酸发酵中醋酸菌和芽孢菌对食醋品质的提升具有重要意义。
目前，关于食醋复合直投菌种的保护，极少有对醋酸菌和芽孢菌进行固定化后复配加入优化冻干保护剂的研究报道。因此，结合传统固态发酵食醋的特殊酿造环境及其复杂的微生物群落组成，以菌体固定化保护和冻干保护剂优化为切入点，创新食醋复合直投菌剂保护剂的制备方法，对整个食醋行业的发展具有重要意义。
发明内容
发明目的：针对现有技术的不足与缺陷，本发明提供一种食醋复合直投菌种保护剂的制备方法，应用于传统食醋酿造，以菌体固定化技术、优化的保护剂配方处理菌种，能减少冷冻干燥对菌种的损伤，提高菌种的抗冻能力，从而提高菌种的冷冻干燥存活率以及活菌总数。
技术方案：本发明的一种食醋复合直投菌种保护剂的制备方法，其特征在于：
固定化菌体的制备配方：100份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化巴氏醋杆菌对应31～33份的菌悬液，15～17份玉米芯粉，51～53份13％的聚乙烯醇溶液；100份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化凝结芽孢杆菌对应19～21份的菌悬液，9～11份玉米芯粉，69～71份4％的海藻酸钠溶液；
固定化菌体的复合配方：89～91份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化巴氏醋杆菌与9～11份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化凝结芽孢杆菌；
复合固定化菌体的冻干保护剂配方：100份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g复合固定化菌体的冻干保护剂配方对应32～34份复合固定化菌种，4～6份脱脂奶粉，4～6份葡萄糖，1～2份海藻糖，55～57份蒸馏水。
食醋复合直投菌种保护剂的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：
(1)培养基配置：选用巴氏醋杆菌与凝结芽孢杆菌的菌株，配置对应的培养液与培养基；
(2)活化培养：对菌株进行活化培养，制备一级种子液与二级种子液；
(3)醋酸菌的固定化：通过二级种子液接入培养液中进行醋酸菌培养，菌悬液活菌数需达到108CFU/mL以上；100份固定化醋酸菌的制备时，31～33份的菌悬液与15～17份玉米芯粉混匀吸附，吸附醋酸菌的玉米芯粉与51～53份13％的聚乙烯醇溶液混匀冷冻，室温解冻后切块洗涤备用；
(4)芽孢菌的固定化：通过二级种子液接入培养液中进行芽孢菌培养，菌悬液活菌数需达到108CFU/mL以上；100份固定化芽孢菌的制备时，19～21份的菌悬液与9～11份玉米芯粉混匀吸附，吸附芽孢菌的玉米芯粉与69～71份4％的海藻酸钠溶液混匀倒入注射器中，用注射器滴加至4％的CaCl2溶液中交联，洗涤备用；
(5)固定化菌体制备的效果评价：以机械强度、包埋率、产酸量为指标评价醋酸菌、芽孢菌的固定化效果，其中产酸量以游离醋杆菌和游离芽孢菌作为对照，获得固定化达标的醋酸菌与芽孢菌；
(6)固定化菌体的复配：89～91份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化巴氏醋杆菌与9～11份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化凝结芽孢杆菌进行混匀；
(7)复配固定化菌体的冻干保护：选取脱脂奶粉、葡萄糖、海藻糖作为保护剂，100份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g复合固定化菌体的冻干保护剂配方对应32～34份复合固定化菌种，4～6份脱脂奶粉，4～6份葡萄糖，1～2份海藻糖，55～57份蒸馏水；计算冻干存活率；
(8)包装：达标的菌粉装于真空包装袋中，完成食醋复合直投菌种保护剂的制备。
其中，所述的步骤(1)中醋酸菌液体培养基、种子培养基包括葡萄糖、酵母提取物、无水乙醇与蒸馏水，固体培养基添加琼脂粉；芽孢菌液体培养基、种子培养基包括MRS肉汤与与蒸馏水，固体培养基添加琼脂粉。
其中，所述的步骤(2)中将步骤(1)中培养液按10％的接种量制备一级种子液，一级种子液按10％的接种量制备二级种子液。
其中，所述的步骤(5)中机械强度的测量：用质构仪进行测定硬度，测试条件为：Test Speed＝60mm/min，Trigger Force＝0.2N，Deformation＝50.00％，Hold TimeBetween Cycles＝0.00；所述包埋率的测定：收集固化溶液并取离心后重悬的菌液，稀释相同倍数后，分别取10μL稀释后的固化溶液和菌悬液进行活菌计数；包埋率的计算公式为：包埋率(％)＝固化溶液中细菌的存活数/菌悬液中细菌的存活数×100；所述产酸量的测定：将固定化颗粒按10％的接种量接入种子培养基中，醋酸菌于30℃、180r/min摇床培养96h，芽孢菌于40℃、200r/min摇床培养96h，按照GB/T 12456－2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》中“pH计电位滴定法”测定发酵液的酸度，醋酸菌以乙酸计，芽孢菌以乳酸计。
其中，所述的步骤(7)中采用平板计数法测定菌悬液的冻干前活菌数，将冻干后样品复水12h，检测冻干后活菌数；冻干存活率计算公式为：冻干存活率(％)＝冻干后活菌数/冻干前活菌数×100。
制备的食醋复合直投菌种保护剂，加入30℃酒醪中，用于食醋生产。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有以下显著优点：本发明将食醋复合直投菌剂保护剂的制备方法应用于传统食醋酿造，以菌体固定化技术、优化的保护剂配方处理菌种，能减少冷冻干燥对菌种的损伤，提高菌种的抗冻能力，从而提高菌种的冷冻干燥存活率以及活菌总数。
本发明将食醋复合直投菌剂保护剂的制备方法应用于传统食醋酿造，保护微生物的多样性，能提高原料利用率、缩短发酵周期、降低生产成本。
本发明采用食醋复合直投菌剂酿造传统食醋，能避免产品出现不良风味，提高产品品质，可以起到保护传统食醋酿造的作用。
本发明将食醋复合直投菌剂保护剂的制备方法应用于传统食醋酿造，以菌体固定化技术处理菌种，解决发酵环境开放复杂的问题。将食醋复合直投菌剂保护剂的制备方法应用于传统食醋酿造，以优化的保护剂配方处理菌种，解决冷冻干燥对细胞产生较大损害的问题。将食醋复合直投菌剂保护剂的制备方法应用于传统食醋酿造，以克服产品原料效率低下、发酵周期较长、质量不稳、生产成本高等的问题。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案做进一步的描述。
本发明使用的巴氏醋杆菌(Acetobacter pasteurianus)，凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)，保藏于中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，保藏地点为北京市朝阳区酒仙桥中路24号院6号，保藏登记入册的编号分别为CICC 24625，CICC 24873，保藏时间为2018年8月7日，2020年3月13日。
实施例1：
本实施例中固定化菌体的制备配方：100份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化巴氏醋杆菌对应32份的菌悬液，16份玉米芯粉，52份13％的聚乙烯醇溶液；100份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化凝结芽孢杆菌对应20份的菌悬液，10份玉米芯粉，70份4％的海藻酸钠溶液；
固定化菌体的复合配方：90份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化巴氏醋杆菌与10份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化凝结芽孢杆菌；
复合固定化菌体的冻干保护剂配方：100份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g复合固定化菌体的冻干保护剂配方对应33份复合固定化菌种，5份脱脂奶粉，5份葡萄糖，1份海藻糖，56份蒸馏水。
本实施例的食醋复合直投菌种保护剂的制备方法，包括下述步骤：
(1)培养基配置
醋酸菌液体培养基：葡萄糖20g，酵母提取物20g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌15min。灭菌后加2％(v/v)无水乙醇。种子培养基改为5％(v/v)无水乙醇。固体培养基添加20g/L琼脂粉。培养温度30℃，转速180r/min，培养24～36h。
芽孢菌液体培养基、种子培养基：MRS肉汤52.2g，蒸馏水1000mL，121℃灭菌15min。固体培养基添加琼脂粉20g/L。培养温度40℃，转速200r/min，培养24～36h。
(2)活化培养
取出甘油管保藏菌株，取0.1mL转入5mL液体培养基，摇床培养24h。将上述培养液按10％接种量即取5mL转入50mL培养液，摇床培养24h，制备一级种子液。将上述一级种子液按10％接种量即取10mL接入100mL培养液，摇床培养24h后检测活菌数，达到107CFU/mL时取出培养液，作为二级种子液，放入4℃冰箱，可用于后续试验。
(3)醋酸菌的固定化
首先，将二级种子液按10％的接种量接入100mL培养液中，培养24～36h后，5000r/min离心15min，弃去上清液。用无菌水洗涤菌体2次，再离心即得湿菌体，于湿菌体中加入无菌水制成菌悬液，备用。检测菌悬液活菌数，达到108CFU/mL以上，可用于后续试验。其次，将玉米芯烘干，粉碎成3～5mm的均匀小颗粒，121℃灭菌15min，冷却后装PE袋待用。
100份固定化醋酸菌的制备：取32份的菌悬液与16份玉米芯粉混合均匀后，室温吸附12h，无菌水洗涤，4℃保存备用。将已吸附醋酸菌的玉米芯与52份灭菌后的13％的聚乙烯醇溶液均匀混合后，置于-20℃冷冻12h，室温解冻，切块，用无菌水洗涤，4℃保存备用。
(4)芽孢菌的固定化
首先，将二级种子液按10％的接种量接入100mL培养液中，培养24～36h后，5000r/min离心10min，弃上清液。无菌水洗涤菌体2次，离心即得湿菌体，于湿菌体中加入无菌水制成菌悬液，备用。检测菌悬液活菌数，达到108CFU/mL以上，可用于后续试验。其次，将玉米芯烘干，粉碎成3～5mm的均匀小颗粒，121℃灭菌15min，冷却后装PE袋待用。
100份固定化芽孢菌的制备：取20份菌悬液与10份玉米芯粉混合均匀后，室温吸附12h，无菌水洗涤，4℃保存备用。4％的海藻酸钠溶液高温灭菌后，置于超净工作台中冷却至40℃左右。将已吸附芽孢菌的玉米芯与70份4％的海藻酸钠溶液混合均匀后倒入注射器中，用注射器滴加到4％的CaCl2溶液中，4℃下交联24h，无菌水洗涤固定化菌体小球，4℃保存备用。
(5)固定化菌体制备的效果评价
以机械强度、包埋率、产酸量为指标评价醋酸菌、芽孢菌的固定化效果，其中产酸量以游离醋杆菌和游离芽孢菌作为对照。
固定化颗粒机械强度的测量：用质构仪进行测定硬度，测试条件为：Test Speed＝60mm/min，Trigger Force＝0.2N，Deformation＝50.00％，Hold Time Between Cycles＝0.00。
固定化颗粒包埋率的测定：收集固化溶液并取离心后重悬的菌液，稀释相同倍数后，分别取10μL稀释后的固化溶液和菌悬液进行活菌计数。包埋率的计算公式为：包埋率(％)＝固化溶液中细菌的存活数/菌悬液中细菌的存活数×100。
固定化颗粒产酸量的测定：将固定化颗粒按10％的接种量接入种子培养基中，醋酸菌于30℃、180r/min摇床培养96h，芽孢菌于40℃、200r/min摇床培养96h，按照GB/T12456－2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》中“pH计电位滴定法”测定发酵液的酸度，醋酸菌以乙酸计，芽孢菌以乳酸计。
表1醋杆菌和芽孢菌的固定化结果
固定化醋杆菌 游离醋杆菌 固定化芽孢菌 游离芽孢菌
机械强度(N) 2.3 - 2.4 -
包埋率(％) 86.08±0.82 - 85.23±0.67 -
酸度(g/100mL) 4.93±0.09 5.06±0.13 0.81±0.13 0.99±0.07
(6)固定化菌体的复配
在洁净室将90份活菌数为1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化巴氏醋杆菌与10份活菌数为1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化凝结芽孢杆菌混匀。
(7)复配固定化菌体的冻干保护
选取脱脂奶粉、葡萄糖、海藻糖作为保护剂。试验组：将固定化菌体与保护剂溶液混合均匀，取33份复配固定化菌体，加入5份脱脂奶粉、5份葡萄糖、1份海藻糖、56份蒸馏水。对照组：取33份离心后重悬的菌悬液，与5份脱脂奶粉、5份葡萄糖、1份海藻糖、56份蒸馏水混合均匀。
试验组与对照组均置于50mL离心管，分别于-80℃冰箱中预冻2～5h，然后进行真空冷冻干燥，冻干至水分含量降至3％以下，冷冻干燥时间24～36h。采用平板计数法测定菌悬液的冻干前活菌数，将冻干后样品复水12h，检测冻干后活菌数。冻干存活率计算公式为：冻干存活率(％)＝冻干后活菌数/冻干前活菌数×100。
表2固定化及游离醋杆菌加入保护剂后的效果对比
冻干前活菌数(CFU/mL) 冻干后活菌数(CFU/mL) 冻干存活率(％)
试验组 1.42×1010 1.21×1010 85.21
对照组 8.45×109 4.76×109 56.33
表3固定化及游离芽孢菌加入保护剂后的效果对比
冻干前活菌数(CFU/mL) 冻干后活菌数(CFU/mL) 冻干存活率(％)
试验组 1.52×1010 1.33×1010 87.50
对照组 9.02×109 5.26×109 58.31
(8)包装
最后分装于真空包装袋中，于4℃保存。
将本实施例的食醋复合直投菌种保护剂的制备方法获得的保护剂应用在镇江香醋酿造中。提供了一种免用传统种子醅和接种方式，仅使用本专利食醋复合直投菌种保护剂在镇江香醋酿造中的应用。具体包括如下步骤：
(1)取6个350kg大缸，各取糯米32kg，分批淘洗干净，置于食品级物料框内，加适量的水浸泡过夜。浸泡完成后淘米，淘清的米置于蒸饭柜进行蒸煮，用常温水淋饭至温度约40℃，入缸打散，加入酒曲0.6％左右，拌匀后入缸搭窝成喇叭状。
(2)酒精发酵过程，当米酒的量与糯米饭的表面持平时，向缸内加入原料体积2倍的清水进行冲缸，辅以搅拌。冲缸后可加入5％左右的麦曲/大曲(安琪酿酒曲)。冲缸后盖发酵3～4天期间，不断测温以判断发酵情况，保证温度维持在低于32℃，酒精度约为10～12V/V。
(3)取3个350kg大缸为试验组，每个缸中投入大糠，均匀铺底5～10cm，将麸皮与大糠按比例(糯米：麸皮：大糠＝1：1.7：0.8)在空缸内混匀后投入醅缸。投入酒醪之前先稀释，酒精度达到9度即可投料。将酒醪、麸皮、大糠搅拌均匀。取本实施例的复合菌剂20g，加入30℃酒醪约1000g于小桶内搅拌均匀后洒在醋醅的上部，然后用手向下深入约10cm拌匀，最后在顶部盖上1～2cm大糠保温。
(4)取3个350kg大缸为对照组，每个缸中投入大糠，均匀铺底5～10cm，将麸皮与大糠按比例(糯米：麸皮：大糠＝1：1.7：0.8)在空缸内混匀后投入醅缸。投入酒醪之前先稀释，酒精度达到9度即可投料。将酒醪、麸皮、大糠搅拌均匀。每缸取市售光明牌酿醋醋杆菌剂20g，加入30℃酒醪约1000g于小桶内搅拌均匀后洒在醋醅的上部，然后用手向下深入约10cm拌匀，最后在顶部盖上1～2cm大糠保温。
(5)按照镇江香醋酿造工艺进行逐层翻醅，待醋醅发酵至总酸不再增加，即发酵结束。加盐封醅15d，然后加入炒米色进行淋醋。经煎醋、陈酿、杀菌灌装，即得成品。
与对照组相比，使用本实施例的食醋复合直投菌种保护剂的试验组，提热速度快(首次温度达到40℃以上时间缩短18h)，发酵时间由18d缩短至14d，封醅结束后醅卤中不挥发酸含量增加了61.11％达到2.32g/100mL，总酸含量增加了7.66％达到8.01g/100mL，产品出率提高13.34％，获得的产品香气明显，风味丰富，口感柔和饱满，感官评分较高。
表4醅卤主要指标对比(g/100mL)
注：采用滴定法，总酸以乙酸计，不挥发酸以乳酸计。
实施例2：
本实施例中固定化菌体的制备配方：100份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化巴氏醋杆菌对应31份的菌悬液，17份玉米芯粉，52份13％的聚乙烯醇溶液；100份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化凝结芽孢杆菌对应19份的菌悬液，11份玉米芯粉，70份4％的海藻酸钠溶液；
固定化菌体的复合配方：89份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化巴氏醋杆菌与11份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化凝结芽孢杆菌；
复合固定化菌体的冻干保护剂配方：100份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g复合固定化菌体的冻干保护剂配方对应32份复合固定化菌种，6份脱脂奶粉，4份葡萄糖，2份海藻糖，56份蒸馏水。
本实施例的食醋复合直投菌种保护剂的制备方法参见实施例1。
将本实施例的食醋复合直投菌种保护剂的制备方法获得的保护剂应用在镇江香醋酿造中。使用本实施例的食醋复合直投菌种保护剂在镇江香醋酿造中的强化应用。具体包括如下步骤：
(1)取6个350kg大缸，各取糯米32kg，分批淘洗干净，置于食品级物料框内，加适量的水浸泡过夜。浸泡完成后淘米，淘清的米置于蒸饭柜进行蒸煮，用常温水淋饭至温度约40℃，入缸打散，加入酒曲0.6％左右，拌匀后入缸搭窝成喇叭状。
(2)酒精发酵过程，当米酒的量与糯米饭的表面持平时，向缸内加入原料体积2倍的清水进行冲缸，辅以搅拌。冲缸后可加入5％左右的麦曲/大曲(安琪酿酒曲)。冲缸后盖发酵3～4天期间，不断测温以判断发酵情况，保证温度维持在低于32℃，酒精度约为10～12V/V。
(3)取3个350kg大缸为试验组，每个缸中投入大糠，均匀铺底5～10cm，将麸皮与大糠按比例(糯米：麸皮：大糠＝1：1.7：0.8)在空缸内混匀后投入醅缸。投入酒醪之前先稀释，酒精度达到9度即可投料。将酒醪、麸皮、大糠搅拌均匀。取种子醅2kg于醋醅的上部，每缸取本实施例复合菌剂50g，加入30℃酒醪约1000g于小桶内搅拌均匀后洒在醋醅的上部，然后用手向下深入约10cm拌匀，最后在顶部盖上1～2cm大糠保温。
(4)取3个350kg大缸为对照组，每个缸中投入大糠，均匀铺底5～10cm，将麸皮与大糠按比例(糯米：麸皮：大糠＝1：1.7：0.8)在空缸内混匀后投入醅缸。投入酒醪之前先稀释，酒精度达到9度即可投料。将酒醪、麸皮、大糠搅拌均匀。取种子醅2kg于醋醅的上部，每缸取市售光明牌酿醋醋杆菌剂50g，加入30℃酒醪约1000g于小桶内搅拌均匀后洒在醋醅的上部，然后用手向下深入约10cm拌匀，最后在顶部盖上1～2cm大糠保温。
(5)按照镇江香醋酿造工艺进行逐层翻醅，待醋醅发酵至总酸不再增加，即发酵结束。加盐封醅15d，然后加入炒米色进行淋醋。经煎醋、陈酿、杀菌灌装，即得成品。
与对照组相比，使用本专利食醋复合直投菌种保护剂的试验组，发酵时间由19d缩短至15d，封醅结束后醅卤中不挥发酸含量增加了21.89％达到2.45g/100mL，总酸含量增加了4.04％达到8.06g/100mL，产品出率提高10.66％，获得的产品口感柔和性更强，感官评分较高。
表5醅卤主要指标对比(g/100mL)
注：采用滴定法，总酸以乙酸计，不挥发酸以乳酸计。
实施例3：
本实施例中固定化菌体的制备配方：100份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化巴氏醋杆菌对应33份的菌悬液，15份玉米芯粉，52份13％的聚乙烯醇溶液PVA；100份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化凝结芽孢杆菌对应21份的菌悬液，9份玉米芯粉，70份4％的海藻酸钠溶；
固定化菌体的复合配方：91份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化巴氏醋杆菌与9份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化凝结芽孢杆菌；
复合固定化菌体的冻干保护剂配方：100份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g复合固定化菌体的冻干保护剂配方对应34份复合固定化菌种，4份脱脂奶粉，6份葡萄糖，1份海藻糖，55份蒸馏水。
本实施例的食醋复合直投菌种保护剂的制备方法参见实施例1。
将本实施例的食醋复合直投菌种保护剂的制备方法获得的保护剂应用在山西老陈醋酿造中。使用本实施例的食醋复合直投菌种保护剂在山西老陈醋酿造中的强化应用。具体包括如下步骤：
(1)将高粱粉碎为粗粉，加入80％～120％水润料8～14h，蒸煮1～2h后，按高粱、大曲、水10:6.25:3的比例，混匀。
(2)取350kg大缸6个，将上述原料放入大缸，15～30℃室温下进行酒精发酵，前3d敞口发酵，每天搅拌1～2次，后10d封口发酵，共约12d结束。
(3)取3个350kg大缸为试验组，每个缸中加入酒醪100kg，搅拌均匀后加入麸皮50kg，谷糠25kg，稻壳15kg，将酒醪和谷物混合均匀。取本实施例的复合菌剂50g，加入30℃酒醪约1000g于小桶内搅拌均匀后洒在1缸醋醅的上部拌匀，按照山西老陈醋的工艺进行翻醅操作。
(4)取3个350kg大缸为对照组，每个缸中加入酒醪100kg，搅拌均匀后加入麸皮50kg，谷糠25kg，稻壳15kg，将酒醪和谷物混合均匀。取市售光明牌酿醋醋酸剂50g，加入30℃酒醪约1000g于小桶内搅拌均匀后洒在1缸醋醅的上部拌匀，在室温15～30℃的环境中进行醋酸发酵，每天倒缸翻醅。
(5)醋化阶段结束后的醋醅，取总量的40％在80℃的烘箱里熏醅，每天翻醅，共熏4d，剩下60％的醋醅压实后表面撒食盐，结束发酵。然后经过淋醋、煎醋、陈酿、杀菌灌装，即得成品。
与对照组相比，使用本专利食醋复合直投菌种保护剂的试验组，发酵时间由10d缩短至8d，封醅结束后醋醅中不挥发酸含量增加了73.50％达到2.03g/100g，总酸含量增加了18.22％达到5.58g/100g，产品出率提高19.33％，获得产品的风味丰富，口感柔和，感官评分较高。
表6醋醅主要指标对比(g/100g)
注：采用滴定法，总酸以乙酸计，不挥发酸以乳酸计。

Claims (6)

1.一种食醋复合直投菌种保护剂的制备方法，其特征在于：包括下述步骤：
(1)培养基配置：选用巴氏醋杆菌与凝结芽孢杆菌的菌株，配置对应的培养液与培养基；
(2)活化培养：对菌株进行活化培养，制备一级种子液与二级种子液；
(3)醋酸菌的固定化：通过二级种子液接入培养液中进行醋酸菌培养，菌悬液活菌数需达到108CFU/mL以上；100份固定化醋酸菌的制备时，31～33份的菌悬液与15～17份玉米芯粉混匀吸附，吸附醋酸菌的玉米芯粉与51～53份13％的聚乙烯醇溶液混匀冷冻，室温解冻后切块洗涤备用；
(4)芽孢菌的固定化：通过二级种子液接入培养液中进行芽孢菌培养，菌悬液活菌数需达到108CFU/mL以上；100份固定化芽孢菌的制备时，19～21份的菌悬液与9～11份玉米芯粉混匀吸附，吸附芽孢菌的玉米芯粉与69～71份4％的海藻酸钠溶液混匀倒入注射器中，用注射器滴加至4％的CaCl2溶液中交联，洗涤备用；
(5)固定化菌体制备的效果评价：以机械强度、包埋率、产酸量为指标评价醋酸菌、芽孢菌的固定化效果，其中产酸量以游离醋杆菌和游离芽孢菌作为对照，获得固定化达标的醋酸菌与芽孢菌；
(6)固定化菌体的复配：89～91份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化巴氏醋杆菌与9～11份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化凝结芽孢杆菌进行混匀；
(7)复配固定化菌体的冻干保护：选取脱脂奶粉、葡萄糖、海藻糖作为保护剂，100份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g复合固定化菌体的冻干保护剂配方对应32～34份复合固定化菌种，4～6份脱脂奶粉，4～6份葡萄糖，1～2份海藻糖，55～57份蒸馏水；计算冻干存活率；
(8)包装：达标的菌粉装于真空包装袋中，完成食醋复合直投菌种保护剂的制备；
所述的固定化菌体的制备配方：100份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化巴氏醋杆菌对应31～33份的菌悬液，15～17份玉米芯粉，51～53份13％的聚乙烯醇溶液；100份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化凝结芽孢杆菌对应19～21份的菌悬液，9～11份玉米芯粉，69～71份4％的海藻酸钠溶液；
所述的固定化菌体的复合配方：89～91份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化巴氏醋杆菌与9～11份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g固定化凝结芽孢杆菌；
所述的复合固定化菌体的冻干保护剂配方：100份活菌数1.0×108～1.0×1011CFU/g复合固定化菌体的冻干保护剂配方对应32～34份复合固定化菌种，4～6份脱脂奶粉，4～6份葡萄糖，1～2份海藻糖，55～57份蒸馏水。
2.根据权利要求1所述的食醋复合直投菌种保护剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤(1)中醋酸菌液体培养基、种子培养基包括葡萄糖、酵母提取物、无水乙醇与蒸馏水，固体培养基添加琼脂粉；芽孢菌液体培养基、种子培养基包括MRS肉汤与与蒸馏水，固体培养基添加琼脂粉。
3.根据权利要求1所述的食醋复合直投菌种保护剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤(2)中将步骤(1)中培养液按10％的接种量制备一级种子液，一级种子液按10％的接种量制备二级种子液。
4.根据权利要求1所述的食醋复合直投菌种保护剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤(5)中机械强度的测量：用质构仪进行测定硬度，测试条件为：Test Speed＝60mm/min，Trigger Force＝0.2N，Deformation＝50.00％，Hold Time Between Cycles＝0.00；所述包埋率的测定：收集固化溶液并取离心后重悬的菌液，稀释相同倍数后，分别取10μL稀释后的固化溶液和菌悬液进行活菌计数；包埋率的计算公式为：包埋率(％)＝固化溶液中细菌的存活数/菌悬液中细菌的存活数×100；所述产酸量的测定：将固定化颗粒按10％的接种量接入种子培养基中，醋酸菌于30℃、180r/min摇床培养96h，芽孢菌于40℃、200r/min摇床培养96h，按照GB/T 12456－2021《食品安全国家标准食品中总酸的测定》中“pH计电位滴定法”测定发酵液的酸度，醋酸菌以乙酸计，芽孢菌以乳酸计。
5.根据权利要求1所述的食醋复合直投菌种保护剂的制备方法，其特征在于：所述的步骤(7)中采用平板计数法测定菌悬液的冻干前活菌数，将冻干后样品复水12h，检测冻干后活菌数；冻干存活率计算公式为：冻干存活率(％)＝冻干后活菌数/冻干前活菌数×100。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的食醋复合直投菌种保护剂的制备方法，其特征在于：制备的食醋复合直投菌种保护剂，加入30℃酒醪中，用于食醋生产。
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