CN116064251A - 一种米曲霉及其在风味酱油中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种米曲霉菌株WJM008，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 20221829，保藏日期为2022年11月28日。还公开了米曲霉菌株WJM008在风味酱油酿造中的应用。该菌株具有很强的产非淀粉多糖酶的能力，可以很好地水解原料的非淀粉类多糖，实现了酱油酿造原料的高效利用；由于原料中糖分被充分释放，为酵母酒精发酵提供了充足的碳源，可使原油醇香浓郁。

Description

一种米曲霉及其在风味酱油中的应用

技术领域

本发明涉及酱油酿造领域，尤其涉及一株米曲霉及该米曲霉在酱油酿造中的应用。

背景技术

酱油是一种传统调味品，用豆、麦等进行酿造的液体调味品，有独特的酱香，滋味鲜美，能够增进食欲等。但作为发酵型调味品，常会发现其原料利用率不够高，造成了资源的浪费。

酱油因其原料的属性，蛋白质及淀粉是原料中的主要营养供给，长期以来，蛋白酶及淀粉酶一直都是重要的关注点。

由于原料中含有小麦类的谷物，其细胞壁主要由阿拉伯木聚糖、β-葡聚糖和纤维素构成，淀粉酶不能水解上述非淀粉类的多糖，因而，细胞壁中的营养成分难以释放出来，例如纤维素酶可破解富含纤维的细胞壁，使其包含的蛋白质、淀粉等营养物质释放出来并加以利用，同时又可将纤维降解为可被利用的还原糖，因而，通过多种非淀粉多糖酶类与蛋白酶、淀粉酶共同作用，可以更好地将原料中营养物质释放出来，使得发酵原料被充分利用，同时，水解出更多的还原糖，也能为酵母的酒精发酵带来益处，使得制成的原油更具醇香。

米曲霉作为发酵用菌，从菌种出发，筛选出高产非淀粉多糖酶的菌株是解决以上问题的最为便捷的方式。

发明内容

为解决上述技术问题本发明的第一目的是提供一株产孢速度快、高产非淀粉多糖酶的米曲霉菌株，本发明的第二目的是提供一种原料利用率高、原油醇香浓郁的酱油酿造方法。

具体地，本发明第一方面提供了一种米曲霉，所述米曲霉菌命名为WJM008，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M20221829，保藏日期为2022年11月28日。

本发明第二方面提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂包含本发明第一方面所述的米曲霉。

本发明第三方面提供了本发明第一方面所述的米曲霉、本发明第二方面所述的微生物菌剂在风味酱油酿造中的应用。

本发明第四方面提供了一种风味酱油的酿造方法，包括以下步骤：1)原料筛选；2)蒸料；3)制曲；4)发酵；5)酱醪过滤，获得原汁。

在某些实施方式中，所述原料选自黄豆、小麦、黑豆、豆粕。

在某些实施方式中，所述制曲使用本发明第一方面所述的米曲霉或本发明第二方面所述的微生物菌剂。

在某些实施方式中，所述蒸料包括将黄豆、黑豆或豆粕在约110℃干蒸10-15min，之后加入1倍润水120℃蒸20min，蒸煮完成稍冷却与0.8倍的炒小麦进行混匀。

在某些实施方式中，所述制取包括：待料温降至36℃左右，接种3‰-5‰米曲霉WJM008，控制室温28℃-30℃，湿度90％以上，直至后期曲料成熟，并间歇通循环风供氧控制料温在32℃-36℃，促使米曲霉尽快发芽，当料温达到36℃左右，曲料结块且长满菌丝，即可用翻曲机进行第一次翻曲，继续通循环风，控制料温32℃-36℃，再培养，待曲料结块、菌丝丰满进行第二次翻曲，继续通循环风培养，控制料温32℃-36℃，待曲料上遍生黄绿色孢子、曲料疏松滑润，即告成熟。

在某些实施方式中，所述发酵包括：盐水量1.8-2.2倍，最终的盐水浓度在11°Bé左右；低温发酵：温度≤15℃，发酵时间20天；保温发酵：温度控制在30℃左右，发酵40天；自然发酵：常温下继续后熟，继续发酵90天

本发明第五方面提供了一种酱油，所述酱油包括本发明第一方面所述的米曲霉或通过本发明第四方面所述方法制备获得。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明筛选的米曲霉菌株WJM008具有很强的产非淀粉多糖酶的能力，可以很好地水解原料的非淀粉类多糖，实现了酱油酿造原料的高效利用；

(2)本发明的酱油酿造工艺简单，易于实施，生产成本低；

(3)由于原料中糖分被充分释放，为酵母酒精发酵提供了充足的碳源，可使原油醇香浓郁。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更显著：

图1菌株米曲霉(WJM008)的菌落形态图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图，对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1米曲霉WJM008的分离与鉴定

(1)菌株分离

将不同来源的酱油曲料，取2g加入15mL生理盐水中，旋涡震荡混匀，吸取200μL稀释液于PDA平板上，涂布均匀，置于25℃培养，一周后，挑取霉菌菌落，进行划线纯化，结合形态特征，确定5株试验用菌。

(2)菌株产酶性能测定

以实验室5株米曲霉为试验菌株，以PDA为培养基，于25℃培养一周后，挑取适量孢子悬浮于生理盐水中，调整孢子浓度为1×10⁸个/mL，按2％接种量接入基础产酶培养基，置于30℃，100rpm培养5天。以8000rpm离心6min，弃沉淀，上清即为酶液，备用。

取上述酶液，稀释10倍后，分别加入2mL至试管中，之后加入经预热的5mg/mL木聚糖溶液、5mg/mLβ-葡聚糖溶液、5mg/mL羧甲基纤维素钠溶液各2mL，混匀后，置于37℃水浴中，反应时间30min，加入DNS溶液5mL，沸水浴5min以显色，冷却后加水至25mL。上述反应液在540nm测定吸光度。酶活定义：每分钟从浓度为5mg/mL的多糖溶液中分解释放1μmol还原糖定义为一个酶活力单位U。经计算，其中一株米曲霉在基础产酶培养基上产酶能力最强，木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶活力分别为322U/mL、200U/mL、209U/mL。

(3)菌株鉴定

上述高产酶活的菌株经16S rDNA序列在NCBI数据库中进行比对分析，并结合生理生化特征，将本发明菌株命名为米曲霉WMJ008(Aspergillus oryzae)，其16S rDNA序列如下SEQ ID NO：1所示。

SEQ ID NO：1：

CTTCCGTAGGGGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGTAGGGTTCCTAGCGAGCCCAACCTCCCACCCGTGTTTACTGTACCTTAGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCATTCATGGCCGCCGGGGGCTCTCAGCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGGAGACACCACGAACTCTGTCTGATCTAGTGAAGTCTGAGTTGATTGTATCGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAGTGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCATCAAGCACGGCTTGTGTGTTGGGTCGTCGTCCCCTCTCCGGGGGGGACGGGCCCCAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACCCGCTCTGTAGGCCCGGCCGGCGCTTGCCGAACGCAAATCAATCTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGGCGGAGGA

本发明的米曲霉在PDA培养基上生长较好，产孢速度快，初白色、后转为黄绿色相间。接入基础产酶培养基培养，测得木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶酶活，分别为322U/mL、200U/mL、209U/mL。

(4)菌株保藏

米曲霉 Aspergillus oryzae WJM008，于2022年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 20221829。

实施例2以黄豆、小麦为原料的酱油酿造

试验组：

原料筛选：以优质黄豆、小麦为原料；

蒸料：黄豆110℃干蒸10min，之后加入1倍润水(80℃的热水)120℃蒸20min，蒸煮完成稍冷却与0.8倍的炒小麦进行混匀；

制曲：待料温降至36℃左右，接种3‰所述米曲霉，控制室温28℃，湿度90％以上，直至后期曲料成熟，并间歇通循环风供氧控制料温在32℃，促使米曲霉尽快发芽，经18h培养，当料温达到36℃左右，曲料结块且长满菌丝，即可用翻曲机进行第一次翻曲，继续通循环风，控制料温32℃，再培养8h待曲料结块、菌丝丰满进行第二次翻曲，继续通循环风培养，控制料温32℃，待曲料上遍生黄绿色孢子、曲料疏松滑润，即告成熟；

发酵：盐水量1.8倍，最终的盐水浓度在11°Bé左右。低温发酵：温度≤15℃，发酵时间20天；保温发酵：温度控制在30℃左右，发酵40天；自然发酵：常温下继续后熟，继续发酵90天；

酱油原汁：酱醪进行过滤，得到原汁。

对照组：

按照试验组步骤进行，菌株为沪酿3.042。

以上组别分别检测成曲的木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶酶活力，以及原油中的乙醇含量，结果列于下表中：

表1成曲酶活力及原油乙醇含量结果表

从上述表格可以看出，试验组较对照组，其曲料中木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶酶活力较对照组有了明显的提升，从而促进还原糖的进一步生成，进而乙醇含量得到明显提高。

实施例3以黑豆、小麦为原料的酱油酿造

试验组：

原料筛选：以优质黑豆、小麦为原料；

蒸料：黑豆110℃干蒸15min，之后加入1倍润水(70℃的热水)120℃蒸20min，蒸煮完成稍冷却与0.8倍的炒制小麦进行混匀；

制曲：待料温降至36℃左右，接种5‰所述米曲霉，控制室温30℃，湿度90％以上，直至后期曲料成熟，并间歇通循环风供氧控制料温在36℃，促使米曲霉尽快发芽，经16h培养，当料温达到36℃左右，曲料结块且长满菌丝，即可用翻曲机进行第一次翻曲，继续通循环风，控制料温35℃，再培养6h待曲料结块、菌丝丰满进行第二次翻曲，继续通循环风培养，控制料温32℃，待曲料上遍生黄绿色孢子、曲料疏松滑润，即告成熟；

发酵：盐水量2.2倍，最终的盐水浓度在11°Bé左右。低温发酵：温度≤15℃，发酵时间20天；保温发酵：温度控制在30℃左右，发酵40天；自然发酵：常温下继续后熟，继续发酵90天；

酱油原汁：酱醪进行过滤，得到原汁。

对照组：按照试验组步骤进行，菌株为沪酿3.042。

以上组别分别检测成曲的木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶酶活力，以及原油中的乙醇含量，结果列于下表中：

表2成曲酶活力及原油乙醇含量结果表

从上述表格可以看出，试验组较对照组，其曲料中木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶酶活力较对照组有了明显的提升，从而促进还原糖的进一步生成，进而乙醇含量得到明显提高。

实施例4以豆粕、小麦为原料的酱油酿造

试验组：

原料筛选：以豆粕、小麦为原料；

蒸料：豆粕110℃干蒸12min，之后加入1倍润水(75℃的热水)120℃蒸20min，蒸煮完成稍冷却与0.8倍的炒制小麦进行混匀；

制曲：待料温降至36℃左右，接种4‰所述米曲霉，控制室温30℃，湿度90％以上，直至后期曲料成熟，并间歇通循环风供氧控制料温在35℃，促使米曲霉尽快发芽，经16h培养，当料温达到36℃左右，曲料结块且长满菌丝，即可用翻曲机进行第一次翻曲，继续通循环风，控制料温34℃，再培养7h待曲料结块、菌丝丰满进行第二次翻曲，继续通循环风培养，控制料温30℃，待曲料上遍生黄绿色孢子、曲料疏松滑润，即告成熟；

发酵：盐水量2倍，最终的盐水浓度在11°Bé左右。低温发酵：温度≤15℃，发酵时间20天；保温发酵：温度控制在30℃左右，发酵40天；自然发酵：常温下继续后熟，继续发酵90天；

酱油原汁：酱醪进行过滤，得到原汁。

对照组：按照试验组步骤进行，菌株为沪酿3.042。

以上组别分别检测成曲的木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶酶活力，以及原油中的乙醇含量，结果列于下表中：

表3成曲酶活力及原油乙醇含量结果表

从上述表格可以看出，试验组较对照组，其曲料中木聚糖酶、β-葡聚糖酶、纤维素酶酶活力较对照组有了明显的提升，从而促进还原糖的进一步生成，进而乙醇含量得到明显提高。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (10)

1.一种米曲霉，其特征在于，所述米曲霉菌命名为WJM008，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地点为中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M 20221829，保藏日期为2022年11月28日。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂包含权利要求1所述的米曲霉。

3.权利要求1所述的米曲霉、权利要求2所述的微生物菌剂在风味酱油酿造中的应用。

4.一种风味酱油的酿造方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)原料筛选；2)蒸料；3)制曲；4)发酵；5)酱醪过滤，获得原汁。

5.根据权利要求4所述的酿造方法，其特征在于，所述原料选自黄豆、小麦、黑豆、豆粕。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，所述制曲使用权利要求1所述的米曲霉或权利要求2所述的微生物菌剂。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述蒸料包括将黄豆、黑豆或豆粕在约110℃干蒸10-15min，之后加入1倍润水120℃蒸20min，蒸煮完成稍冷却与0.8倍的炒小麦进行混匀。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述制取包括：待料温降至36℃左右，接种3‰-5‰米曲霉WJM008，控制室温28℃-30℃，湿度90％以上，直至后期曲料成熟，并间歇通循环风供氧控制料温在32℃-36℃，促使米曲霉尽快发芽，当料温达到36℃左右，曲料结块且长满菌丝，即可用翻曲机进行第一次翻曲，继续通循环风，控制料温32℃-36℃，再培养，待曲料结块、菌丝丰满进行第二次翻曲，继续通循环风培养，控制料温32℃-36℃，待曲料上遍生黄绿色孢子、曲料疏松滑润，即告成熟。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述发酵包括：盐水量1.8-2.2倍，最终的盐水浓度在11°Bé左右；低温发酵：温度≤15℃，发酵时间20天；保温发酵：温度控制在30℃左右，发酵40天；自然发酵：常温下继续后熟，继续发酵90天。

10.一种酱油，其特征在于，所述酱油包括权利要求1所述的米曲霉或通过权利要求4-9任一项所述的方法制备获得。

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