KR101261666B1 - 진균 배양물의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 곡류, 콩류, 감자류, 비름 및 퀴노아로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 일원을 배양 원료로서 함유하는 액체 배지에서 사상 진균을 배양하여 수득된 진균 배양물의 제조 방법으로, 배양계 내로의 배양 물질 중의 영양소의 방출 속도를 제어하여, 진균 배양물 중의 효소 (특히, 녹말 가수분해성 (amylolytic) 효소, 식물 섬유 소화 효소 또는 프로테아제) 의 생산성을 조정하는 방법을 제공하는 것을 의도한다. 즉, 배양계 내로의 배양 물질 중의 영양소의 방출 속도를 제어하여 진균 배양물의 효소 생산성을 제어하는, 곡류, 콩류, 감자류, 비름 및 퀴노아로부터 선택된 하나 이상의 일원을 배양 물질로서 함유하는 액체 배지를 사용하여 진균을 배양하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 진균 배양물의 제조 방법을 제공한다.

Description

진균 배양물의 제조 방법 {METHOD OF PRODUCING FUNGAL CULTURE}
본 발명은 액체 배지를 사용하는 사상 진균 배양물의 제조 방법, 특히, 배양 원료로부터 영양소의 배양계 내로의 방출 속도를 제어하면서 사상 진균을 배양하여 사상 진균 배양물 중의 효소 생산성을 조정하는, 사상 진균 배양물의 제조 방법에 관한 것이다.
발효 식료품, 예컨대 소주의 제조를 위해, 사상 진균의 일종인 국균 (koji mold, 코지균) 이 사용되어 왔다. 국균은 국균을 곡류의 표면에서 자라게 하는 고체 배양법, 즉 고체 코지 방법으로 불리는 방법에 의해 배양된다. 고체 코지를 사용하는 방법은 전통 제조법이다. 그러나, 상기 방법은 특이적 배양 방식, 즉, 고체 배양이어서, 대규모 제조에는 적합하지 않다.
반면, 국균을 액체 배양하여 수득된 국균의 배양물인 액체 코지는 용이하게 배양을 조절할 수 있고, 효과적인 제조에 적합한 배양 방법이다. 그러나, 액체 코지가 발효 식료품의 제조, 예컨대 소주 양조에 필요한 충분한 효소 활성을 제공하지 않는다는 것이 널리 공지되어 있다 (비-특허 문헌 1 내지 4 참조). 그러므로, 실제 제조에 사용되는 액체 코지의 예가 거의 없다.
국균을 포함하는 사상 진균의 액체 배양에 의한 효소의 제조에서, 효소 생산 성은 배양계 중의 영양소, 예컨대 글루코오스의 농도를 낮게 조절하여 향상되는 것으로 공지되어 있다. 통상적으로, 영양소, 예컨대 당류의 농도는 영양소, 예컨대 당류를 배양계의 외부로부터 조금씩 첨가하는 공급 배양 방식에 의해 억제된다. 그러나, 더 간단한 절차가 개발되기를 기대하고 있다 (비-특허 문헌 5 내지 6 참조).
원료가 껍질 또는 곡피 (husks or hulls) 로 싸인, 액체 배지를 사용하는 국균 배양에 의해 충분한 양의 효소, 예컨대 글루코아밀라아제 및 산-안정성 α-아밀라아제를 함유하는 국균 배양물의 제조 방법을 개발하였고, 이미 특허 출원 (일본 특허 출원 제 2004-350661 호, 제 2004-352320 호, 제 2004-352324 호, 제 2004-378453 호, 제 2005-290651 호, 및 제 2005-290648 호의 명세서 참조) 을 출원하였다. 그러나, 제조 방법에서 효소를 고수율로 제조하는 메카니즘, 상기 메카니즘에 기초한 국균 배양물 중의 효소 생산성을 조절하는 방법, 및 국균을 제외한 사상 진균의 효소 생산성을 조절하는 방법이 아직 알려지지 않았다.
반면, 삶지 않고 찌지 않은 원료, 미네랄 등을 함유하는 액체 배지 중에서, 삶지 않고 찌지 않은 전분을 당화하는 능력이 매우 큰 속명 코르티시움 (Corticium) 의 신규 균주를 배양하여 수득된 효소 액체를 사용하여 삶지 않고 찌지 않은 전분을 액화하는 방법이 제안되었다 (특허 문헌 1 참조). 또한 상기 언급된 효소 액체를 삶지 않고 찌지 않은 원료와 반응시키는, 사케 (Sake) 의 제조 방법이 제안되었다 (특허 문헌 2 참조). 그러나, 속명 코르티시움 (Corticium) 은 바시디오마이세테 (bacidiomycete) 중 하나여서, 발효 식료품의 제조에 널리 사 용되는 국균과 상당히 다르다. 또한, 특허 문헌 1 및 특허 문헌 2 에는 흑국균 (Aspergillus awamori; 아스페르길루스 아와모리) 및 속명 리조푸스 (Rhizopus) 가 당화 능력이 불충분하다고 기재되어 있다. 효소 액체가 충분한 산-안정성 α-아밀라아제 활성을 가지는지의 여부는 여전히 불명확하다.
비-특허 문헌 1: Hata Y. et. al.: J. Ferment. Bioeng., 84, 532-537 (1997)
비-특허 문헌 2: Hata Y. et. al.: Gene., 207, 127-134 (1998)
비-특허 문헌 3: Ishida H. et. al.: J. Ferment. Bioeng., 86, 301-307 (1998)
비-특허 문헌 4: Ishida H. et. al.: Curr. Genet., 37, 373-379 (2000)
비-특허 문헌 5: Bhargava S. et. al.: Biotechnol Bioeng., 82(1), 111-7 (2003)
비-특허 문헌 6: Pedersen H. et. al.: Appl Microbiol Biotechnol., 53(3): 272-7 (2000)
특허 문헌 1: JP H05-068237 B
특허 문헌 2: JP H06-053059 B
본 발명이 해결하고자 하는 과제
본 발명의 목적은 곡류, 콩류, 감자류, 비름 및 퀴노아 (quinoa) 로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 배양 원료로서 함유하는 액체 배지를 사용하고, 배양 원료로서 곡류로부터 영양소의 배양계 내로의 방출 속도를 제어하면서 사상 진균을 배양하여, 사상 진균 배양물 중의 효소, 특히, 녹말 가수분해성 (amylolytic) 효소, 식물 섬유 분해 효소 및 단백질 가수분해성 효소의 생산성을 조정하는 방법을 제공하는 것이다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명의 출원인은 상기 언급된 과제를 해결하기 위해 광범위한 연구를 해왔고, 그 결과로서, 껍질로 싸인 원료를 액체 배지의 원료로서 사용하는 경우, 원료의 도정률을 조정하여 액체 배지 내로의 영양소 중 하나인 글루코오스의 방출 속도를 제어하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 사상 진균을 다양한 도정률을 갖는 원료를 사용하여 배양한 결과로서, 사상 진균 배양물 중의 효소 생산성이 도정률에 의해 제어가능하다는 것을 발견하였다.
본 발명의 출원인은 또한 국균이 껍질 또는 곡피가 제거된 전분-함유 원료를 함유하고, 발효 식료품의 제조에 필요한 다량의 글루코아밀라아제 및 산-안정성 α-아밀라아제를 함유하는 액체 코지를 제조하기 위해 호화되지 않은 액체 배지에서 배양되는 것을 발견하였다. 이것은 아마도 호화되지 않은 원료가, 심지어 껍질 또는 곡피로 싸이지 않은 경우에도 거의 분해되지 않고, 당류, 아미노산 등의 배양계 내로의 방출이 억제되어, 그 결과, 필요한 효소 활성 수득되기 때문이다.
그러므로, 본 발명의 출원인은 상기 발견에 근거하여 본 발명을 완성하였다.
즉, 본 발명의 제 1 양상에 따르면, 배양 원료로부터 배양계 내로의 영양소의 방출 속도를 제어하면서 사상 진균을 배양하여 사상 진균 배양물 중의 효소의 생산성을 조정하는 것을 포함하는,
곡류, 콩류, 감자류, 비름 및 퀴노아로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 배양 원료로서 함유하는 액체 배지를 사용하여 사상 진균 배양물을 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제 2 양상에 따르면, 배양 원료가 그 표면이 적어도 껍질로 전부 또는 일부 싸인 곡류이고, 곡류의 도정률을 조정하여 곡류로부터 배양계 내로의 영양소의 방출 속도를 제어하는, 본 발명의 제 1 양상에 따른 사상 진균 배양물의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 3 양상에 따르면, 껍질 또는 곡피가 제거되고, 호화되지 않은 배양 원료를 사용하여 배양 원료로부터 배양계 내로의 영양소의 방출 속도가 제어되는, 본 발명의 제 1 양상에 따른 사상 진균 배양물의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 4 양상에 따르면,
액체 배지가 열처리되고,
열처리된 액체 배지 중의 무기 염 농도를 조정하여 배양 원료로부터 배양계 내로의 영양소의 방출 속도가 제어되는,
본 발명의 제 1 양상에 따른 사상 진균 배양물의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 5 양상에 따르면, 영양소가 배양 원료 중의 전분 유래의 당류 및/또는 배양 원료 중의 단백질 유래의 아미노산을 포함하는, 본 발명의 제 1 양상에 따른 사상 진균 배양물의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 6 양상에 따르면, 효소가 녹말 가수분해성 효소, 식물 섬유 분해 효소 및 단백질 가수분해성 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는, 본 발명의 제 1 양상에 따른 사상 진균 배양물의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 7 양상에 따르면, 사상 진균이 국균, 속명 트리코데르마 (Trichoderma) 및 백색부후균 (white rot fungi) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는, 본 발명의 제 1 양상에 따른 사상 진균 배양물의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 8 양상에 따르면, 본 발명의 제 1 양상 내지 제 7 양상 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득된, 사상 진균 배양물이 제공된다.
본 발명의 제 9 양상에 따르면, 본 발명의 제 8 양상에 따른 사상 진균 배양물을 사용하는 것을 포함하는, 효소 제제의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 10 양상에 따르면, 본 발명의 제 9 양상에 따른 방법에 의해 수득된, 효소 제제가 제공된다.
본 발명의 제 11 양상에 따르면, 배양 원료로부터 배양계 내로의 영양소의 방출 속도를 제어하면서 사상 진균을 배양하여 사상 진균 배양물 중의 효소의 생산성을 조정하는 것을 포함하는,
곡류, 콩류, 감자류, 비름 및 퀴노아로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 배양 원료로서 함유하는 액체 배지를 사용하여 효소를 제조하는 방법이 제공된다.
본 발명의 제 12 양상에 따르면, 본 발명의 제 11 양상에 따른 방법에 의해 수득된 효소가 제공된다.
본 발명의 제 13 양상에 따르면, 본 발명의 제 8 양상에 따른 사상 진균 배양물을 사용하는 것을 포함하는, 발효 식료품의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 14 양상에 따르면, 본 발명의 제 10 양상에 따른 효소 제제를 사용하는 것을 포함하는, 발효 식료품의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 15 양상에 따르면, 본 발명의 제 12 양상에 따른 효소를 사용하는 것을 포함하는, 발효 식료품의 제조 방법이 제공된다.
본 발명의 제 16 양상에 따르면, 본 발명의 제 13 양상 내지 제 15 양상 중 어느 하나에 따른 방법에 의해 수득되는 발효 식료품이 제공된다.
발명의 효과
본 발명에 따르면, 배양 원료로부터 배양계 내로의 영양소의 방출 속도가 제어되어 배양계 중의 영양소, 예컨대 당류 및 아미노산의 농도가 저 수준으로 유지되고, 사상 진균 배양물 중의 효소 생산성이 조정된다.
본 발명의 제 2 양상에 따르면, 글루코오스의 배양계의 배지 내로의 방출 속도는 도정률을 조정하여 제어된다. 다양한 도정률을 갖는 원료를 사용하여 국균 액체 배양물을 제조한 결과로서, 녹말 가수분해성 효소 및 식물 섬유 분해 효소의 효소 생산성이 도정률에 의해 제어된다는 것을 발견하였다. 또한 국균을 제외한 사상 진균에 의해 제조된 효소의 생산성이 동일한 방법에 의해 제어된다는 것을 발견하였다.
본 발명의 제 3 양상에 따르면, 부착된 껍질 또는 곡피가 없는 원료를 사용하여, 발효 식료품, 예컨대 소주를 제조하는데 필요한 글루코아밀라아제 및 산-안정성 α-아밀라아제를 균형잡힌 방식으로 함유하는 사상 진균 배양물이 제조된다.
그러므로, 예를 들어, 보리 소주 등의 제조에서, 액체 코지의 제조 단계 및 발효 단계에서 동일한 원료를 사용하여 제조 비용을 감소시키는 것이 가능해진다. 보리의 곡피 또는 겨는 알코올 음료의 품질에 악영향을 줄 수 있다. 추가로, 에너지를 절약하기 위해 가열 없이 원료를 사용한다.
다양한 원료를 사용하여 수득되는 사상 진균 배양물 및 사상 균주를 조합하여 사상 진균 배양물이 제조되고 사용되는 경우, 다양한 발효 식료품을 손쉽게 제조하는 것이 가능해진다.
본 발명의 방법은 글루코오스 이외의 곡류에 존재하는 많은 영양소, 예컨대 다양한 당류 및 아미노산의 방출 속도를 유사하게 제어하는 것으로 기대된다. 그러므로, 배양계 중의 당류 농도 또는 아미노산 농도로의 분해 대사물 억제에 의해 영향을 받는 효소의 생산성이 널리 조정될 것이다.
본 발명의 방법은 녹말 가수분해성 효소 유전자 등의 프로모터 영역을 사용하는 헤테로단백질의 제조에 적용할 가능성이 높다.
본 발명에 따르면, 배지 중의 영양소, 예컨대 당류의 농도는 미리 배양계에 첨가된 원료로부터 영양소의 방출 속도를 조정하여, 저수준으로 억제되고, 심지어 공급 배양보다 더 간단한 배치식 배양에 의해, 공급 배양으로부터 수득된 것과 동일한 배양 효과가 수득된다. 본 발명의 배양 방법은 이전에 보고되지 않은 신규한 배양 방식이다.
게다가, 액체 배양은 고체 배양에 비해 엄격하게 제어된다. 그러므로, 본 발명에 따르면, 저비용으로 안정한 품질을 갖는 사상 진균 배양물이 제조된다.
도 1 은 다양한 도정률의 보리를 함유하는 보리 기질 용액을 국균 배양 상청액, 각각에 반응시켜 수득된 반응 액체 중의 글루코오스 농도의 일시적 변화를 보여준다.
도 2 는 다양한 도정률의 보리를 함유하는 보리 기질 용액을 국균 배양 상청액, 각각과 반응시키는 반응의 첫번째 1 시간 동안 글루코오스 방출 속도를 보여준다.
도 3 은 각각 다양한 도정률의 보리를 배양 원료로서 사용하여 수득된 백국균 배양물 중의 효소 활성을 보여준다. 도 3(A) 는 글루코아밀라아제 (백색 막대에 의해 표시됨) 및 α-아밀라아제 (흑색 막대에 의해 표시됨) 의 효소 활성을 보여주고, 도 3(B) 는 산-안정성 α-아밀라아제의 효소 활성을 보여준다.
도 4 는 각각 다양한 도정률의 보리를 배양 원료로서 사용하여 수득된 백국균 배양물 중의 효소 활성을 보여준다. 도 4(A) 는 셀룰라아제 활성을 보여주고, 도 4(B) 는 β-글루코시다아제 활성을 보여준다.
도 5 는 다양한 도정률의 보리를 배양 원료로서 사용하는 흑국균 배양물 중의 글루코아밀라아제 (GA) 활성을 보여준다.
도 6 은 다양한 도정률의 보리를 배양 원료로서 사용하는 흑국균 배양물 중의 α-아밀라아제 (AA) 활성을 보여준다.
도 7 은 다양한 도정률의 보리를 배양 원료로서 사용하는 흑국균 배양물 중 의 산-안정성 α-아밀라아제 (ASAA) 활성을 보여준다.
도 8 은 다양한 도정률의 보리를 배양 원료로서 사용하는 황국균 배양물 중의 글루코아밀라아제 (GA) 활성을 보여준다.
도 9 는 다양한 도정률의 보리를 배양 원료로서 사용하는 황국균 배양물 중의 α-아밀라아제 (AA) 활성을 보여준다.
도 10 은 다양한 도정률의 보리를 배양 원료로서 사용하는 트리코데르마 비리데 (Trichoderma viride) 배양물 중의 셀룰라아제 (CEL) 활성을 보여준다.
도 11 은 다양한 도정률의 보리를 배양 원료로서 사용하는 트리코데르마 레세이 (Trichoderma reesei) 배양물 중의 셀룰라아제 (CEL) 활성을 보여준다.
도 12 는 다양한 도정률의 보리를 배양 원료로서 사용하는 트리코데르마 레세이 배양물 중의 자일라나아제 (XYL) 활성을 보여준다.
도 13 은 다양한 도정률의 보리를 배양 원료로서 사용하는 트리코데르마 레세이 배양물 중의 β-글루코시다아제 (BGL) 활성을 보여준다.
도 14 는 다양한 도정률의 보리를 배양 원료로서 사용하는 아스페르길루스 아큘레아투스 (Aspergillus aculeatus) 배양물 중의 셀룰라아제 (CEL) 활성을 보여준다.
도 15 는 다양한 도정률의 보리를 배양 원료로서 사용하는 아스페르길루스 아큘레아투스 배양물 중의 β-글루코시다아제 (BGL) 활성을 보여준다.
도 16 은 다양한 도정률의 보리를 배양 원료로서 사용하는 백색부후균 배양물 중의 셀룰라아제 (CEL) 활성을 보여준다.
도 17 은 다양한 도정률의 보리를 배양 원료로서 사용하는 백색부후균 배양물 중의 자일라나아제 (XYL) 활성을 보여준다.
도 18 은 멸균된 다양한 염 농도의 보리 기질 용액을 국균 배양 상청액, 각각과 반응시켜 수득된 반응 액체 중의 글루코오스 농도를 보여준다.
도 19 는 멸균된 다양한 염 농도의 액체 배지를 사용한 백국균 배양물 중의 글루코아밀라아제 (GA) 활성을 보여준다.
도 20 은 멸균된 다양한 염 농도의 액체 배지를 사용한 백국균 배양물 중의 산-안정성 α-아밀라아제 (ASAA) 활성을 보여준다.
발명을 수행하기 위한 최적의 구현예
이하, 본 발명을 상세히 기재할 것이다.
본 발명의 제 1 양상은 액체 배지가 곡류, 콩류, 감자류, 비름 및 퀴노아로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상을 배양 원료로서 함유하고, 배양 원료로부터 배양계 내로의 영양소의 방출 속도를 제어하면서 사상 진균을 배양하여 사상 진균 배양물 중의 효소의 생산성을 조정하는 것을 특징으로 하는, 사상 진균 배양물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명에서, 배양 원료 중에 존재하는 영양소의 배양계 내로의 방출 속도를 제어하여, 배양계에 함유된 영양소, 예컨대 당류 또는 아미노산의 농도가 저 수준으로 유지되고, 사상 진균 배양물 중의 효소 활성이 향상된다.
배양 원료 중의 영양소의 배양계 내로의 방출 속도의 제어 수단의 예는 곡류의 도정률 조정에 의한 방법, 부착된 곡피를 갖는 배양 원료 콩류, 감자류, 비름 또는 퀴노아의 사용에 의한 방법, 껍질 또는 곡피는 제거되나, 호화되지 않은 배양 원료의 사용에 의한 방법, 액체 배지를 열처리하면서 무기 염 농도의 조정에 의한 방법, 및 곡류의 전분 성분 및 단백질 성분을 보호하기 위해 곡류의 표면 상에 식용 필름 등을 인공적으로 형성함에 의한 방법이 포함된다. 그러나, 수단은 여기에 제한되지 않는다. 영양소의 방출 속도는 배양 액체 중의 배양 원료의 물리적 분해를 억제하여 제어된다. 예를 들어, 영양소의 방출 속도는 약한 교반 및 전단력을 갖는 배양 장치를 사용하여 억제될 수 있다.
사상 진균에 의해 제조되는 효소의 예는 생산성이 배양계 중의 당류, 예컨대 글루코오스 및 분해된 단백질, 예컨대 아미노산의 농도로 분해 대사물 억제에 의해 영향을 받는 효소의 군을 포함한다. 이의 특정 예는, 녹말 가수분해성 효소, 예컨대 글루코아밀라아제, 산-안정성 α-아밀라아제 및 α-아밀라아제, 식물 섬유 분해 효소, 예컨대 셀룰라아제, 자일라나아제 및 β-글루코시다아제, 및 단백질 가수분해성 효소, 예컨대 프로테아제, 펩티다아제 및 글루타미나아제를 포함하나 이에 반드시 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 사용되는 배양 원료의 예는 곡류, 예컨대 보리, 쌀, 밀, 메밀, 피, 조, 기장, 고량 및 옥수수, 콩류, 예컨대 대두 및 팥, 감자류, 예컨대 고구마 및 잡곡류, 예컨대 비름 및 퀴노아를 포함한다.
비름은 아마란타세아 (Amaranthaceae) 족의 속명 비름에 속하는 식물의 속명이다. 곡류 중에서, 비름은 고 단백질 함량을 가지고, 아미노산 중의 하나인 라이신의 함량이 대두에서의 함량과 동일하다. 게다가, 비름은 정미와 비교시 다량의 칼슘, 철, 및 섬유질을 함유하는 매우 영양가 있는 곡류이다. 기원 국가는 중남미, 인도, 히말라야 및 네팔의 특정 지역이다.
반면, 퀴노아는 아가타 (Agatha) 족의 일년생 초본으로, 이것은 주로 고지, 예컨대 페루의 남부 및 볼리비아의 서부에 위치한 안데스에서 경작된다. 퀴노아는 미네랄, 비타민, 단백질, 및 식이 섬유질이 풍부하다.
배양 원료는 단독으로 사용될 수 있거나, 이들이 2 이상이 조합으로 사용될 수 있다. 원료의 형상이 특히 제한되는 것은 아니다.
배양 원료 중 임의의 하나를 물과 혼합하여 액체 배지를 제조한다.
배양 원료의 혼화비는 축적되는 것으로 의도되는 효소가 사상 진균 배양물 중에 선택적으로 제조되고 축적되는 범위로 각각 조정된다.
예를 들어, 글루코아밀라아제 및 산-안정성 α-아밀라아제를 고수율로 균형잡힌 방식으로 제조하기 위해서, 원료로서 보리를 사용하는 경우, 물에 1 내지 20% (w/vol) 의 미정제 보리를 첨가하여 액체 배지를 제조한다. 미정제 보리로서 미정백맥을 사용하는 경우, 더욱 바람직하게는 8 내지 10% (w/vol) 를 첨가하여 액체 배지를 제조한다. 미정제 보리로서 95%-정백맥을 원료로서 사용하는 경우, 더욱 바람직하게는 1 내지 4% (w/vol) 를 첨가하여 액체 배지를 제조한다.
사용되는 미정제 보리의 양이 20% (w/vol) 를 초과하는 경우, 배양 액체의 점도가 증가하고, 사상 진균을 호기성으로 배양하는데 필요한 산소 또는 공기의 공급이 불충분해진다. 이것은 배양물 중의 산소 함량을 감소시키고, 배양 진행을 억제하여, 바람직하지 않다.
그 다음, 배양 원료로서 쌀을 사용하는 경우, 물에 1 내지 20% (w/vol), 바람직하게는 5 내지 13% (w/vol), 또는 더욱 바람직하게는 8 내지 10% (w/vol) 의 쌀을 첨가하여 액체 배지를 제조한다.
배양 원료로서 콩류를 사용하는 경우, 1 내지 10% (w/vol) 의 콩류를 물에 첨가하여, 또는 바람직하게는, 8 내지 10% (w/vol) 의 대두 또는 1 내지 2% (w/vol) 의 팥을 물에 첨가하여 액체 배지를 제조한다. 배양 원료로서 덩이줄기를 사용하는 경우, 1 내지 10% (w/vol) 의 덩이줄기를 물에 첨가하여 액체 배지를 제조한다.
배양 원료로서 비름을 사용하는 경우, 예를 들어, 1.5 내지 15% (w/vol), 바람직하게는 2 내지 10% (w/vol), 또는 더욱 바람직하게는 2 내지 8% (w/vol) 의 비름을 물에 첨가하여 액체 배지를 제조한다. 배양 원료로서 퀴노아를 사용하는 경우, 1.5 내지 7% (w/vol), 바람직하게는 2 내지 6% (w/vol), 또는 더욱 바람직하게는 2 내지 4% (w/vol) 의 퀴노아를 물에 첨가하여 액체 배지를 제조한다.
혼화에 가장 적합한 양은 의도된 효소, 사용되는 원료의 도정 정도, 사용되는 사상 균주, 원료의 종류 등에 따라 다양하기 때문에, 혼화되는 배양 원료의 양은 적합하게 선택될 수 있다.
상기 언급된 원료 중 임의의 것 외에도, 유기 성분, 무기 염 등을 영양소 공급원으로서 액체 배지에 첨가하는 것이 바람직하다.
예를 들어, 백국균, 예컨대 아스페르길루스 가와치이 (Aspergillus kawachii) 및 흑국균, 예컨대 아스페르길루스 아와모리 (Aspergillus awamori) 또 는 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger) 가 사상 진균으로 사용되는 경우, 니트레이트 염 및 포스페이트 염이 바람직하게는 조합으로 사용되거나, 또는 더욱 바람직하게는, 이들 외에 술페이트 염이 조합으로 사용된다. 니트레이트 염의 예는 질산나트륨 및 질산칼륨을 포함하고, 질산칼륨이 특히 바람직하다. 포스페이트 염의 예는 인산이수소칼륨 및 인산암모늄을 포함하고, 인산이수소칼륨이 특히 바람직하다. 술페이트 염의 예는 황산마그네슘 헵타히드레이트, 철 술페이트 헵타히드레이트 및 황산암모늄을 포함하고, 황산마그네슘 헵타히드레이트 및 철 술페이트 헵타히드레이트가 특히 바람직하다. 상기 무기 염 중 2 가지 이상을 조합으로 사용할 수 있다.
백 코지 및 흑 코지가 사용되는 경우 액체 배지 중의 무기 염의 농도는 각각 글루코아밀라아제 및 α-아밀라아제가 국균 배양물 중에서 선택적으로 발생되고 축적되는 범위로 조정된다. 구체적으로는, 니트레이트 염의 농도는 0.1 내지 2.0%, 또는 바람직하게는 0.2 내지 1.5% 이고, 포스페이트 염의 농도는 0.05 내지 1.0%, 또는 바람직하게는 0.1 내지 0.5% 이고, 술페이트 염의 농도는 0.01 내지 0.5%, 또는 바람직하게는 0.02 내지 0.1% 이며, 단, 모든 값은 w/vol 이다.
황국균, 예컨대 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae) 또는 아스페르길루스 소자에 (Aspergillus sojae) 가 사상 진균으로 사용되는 경우, 액체 배지는 바람직하게는 니트레이트 염, 포스페이트 염 및 술페이트 염을 조합으로 함유한다. 니트레이트 염의 예는 질산나트륨 및 질산칼륨을 포함하고, 질산칼륨이 특히 바람직하다. 포스페이트 염의 예는 인산이수소칼륨 및 인산암모늄을 포함하 고, 인산이수소칼륨이 특히 바람직하다. 술페이트 염의 예는 황산마그네슘 헵타히드레이트, 철 술페이트 헵타히드레이트 및 황산암모늄을 포함하고, 황산마그네슘 헵타히드레이트 및 철 술페이트 헵타히드레이트가 특히 바람직하다. 상기 무기 염 중 2 가지 이상을 조합으로 사용할 수 있다.
황국균이 사용되는 경우 액체 배지 중의 무기 염의 농도는 각각 글루코아밀라아제 및 α-아밀라아제가 국균 배양물 중에서 선택적으로 발생되고 축적되는 범위로 조정된다. 구체적으로는, 니트레이트 염의 농도는 0.1 내지 2.0%, 또는 바람직하게는 0.2 내지 1.5% 이고, 포스페이트 염의 농도는 0.05 내지 1.0%, 또는 바람직하게는 0.1 내지 0.5% 이고, 술페이트 염의 농도는 0.01 내지 0.5%, 또는 바람직하게는 0.02 내지 0.1% 이며, 단, 모든 값은 w/vol 이다.
상기 언급된 무기 염 외의 유기 성분 및 무기 염을 영양소 공급원으로서 본 발명의 액체 배지에 임의로 첨가할 수 있다. 이들 첨가제는 사상 진균의 배양에 일반적으로 사용되는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 유기 성분의 예는 쌀 겨, 밀 겨, 옥수수 침지액, 대두박 및 탈지 대두를 포함한다. 무기 염의 다른 예는 수용성 화합물, 예컨대 암모늄 염, 칼륨 염, 칼슘 염 및 마그네슘 염을 포함한다. 유기 성분 및/또는 무기 염 중 2 가지 이상을 동시에 사용할 수 있다. 이의 첨가량은 사상 진균의 성장을 촉진시키는 것이라면 특별히 제한되지 않는다. 유기 성분의 첨가량은 바람직하게는 약 0.1 내지 5% (w/vol) 이고, 무기 염의 첨가량은 바람직하게는 약 0.1 내지 1% (w/vol) 이다.
상기 영양소 공급원을 상한 초과의 양으로 첨가하는 것은 사상 진균의 성장 이 저해되기 때문에 바람직하지 않다. 하한 미만의 첨가량도 또한 효소가 충분한 양으로 생성될 수 없기 때문에 바람직하지 않다.
첨가제, 예컨대 항생제 또는 방부제를 상기 영양소 공급원 외에 액체 배지에 임의로 첨가할 수 있다.
본 발명의 제 4 양상에 기재된 바와 같이, 본 발명에서 열처리된 액체 배지가 사용되는 경우, 열처리된 액체 배지 중의 무기 염 농도를 적합하게 조정하여 배양 원료로부터 배양계 내로의 영양소의 방출 속도가 또한 제어된다.
즉, 배양 원료로부터 배양계 내로의 영양소의 방출은 열처리된 액체 배지 중의 무기 염 농도를 증가시켜 억제된다. 이것은 아마도 무기 염의 존재하에서 배양 원료의 가열에 의해 배양 원료의 물리적 분해가 억제되기 때문일 것이다.
무기 염의 예는 특별히 제한되는 것은 아니고, 사상 진균의 액체 배지에 일반적으로 사용되는 무기 염 중 임의의 것이 상기 기재된 바와 같이 사용될 수 있다. 그러나, 니트레이트 염, 포스페이트 염 및 술페이트 염이 더욱 바람직하다.
열처리된 액체 배지 중의 무기 염 농도는 상기 기재된 액체 배지 중의 바람직한 무기 염 농도의 1 내지 10 배로 고정될 수 있다.
열처리된 액체 배지 중의 무기 염 농도가 사상 진균의 배양에 바람직한 농도 범위를 초과하는 경우, 액체 배지는 그의 무기 염 농도를 적합하게 조정하기 위해 열처리 후 희석된 다음, 배양에 사용될 수 있다.
상기 언급된 열처리는 80 내지 130℃ 의 온도, 또는 바람직하게는 100 내지 121℃ 에서 5 내지 120 분 동안, 또는 바람직하게는 10 내지 30 분의 조건 하에서 수행될 수 있다. 특히, 오토클레이브 등으로의 액체 배지의 열 멸균 처리를 위한 일반적 조건, 즉, 110 내지 121℃ 의 온도에서 5 내지 20 분 동안이, 배지의 멸균 처리가 동시에 수행되기 때문에 바람직하다.
그다음, 사상 진균을 액체 배지에 접종한다. 본 발명에서 사용되는 사상 진균으로는, 배양계 중의 영양소, 예컨대 당류 또는 아미노산의 농도로 분해 대사물 억제에 의해 영향을 받는 효소를 생성하는 사상 진균이 널리 사용될 수 있다. 이의 예는 속명 아스페르길루스 (Aspergillus), 속명 트리코데르마 (Trichoderma), 및 백색부후균 중 하나, 즉, 이르펙스 락테우스 (Irpex lacteus) 를 포함한다. 속명 아스페르길루스 (Aspergillus) 의 구체적인 예는 아스페르길루스 가와치이 (Aspergillus kawachii) 등으로 대표되는 백국균, 아스페르길루스 오리자에 (Aspergillus oryzae), 아스페르길루스 소자에 (Aspergillus sojae) 등으로 대표되는 황국균, 아스페르길루스 아와모리 (Aspergillus awamori), 아스페르길루스 니게르 (Aspergillus niger) 등으로 대표되는 흑국균, 및 아스페르길루스 아큘레투스 (Aspergillus aculeatus) 를 포함한다. 속명 트리코데르마 (Trichoderma) 의 구체적인 예는 셀룰라아제-생성 균주인 트리코데르마 비리데 (Trichoderma viride) 및 트리코데르마 레세이 (Trichoderma reesei) 를 포함한다.
상기 사상 진균은 단일 균주 배양에 대해 또는 2 이상의 상동 또는 이종 균주와 혼합된 배양에 대해 사용될 수 있다. 전배양에서 수득된 포자 또는 균사체의 형태로 사용하는 것이 가능하다. 그러나, 대수증식기를 위해 더 짧은 시 간이 필요하기 때문에 바람직하게는 균사체가 사용된다. 액체 배지 내에 접종되는 사상 진균의 양은 특별히 제한되지는 않으나, 포자의 수는 액체 배지의 ml 당 약 1×104 내지 1×106 의 범위일 수 있다. 균사체의 경우, 전배양 액체의 약 0.1 내지 10% 가 바람직하게는 접종된다.
사상 진균의 배양 온도는 바람직하게는 25 내지 45℃, 또는 더욱 바람직하게는 30 내지 40℃ 이나, 성장에 악영향을 주지 않는 이상 특별히 제한되지는 않는다. 배양 온도가 낮으면, 사상 진균의 성장이 저해되면서 감염성 미생물로 오염되는 경향이 있다. 배양 시간은 바람직하게는 24 내지 120 시간의 범위이다. 배양 장치는 각각 액체 배양을 수행할 수 있는 것들 중 임의의 것일 수 있다. 사상 진균은 호기성으로 배양되어야만 한다. 그러므로, 배양은 산소 또는 공기가 배지 내에 공급되는 호기성 조건하에서 수행되어야만 한다. 또한, 원료, 산소, 및 사상 진균이 배양 동안 장치에 균일하게 분포되도록 배지를 교반하는 것이 바람직하다. 교반 조건 및 통기 (aeration) 의 양은 호기성 배양 환경이 유지된다면 임의적일 수 있고, 그러므로 배양 장치, 배지의 점도 등에 따라 적합하게 선택할 수 있다.
상기 언급된 사상 진균 배양물의 제조 방법에서 본 발명의 제 2 양상은, 그 표면이 적어도 껍질로 전부 또는 일부 싸인 곡류를 배양 원료로서 사용하고, 곡류로부터 영양소의 배양계 내로의 방출 속도를 제어하기 곡류의 도정률을 조정한다.
본 발명에서, 곡류는 적어도 껍질로 전부 또는 일부 싸인 표면을 갖는 것이 필요하다. 미도정 물질 또는 낟알의 표면에 껍질이 적어도 남아있도록 도정되는 도정률과 동일한 또는 그 이상인 것이 사용될 수 있다. 미정제 쌀, 미정제 보리 등이 또한 사용될 수 있다. 예를 들어, 곡류가 보리인 경우, 미도정 물질의 도정률을 100% 로 정의하는 경우, 100% 의 도정률을 갖는 미도정 물질, 또는 미도정 물질의 도정률로부터 보리의 껍질 비율 (일반적으로 7 내지 8%) 을 빼서 측정된 값, 즉, 92 내지 93% 의 도정률을 가진 물질을 사용할 수 있다.
본 발명의 제 2 양상에 따르면, 곡류의 도정률을 조정하고, 영양소의 배양계 내로의 방출 속도를 제어하여 사상 진균 배양물 중의 효소 활성을 향상시킨다. 그러므로, 최적 도정률은 제조되는 효소의 종, 원료 곡류의 종류 등에 따라 선택된다. 예를 들어, 원료로서 보리를 사용하여 글루코아밀라아제 또는 산-안정성 α-아밀라아제가 제조되는 경우, 도정률을 90 내지 100%, 또는 더욱 바람직하게는 98% 로 고정시켜, 두 효소를 고수율로 균형잡힌 방식으로 제조한다.
용어 "도정률" 은 곡류를 도정한 후 곡류의 잔여 백분율을 말한다. 예를 들어, 용어 "90% 의 도정률" 은 곡류의 표면층 부분 상의 껍질 등의 10% 가 깎인 것을 의미한다. 본 발명에서, 용어 "미정제 보리" 는 미정백맥부터 낟알의 표면 상에 남은 껍질을 갖는 정백맥까지를 포함하며, 이것은 90% 이상의 도정률을 갖는 물질이다. 용어 "껍질" 은 곡류 입자의 표면을 덮는 바깥 부분을 말한다.
곡류에 존재하는 전분은 배양 전에 미리 호화될 수 있다. 전분의 호화는 스팀법, 로스팅법 등을 포함하는 통상적인 방법 중 임의의 하나에 따라 수행될 수 있으나, 특별히 여기에 제한되는 것은 아니다. 하기 기재되는 바와 같은 액체 배지의 멸균 단계에서, 고온 및 고압에서의 멸균에 의해 전분이 겔화 온도 또는 그 이상으로 가열되는 경우, 전분의 호화는 이러한 처리에 의해 동시에 수행될 수 있다.
본 발명의 제 2 양상에서 사용되는 액체 배지는 물, 상기 언급된 배양 원료, 및 기타 배지 성분을 혼합하여 제조된다. 액체 배지를 필요하다면 멸균 처리에 적용할 수 있고, 이러한 처리의 절차는 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 121℃ 의 온도에서 15 분 동안 수행되는 고온 및 고압 멸균법일 수 있다.
상기 언급된 사상 진균 배양물의 제조 방법에서, 본 발명의 제 3 양상은 배양 원료로서 껍질 또는 곡피가 제거되고, 호화되지 않은 물질을 사용하고, 배양 원료로부터 배양계 내로의 영양소의 방출 속도가 제어된다.
본 발명의 제 3 양상에서, 상기 언급된 배양 원료의 껍질 또는 곡피가 제거되고, 배양 원료가 호화되지 않는 것이 필요하다.
예를 들어, 배양 원료가 보리인 경우, 미도정 물질의 도정률 (100%) 로부터 보리의 껍질 비율 (일반적으로 7 내지 8%) 을 빼서 측정된 값, 즉, 약 92 내지 93% 의 도정률을 가진 물질을 사용할 수 있다. 통보리 (Pearled barley; 65% 의 도정률을 가진 것) 을 또한 사용할 수 있다.
상기 언급된 배양 원료를 그안의 전분이 호화됨으로 인해 가열과 같은 처리에 적용하지 않는다. 그러나, 상기 언급된 배양 원료를 필요한 경우 탈곡, 도정, 박피, 세척, 저작, 압착 및 동결과 같은 처리에 적용할 수 있다.
본 발명의 제 3 양상에서, 액체 배지 중의 상기 언급된 배양 원료의 혼화비 는 글루코아밀라아제 및 산-안정성 α-아밀라아제가 사상 진균 배양물 중에 선택적으로 발생되고 축적되는 범위로 설정된다. 구체적으로는, 배양 원료는 액체 배지에 대해 1 내지 10% (w/vol), 바람직하게는 2 내지 6% (w/vol) 의 양으로 첨가될 수 있다. 그러나, 최적 혼화비는 사용되는 사상 균주의 종류, 배양 원료 등에 따라 다르기 때문에 혼화비는 적합하게 선택될 수 있다.
호기성 사상 진균이 사용되는 경우에서, 사용되는 배양 원료의 양이 상한을 초과하는 경우, 배양 액체의 점도가 증가하고, 사상 진균을 호기성으로 배양하는데 필요한 산소 또는 공기의 공급이 불충분해진다. 이것은 배양물 중의 산소 함량을 감소시키고, 배양 진행을 억제하여, 바람직하지 않다. 반면, 사용되는 원료의 양이 하한 미만인 경우, 글루코아밀라아제 및 산-안정성 α-아밀라아제가 고수율로 제조될 수 없다.
본 발명의 제 3 양상에서 사용된 액체 배지는 물, 상기 언급된 배양 원료 및 기타 배지 성분을 혼합하여 제조된다. 이 경우, 필요하다면, 배양 원료를 제외한 배지 성분을 물과 혼합하고, 혼합물을 미리 멸균한 다음, 호화되지 않은 전분-함유 원료를 그곳에 부가적으로 첨가할 수 있다. 대안적으로는, 배양 원료 및 기타 배지 성분의 일부를 물과 혼합하고, 혼합물을 미리 멸균한 다음, 호화되지 않은 배양 원료의 나머지를 그곳에 첨가하는 방법을 채택할 수 있다.
멸균법은 특별히 제한되지 않는다. 예를 들어, 121℃ 의 온도에서 15 분 동안 수행되는 고온 및 고압 멸균법일 수 있다.
의도되는 효소가 충분히 발생되고 축적되는 사상 진균 배양물을 수득하기 위 해 상기 언급된 배양 방법에 의해 사상 진균이 배양된다. 본 발명의 사상 진균 배양물은 배양물 그 자체 외에도, 배양물을 원심분리 등에 적용하여 수득된 배양 액체, 그의 농축물, 그의 정제 생성물 또는 그의 건조 생성물 등을 포함한다.
상기 기재된 바와 같이, 상기 언급된 배양 방법에 따르면, 그의 생산성이 배양계 중의 당류, 예컨대 글루코오스 또는 분해된 단백질, 예컨대 아미노산의 농도로의 분해 대사물 억제에 의해 영향을 받는 효소의 군이 많이 제조될 수 있다.
그러므로, 본 발명의 제 11 양상에 따른 효소의 제조 방법은 상기 언급된 사상 진균 배양물의 제조 방법과 동일하다.
본 발명에 의해 수득된 사상 진균 배양물은 발효 식료품의 제조 뿐 아니라, 당류, 아미노산, 그의 유도체, 효소 제제 및 약학적 소화제의 제조에도 사용된다. 국균 배양물은 고체 코지 대신에, 예를 들어, 사케 (Sake) 제조의 경우, 효모 매시 (mash) 또는 사케 매시의 준비 단계에서; 소주 제조의 경우, 소주 매시를 으깨는 단계에서; 간장 제조의 경우, 쌓는 (piling) 단계에서; 된장 제조의 경우, 으깨는 단계에서; 양조 식초 제조의 경우, 으깨는 단계에서; 감미 사케 제조의 경우, 으깨는 단계에서; 및 식혜 제조의 경우, 으깨는 단계에서 사용될 수 있다. 상기 발효 식료품의 제조에 사용되는 발효 원료 (부가적 원료) 는 호화될 수 있거나 호화되지 않을 수 있다.
수득된 사상 진균 배양물의 일부를 사상 진균 배양물의 연이은 제조를 위한 발효제 (starter) 로서 사용할 수 있다. 상기 방식으로 사상 진균 배양물을 연속으로 제조하여, 안정적인 제조를 달성하고, 동시에 제조 효율을 향상시킨다.
본 발명의 사상 진균 배양물로부터 효소 제제를 제조하는 방법으로서, 배양물 그 자체, 그의 여과액, 원심분리 등에 의한 상청액을 액체 효소 제제로서 사용할 수 있거나, 이것을 건조하거나 제조에 대해 통상적인 방법에 의해 지지체에 고정시킬 수 있다. 이때 적합한 부형제 등을 그곳에 첨가할 수 있다.
상기 언급된 사상 진균 배양물을 사용하여 발효 식료품, 예컨대 알코올 음료를 제조하는 경우, 모든 단계를 액체 상에서 수행할 수 있다. 예를 들어, 소주를 제조하는 경우, 옥수수, 밀, 쌀, 감자, 사탕수수 등을 원료로서 사용한 다음 약 80℃ 로 가열하여 내열 효소 제제와 용해에 의해 액화시키고, 상기 언급된 국균 배양물 및 효모를 그곳에 첨가하여 매시를 알코올 발효시킨 다음, 상압 또는 감압 등 하에서 증류한다.
이하, 본 발명을 실시예의 방식으로 더욱 상세히 기재할 것이다. 그러나, 본 발명은 하기 실시예에 제한되는 것은 아니다.
<실험예 1>
다양한 도정률의 보리로부터의 글루코오스 방출 속도의 측정
65% 내지 98% 의 다양한 도정률의 보리 (Stirling, 호주산) 를 국균 배양물 유래의 효소와 반응시키고, 보리로부터의 글루코오스 방출 속도를 측정하였다.
구체적으로는, 65%-정백맥, 83%-정백맥, 92%-정백맥, 95%-정백맥, 98%-정백맥 및 98%-정백맥 분쇄 생성물 각각의 2 g 을 중량을 재고, 중량을 잰 물질 각각과 물 50 ml 을 200-ml 원뿔형 플라스크에 넣었다. 이것을 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하여, "보리 기질 용액" 을 제조하였다.
이어서, 배양 원료로서 보리 (Stirling, 호주산) 를 사용하여 제조된 국균 배양물을 여과지로의 여과에 의해 고체-액체 분리에 적용시켜 "국균 배양 상청액" 을 수득하였다.
상기 실험에서 사용된 국균 배양물의 제조 방법은 이하 기재되는 바와 같았다.
1. 전배양 방법
65%-정백맥 8 g 및 물 100 ml 을 500-ml 배플 (baffled) 원뿔형 플라스크에 넣고, 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하여 전배양 배지를 수득하였다. 냉각후, 백국균 (Aspergillus kawachii NBRC4308) 을 전배양 배지 내로 1 x 106/ml 로 접종하고, 진탕하면서 37℃ 및 100 rpm 에서 24 시간 동안 배양하여 전배양 액체를 수득하였다.
2. 본배양 방법
98%-정백맥을 질산칼륨 0.2% (w/vol) 및 인산이수소칼륨 0.3% (w/vol) 이 보충된 물에 첨가하여 98%-정백맥의 양이 2.0% (w/vol) 되도록 액체 배지를 제조하였다. 제조된 액체 배지 3,000 ml 을 5,000-ml 발효조 (B. E. Marubishi Co., Ltd. 제조) 에 넣고, 오토클레이브 (121℃ 에서 15 분 동안) 로 멸균한 후, 상기 언급된 방법에 의해 액체 배지에서 미리 전배양된 백국균 (Aspergillus kawachii NBRC4308) 의 전배양 액체 30 ml 로 접종하였다. 그 후, 37℃ 의 온도에서 42 시간 동안 진탕 속도 300 rpm 및 통기량 0.5 vvm 로 배양을 수행하여, 수득물을 여과지 (Toyo filter paper No. 2) 로 여과하여, "국균 배양 상청액" 을 수득하였다.
3. 측정방법
그렇게 제조된 보리 기질 용액 50 ml 및 그렇게 제조된 국균 배양 상청액 50 ml 을 37℃ 에서 5 분 동안 분리해서 유지시킨 다음, 혼합하여 반응을 시작하게하였다. 반응 개시 후 1 시간, 2 시간, 3 시간, 및 4 시간 후에 표본 추출된 반응 액체 중의 글루코오스 농도를 글루코오스 C-II Test Wako (Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd. 제조) 로 측정하였다.
4. 결과
반응 액체 중의 글루코오스 농도의 일시적 변화는 도 1 에 제시된 바와 같았다. 방출된 글루코오스의 양이 보리 기질 용액에 사용된 보리의 도정 정도에 따라 달라지는 것이 확인되었다. 일반적으로, 보리의 껍질 백분율은 약 10% 이며, 본 실험에서 사용되었던 65%-정백맥 및 83%-정백맥 각각은 그의 표면 상에 껍질이 없다. 대조적으로, 92%-정백맥, 95%-정백맥 및 98%-정백맥은 껍질이 그의 표면 상에 남아있다.
도 1 에서 제시된 바와 같이, 각각이 그의 표면 상에 껍질이 없는 65%- 및 83%-정백맥 및 98%-정백맥 분쇄 생성물이 사용된 시험 플롯에서는, 각각, 높은 글루코오스 농도를 나타냈다. 대조적으로, 92%-, 95%-, 및 98%-정백맥이 사용된 시험 플롯에서는, 각각, 도정률이 낮을수록 글루코오스 농도가 낮다는 것이 확인되었다. 상기 이유로, 방출된 글루코오스의 양이 껍질의 존재에 의해 제어되었다 는 것이 밝혀졌다.
도 2 는 본 실험에서 반응 첫번째 1 시간 동안 글루코오스 방출 속도의 계산된 값을 보여준다. 도 2 로부터, 도정률이 낮을수록 글루코오스 방출 속도가 낮게 제어된다는 것이 확인되었다.
반면, 98%-정백맥 분쇄 생성물이 사용된 시험 플롯에서는, 글루코오스 방출 속도는 65%-정백맥의 것과 동등한 수준으로 증가되었다. 그러므로, 보리의 전분 성분을 물리적으로 싸고 있는 껍질이 글루코오스 방출 속도를 조정하는 주요인인 것으로 제안된다.
<실시예 1>
다양한 도정률의 보리를 사용한 백국균 배양물의 제조
하기 기재되는 바와 같은 방법에 의해 다양한 정도의 정백맥 (Stirling, 호주산) 을 사용하여 백국균 배양물을 제조하고, 그 안의 효소 활성을 측정하였다.
1. 전배양 방법
65%-정백맥 8 g 및 물 100 ml 을 500-ml 배플 원뿔형 플라스크에 넣고, 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하여 전배양 배지를 수득하였다. 냉각후, 백국균 (Aspergillus kawachii NBRC4308) 을 전배양 배지 내로 1 x 106/ml 로 접종하고, 진탕하면서 37℃ 및 100 rpm 에서 24 시간 동안 배양하여 전배양 액체를 수득하였다.
2. 본배양 방법
65%-정백맥, 83%-정백맥, 92%-정백맥, 95%-정백맥 및 98%-정백맥 중 임의의 것의 2 g, 질산칼륨 0.2 g, 인산이수소칼륨 0.3 g 및 물 100 ml 을 500-ml 원뿔형 플라스크에 넣고, 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하여 주배양 배지를 제조하였다. 냉각후, 전배양 액체 1 ml 을 주배양 배지에 접종하고, 37℃ 및 100 rpm 에서 48 시간 동안 진탕하면서 배양하였다.
3. 측정방법
배양 완료 후, 녹말 가수분해성 효소인, 글루코아밀라아제 (GA), α-아밀라아제 (AA) 및 산-안정성 α-아밀라아제 (ASAA) 의 활성을 측정하였다.
글루코아밀라아제 (GA) 활성을 당화력 분별 정량화 키트 (Kikkoman Corporation 제조) 를 사용하여 측정하고, α-아밀라아제 (AA) 활성을 α-아밀라아제 측정 키트 (Kikkoman Corporation 제조) 를 사용하여 측정하였다. 산-안정성 α-아밀라아제 (ASAA) 활성의 측정을 위해, [Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng., 76, 105-110 (1993), Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng., 77, 483-489 (1994), 및 Shigetoshi Sudo et al: Journal of the Brewing Society of Japan, 89, 768-774 (1994)] 에 기재된 방법을 약간 변형하였다. 즉, 산-불안정성 α-아밀라아제 활성은 배양물에 산을 처리하여 불활성화시킨 다음, 산-안정성 α-아밀라아제 활성을 α-아밀라아제 측정 키트 (Kikkoman Corporation 제조) 로 측정하였다. 좀더 구체적으로, 100 mM 아세트산 완충액 (pH 3) 9 ml 을 배양 액체 1 ml 에 첨가하고, 산 처리를 37℃ 에서 1 시간 동안 수행하고, α-아밀라아제 측정 키트 (Kikkoman Corporation 제조) 로 측정하였다.
그 다음 셀룰로오스분해 효소인 셀룰라아제 (CEL) 및 β-글루코시다아제 (BGL) 의 활성을 측정하였다. 셀룰라아제 (CEL) 활성을 기질로서 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 의 가수분해로부터 발생된 감소된 당류의 양을 디니트로살리실산 (DNS) 방법에 의해 정량화하는 방법에 의해 측정하였다. 좀더 구체적으로, 배양 액체 1 ml 을 1% CMC 기질 용액 1 ml (100 mM 아세트산 완충액 (pH 5) 중에 Sigma-Aldrich 에서 제조된 low viscosityTM 를 용해하여 수득된 용액) 에 첨가하고, 40℃ 에서 정확히 10 분 동안 효소 반응시킨다. 그 후, 디니트로살리실산 0.75%, 수산화나트륨 1.2%, 칼륨 나트륨 타르트레이트 테트라히드레이트 22.5% 및 락토오스 모노히드레이트 0.3% 를 함유하는 DNS 시약 4 ml 을 혼합물에 첨가하고 잘 혼합하여 반응을 종결시킨다. 반응 종료 후 액체 중의 감소된 당류의 양을 정량하기 위해, 반응 종료 후 액체를 끓는 수조에서 정확히 15 분 동안 가열하였다. 이어서, 액체를 실온으로 냉각시키고, 540 nm 에서의 흡광도를 측정하여 글루코오스의 것에 해당하는 감소된 당류의 양을 정량하였다. 1 단위의 셀룰라아제 (CEL) 활성은 분 당 1 μmol 의 글루코오스에 해당하는 감소된 당류의 제조에 필요한 효소의 양을 나타낸다.
β-글루코시다아제 활성을 이하 기재되는 바와 같은 방법에 의해 측정하였다. 1 mM p-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드 (PNPG) 를 기질로서 사용하는 50 mM 아세트산 완충액 (pH 5) 에서 효소 반응을 37℃ 에서 정확히 10 분 동안 수행하였다. 반응 종료 후, 발생된 p-니트로페놀의 양을 410 nm 에서의 흡광도에 의해 정량하여 효소 활성을 계산하였다. 그곳에 200 mM 탄산나트륨 용액을 반응 액체의 2 배 양으로 첨가하여 반응을 종결하였다. 1 단위의 활성은 1 μmol 의 글루코오스가 분 당 방출되는 활성을 나타낸다.
도 3 및 4 는 측정 결과를 나타낸다.
4. 결과
도 3 에서 제시된 바와 같이, 도정률이 감소하면 녹말 가수분해성 효소의 생산성은 증가하였다. 심지어 낮은 도정률의 98%-정백맥으로도, 보리가 분쇄된 경우 그 안의 효소 생산성이 유의하게 감소하였다. 또한, 도 4 에서 제시된 바와 같이, 도정률이 감소하면 셀룰로오스분해 효소의 생산성이 증가하는 경향이 관찰되었다. 상기 방식으로, 백국균 배양물 중의 효소 생산성이 실험예 1 에서 제시된 바와 같은 글루코오스 방출 속도에 대한 역 관련성을 가지는 경향이 관찰되었고, 보리의 도정률을 변화시켜 백국균 배양물 중의 효소 생산성을 제어하였다는 것을 밝혔다.
<실시예 2>
다양한 도정률의 보리를 사용한 흑국균 배양물의 제조
하기 기재되는 바와 같은 방법에 의해 다양한 정도의 정백맥 (Stirling, 호주산) 을 사용하여 흑국균 배양물을 제조하고, 그 안의 효소 활성을 측정하였다.
1. 전배양 방법
65%-정백맥 8 g 및 물 100 ml 을 500-ml 배플 원뿔형 플라스크에 넣고, 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하여 전배양 배지를 수득하였다. 냉각 후, 흑국균 (Aspergillus awamori NBRC4388) 을 전배양 배지 내로 1 x 106/ml 로 접종하고, 진탕하면서 37℃ 및 100 rpm 에서 24 시간 동안 배양하여 전배양 액체를 수득하였다.
2. 본배양 방법
65%-정백맥, 83%-정백맥, 92%-정백맥, 95%-정백맥 및 98%-정백맥 중 임의의 것의 2 g, 질산칼륨 0.2 g, 인산이수소칼륨 0.3 g 및 물 100 ml 을 500-ml 원뿔형 플라스크에 넣고, 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하여 주배양 배지를 수득하였다. 냉각후, 전배양 액체 1 ml 을 주배양 배지에 접종하고, 37℃ 및 100 rpm 에서 48 시간 동안 진탕하면서 배양하였다.
3. 측정방법
배양 완료 후, 녹말 가수분해성 효소인, 글루코아밀라아제 (GA), α-아밀라아제 (AA) 및 산-안정성 α-아밀라아제 (ASAA) 의 활성을 측정하였다.
글루코아밀라아제 (GA) 활성을 당화력 분별 정량화 키트 (Kikkoman Corporation 제조) 를 사용하여 측정하고, α-아밀라아제 (AA) 활성을 α-아밀라아제 측정 키트 (Kikkoman Corporation 제조) 를 사용하여 측정하였다. 산-안정성 α-아밀라아제 (ASAA) 활성의 측정을 위해, [Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng., 76, 105-110 (1993), Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng., 77, 483-489 (1994), 및 Shigetoshi Sudo et al: Journal of the Brewing Society of Japan, 89, 768-774 (1994)] 에 기재된 방법을 약간 변형하였다. 즉, 산-불안정성 α- 아밀라아제 활성은 배양물에 산을 처리하여 불활성화시킨 다음, 산-안정성 α-아밀라아제 활성을 α-아밀라아제 측정 키트 (Kikkoman Corporation 제조) 로 측정하였다. 좀더 구체적으로, 100 mM 아세트산 완충액 (pH 3) 9 ml 을 배양 액체 1 ml 에 첨가하고, 산 처리를 37℃ 에서 1 시간 동안 수행하고, α-아밀라아제 측정 키트 (Kikkoman Corporation 제조) 로 측정하였다.
도 5 내지 7 은 측정 결과를 보여준다.
4. 결과
도 5 내지 7 에서 제시된 바와 같이, 도정률이 감소하면 녹말 가수분해성 효소의 생산성은 증가하였다. 심지어 낮은 도정률의 98%-정백맥으로도, 보리가 분쇄된 경우 그 안의 효소 생산성이 유의하게 감소하였다. 상기 방식으로, 흑국균 배양물 중의 효소 생산성이 실험예 1 에서 제시된 바와 같은 글루코오스 방출 속도에 대한 역 관련성을 가지는 경향이 관찰되었고, 보리의 도정률을 변화시켜 흑국균 배양물 중의 효소 생산성을 제어하였다는 것을 밝혔다.
<실시예 3>
다양한 도정률의 보리를 사용한 황국균 배양물의 제조
하기 기재되는 바와 같은 방법에 의해 다양한 정도의 정백맥 (Stirling, 호주산) 을 사용하여 황국균 배양물을 제조하고, 그 안의 효소 활성을 측정하였다.
1. 배양 방법
65%-정백맥, 83%-정백맥, 92%-정백맥, 95%-정백맥 및 98%-정백맥 중 임의의 것의 2 g, 질산나트륨 1.2% (w/vol), 염화칼륨 0.8% (w/vol), 인산이수소칼륨 0.4% (w/vol), 황산마그네슘 헵타히드레이트 0.2% (w/vol), 철 술페이트 헵타히드레이트 0.08% (w/vol) 및 물을 함유하는 배지 100 ml 을 500-ml 원뿔형 플라스크에 넣고, 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하여 배지를 제조하였다. 냉각후, 황국균 (Aspergillus oryzae RIB40) 을 전배양 배지 내로 1 x 106/ml 로 접종하고, 진탕하면서 30℃ 및 100 rpm 에서 72 시간 동안 배양하였다.
2. 측정방법
배양 완료 후, 녹말 가수분해성 효소인, 글루코아밀라아제 (GA) 및 α-아밀라아제 (AA) 의 활성을 측정하였다.
글루코아밀라아제 (GA) 활성을 당화력 분별 정량화 키트 (Kikkoman Corporation 제조) 를 사용하여 측정하고, α-아밀라아제 (AA) 활성을 α-아밀라아제 측정 키트 (Kikkoman Corporation 제조) 를 사용하여 측정하였다.
도 8 및 9 는 측정 결과를 보여준다.
3. 결과
도 8 및 9 에서 제시된 바와 같이, 도정률이 감소하면 녹말 가수분해성 효소의 생산성은 증가하였다. 특히, 98%-정백맥을 사용하는 경우, 글루코아밀라아제의 활성은 유의하게 증가하였다. 심지어 낮은 도정률의 98%-정백맥으로도, 분쇄된 보리가 사용된 경우 그 안의 효소 생산성이 유의하게 감소하였다. 상기 기재된 바와 같이, 황국균 배양물 중의 효소 생산성이 실험예 1 에서 제시된 바와 같은 글루코오스 방출 속도에 의해 크게 영향을 받았으며, 보리의 도정률을 변화시 켜 황국균 배양물 중의 효소 생산성을 제어하였다는 것을 밝혔다.
<실시예 4>
다양한 도정률의 보리를 사용한 사상 진균 (Trichoderma viride) 배양물의 제조
하기 기재되는 바와 같은 방법에 의해 다양한 정도의 정백맥 (Stirling, 호주산) 을 사용하여 셀룰로오스분해 효소를 제조할 수 있는 사상 진균 (Trichoderma viride) 의 배양물을 제조하고, 그 안의 효소 활성을 측정하였다.
1. 전배양 방법
글루코오스 2%, 효모 추출물 0.5%, 질산칼륨 0.1%, 모노칼륨 수소 포스페이트 0.1%, 황산암모늄 0.07%, 황산마그네슘 헵타히드레이트 0.03%, 염화칼슘 0.02% (각 % 는 w/vol 임) 및 물을 함유하는 배지 100 ml 을 500-ml 배플 원뿔형 플라스크에 넣고, 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하여 전배양 배지를 제조하였다. 냉각후, 트리코데르마 비리데 (Torichoderma viride NBRC31137) 를 전배양 배지 내로 1 x 106/ml 로 접종하고, 진탕하면서 30℃ 및 100 rpm 에서 24 시간 동안 배양하여 전배양 액체를 수득하였다.
2. 본배양 방법
정백맥 2%, 트립톤 0.08%, 황산암모늄 0.25%, 인산암모늄 0.1%, 염화칼슘 0.03%, 황산마그네슘 헵타히드레이트 0.03%, 질산칼륨 0.12% (각 % 는 w/vol 임) 및 물을 함유하는 배지 100 ml 을 500-ml 배플 원뿔형 플라스크에 넣고, 오토클레 이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하여 주배양 배지를 수득하였다.
65%-정백맥, 83%-정백맥, 92%-정백맥, 95%-정백맥, 98%-정백맥 또는 98%-정백맥 분쇄 생성물을 상기 언급된 정백맥으로서 사용하였다.
냉각후, 전배양 액체 10 ml 을 주배양 배지에 접종하고, 30℃ 및 100 rpm 에서 90 시간 동안 진탕하면서 배양하였다.
3. 측정방법
배양 완료 후, 셀룰로오스분해 효소인 셀룰라아제 (CEL) 의 활성을 측정하였다. 셀룰라아제 (CEL) 활성을 기질로서 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 의 가수분해로부터 발생된 감소된 당류의 양을 디니트로살리실산 (DNS) 방법에 의해 정량화하는 방법에 의해 측정하였다. 좀더 구체적으로, 배양 액체 1 ml 을 1% CMC 기질 용액 1 ml (100 mM 아세트산 완충액 (pH 5) 중에 Sigma-Aldrich 에서 제조된 low viscosityTM 를 용해하여 수득된 용액) 에 첨가하고, 40℃ 에서 정확히 10 분 동안 효소 반응시킨다. 그 후, 디니트로살리실산 0.75%, 수산화나트륨 1.2%, 칼륨 나트륨 타르트레이트 테트라히드레이트 22.5% 및 락토오스 모노히드레이트 0.3% 를 함유하는 DNS 시약 4 ml 을 혼합물에 첨가하고 잘 혼합하여 반응을 종결시킨다. 반응 종료 후 액체 중의 감소된 당류의 양을 정량하기 위해, 반응 종료 후 액체를 끓는 수조에서 정확히 15 분 동안 가열하였다. 이어서, 액체를 실온으로 냉각시키고, 540 nm 에서의 흡광도를 측정하여 글루코오스의 것에 해당하는 감소된 당류의 양을 정량하였다. 1 단위의 셀룰라아제 (CEL) 활성은 분 당 1 μmol 의 글루코오스에 해당하는 감소된 당류의 제조에 필요한 효소의 양을 나타낸다.
4. 결과
도 10 은 측정 결과를 보여준다. 셀룰로오스 생산성이 또한 국균을 제외한 사상 진균인 트리코데르마 비리데 (Trichoderma viride) 에서 도정률에 따라 상이하였다는 것이 확인되었다. 98%-정백맥은 최고 효소 생산성을 제공하는 반면, 그의 분쇄 생성물의 효소 활성은 유의하게 감소하였다. 그러므로, 보리 껍질의 영양소 방출 억제 효과가 셀룰라아제의 고 생산성에 기여하는 것으로 제안된다.
<실시예 5>
다양한 도정률의 보리를 사용한 사상 진균 (Trichoderma reesei) 배양물의 제조
하기 기재되는 바와 같은 방법에 의해 다양한 정도의 정백맥 (Stirling, 호주산) 을 사용하여 셀룰로오스분해 효소를 제조할 수 있는 사상 진균 (Trichoderma reesei) 의 배양물을 제조하고, 그 안의 효소 활성을 측정하였다.
1. 배양 방법
(1) 전배양 방법
글루코오스 2%, 효모 추출물 0.5%, 질산칼륨 0.1%, 모노칼륨 수소 포스페이트 0.1%, 황산암모늄 0.07%, 황산마그네슘 헵타히드레이트 0.03%, 염화칼슘 0.02% (각 % 는 w/vol 임) 및 물을 함유하는 배지 100 ml 을 500-ml 배플 원뿔형 플라스 크에 넣고, 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하여 전배양 배지를 제조하였다. 냉각후, 트리코데르마 레세이 (Torichoderma reesei NBRC31326) 을 전배양 배지 내로 1 x 106/ml 로 접종하고, 진탕하면서 30℃ 및 100 rpm 에서 72 시간 동안 배양하여 전배양 액체를 수득하였다.
(2) 본배양 방법
정백맥 2%, 트립톤 0.08%, 황산암모늄 0.25%, 인산암모늄 0.1%, 염화칼슘 0.03%, 황산마그네슘 헵타히드레이트 0.03%, 질산칼륨 0.12% (각 % 는 w/vol 임) 및 물을 함유하는 배지 100 ml 을 500-ml 배플 원뿔형 플라스크에 넣고, 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하여 주배양 배지를 수득하였다.
65%-정백맥, 83%-정백맥, 95%-정백맥, 98%-정백맥 또는 98%-정백맥 분쇄 생성물을 상기 언급된 정백맥으로서 사용하였다.
냉각후, 전배양 액체 10 ml 을 주배양 배지에 접종하고, 30℃ 및 100 rpm 에서 96 시간 동안 진탕하면서 배양하였다.
2. 효소 활성의 측정 방법
배양 완료 후, 배양 액체를 원심분리하여 상청액을 수집하고, 상청액 중의 식물 섬유 분해 효소의 활성을 측정하였다.
(1) 셀룰라아제 활성의 측정 방법
셀룰라아제 (CEL) 활성을 기질로서 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 의 가수분해로부터 발생된 감소된 당류의 양을 디니트로살리실산 (DNS) 방법에 의해 정량화 하는 방법에 의해 측정하였다. 좀더 구체적으로, 배양 액체 1 ml 을 1% CMC 기질 용액 1 ml (100 mM 아세트산 완충액 (pH 5) 중에 Sigma-Aldrich 에서 제조된 low viscosityTM 를 용해하여 수득된 용액) 에 첨가하고, 40℃ 에서 정확히 10 분 동안 효소 반응시킨다. 그 후, 디니트로살리실산 0.75%, 수산화나트륨 1.2%, 칼륨 나트륨 타르트레이트 테트라히드레이트 22.5% 및 락토오스 모노히드레이트 0.3% 를 함유하는 DNS 시약 4 ml 을 혼합물에 첨가하고 잘 혼합하여 반응을 종결시킨다. 반응 종료 후 액체 중의 감소된 당류의 양을 정량하기 위해, 반응 종료 후 액체를 끓는 수조에서 정확히 15 분 동안 가열하였다. 이어서, 액체를 실온으로 냉각시키고, 540 nm 에서의 흡광도를 측정하여 글루코오스의 것에 해당하는 감소된 당류의 양을 정량하였다. 1 단위의 셀룰라아제 (CEL) 활성은 분 당 1 μmol 의 글루코오스에 해당하는 감소된 당류의 제조에 필요한 효소의 양을 나타낸다.
(2) 자일라나아제 활성의 측정 방법
그 다음, 자일라나아제 (XYL) 활성을 기질로서 귀리 스펠트밀로부터의 크실란의 효소 가수분해에 의해 생성된 감소된 당류를 DNS 와 반응시키고, 540 nm 에서의 흡광도의 증가를 정량화하여 측정하였다. 좀더 구체적으로, 배양 액체 0.1 ml 을 1% 크실란 기질 용액 (크실란, 200 mM 아세트산 완충액 (pH 4.5) 에 용해된 Sigma-Aldrich 에서 제조된 귀리 스펠트밀로부터) 1.9 ml 에 첨가하고, 40℃ 에서 정확히 10 분 동안 효소 반응시킨다. 그 후, 디니트로살리실산 0.75%, 수산화 나트륨 1.2%, 칼륨 나트륨 타르트레이트 테트라히드레이트 22.5% 및 락토오스 모노히드레이트 0.3% 를 함유하는 DNS 시약 4 ml 을 혼합물에 첨가하고 잘 혼합하여 반응을 종결시킨다. 반응 종료 후 액체 중의 감소된 당류의 양을 정량하기 위해, 반응 종료 후 액체를 끓는 수조에서 정확히 15 분 동안 가열하였다. 이어서, 액체를 실온으로 냉각시키고, 540 nm 에서의 흡광도를 측정하여 크실로오스의 것에 해당하는 감소된 당류의 양을 정량하였다. 1 단위의 자일라나아제 활성은 40℃ 및 10 분의 반응 조건하에서 분 당 1 μmol 의 크실로오스에 해당하는 감소된 당류의 제조에 필요한 효소의 양을 나타낸다.
(3) β-글루코시다아제 활성의 측정 방법
β-글루코시다아제 (BGL) 활성을 이하 기재되는 바와 같은 방법에 의해 측정하였다. 1 mM p-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드 (PNPG) 를 기질로서 사용하는 50 mM 아세트산 완충액 (pH 5) 에서 효소 반응을 37℃ 에서 정확히 10 분 동안 수행하였다. 반응 종료 후, 발생된 p-니트로페놀의 양을 410 nm 에서의 흡광도에 의해 정량하여 효소 활성을 계산하였다. 그곳에 200 mM 탄산나트륨 용액을 반응 액체의 2 배 양으로 첨가하여 반응을 종결하였다. 1 단위의 활성은 1 μmol 의 글루코오스가 분 당 방출되는 활성을 나타낸다.
3. 결과
도 11 내지 13 은 측정 결과를 보여준다. 식물 섬유 분해 효소의 생산성이 또한 국균을 제외한 사상 진균인 트리코데르마 레세이 (Trichoderma reesei) 에서 도정률에 따라 상이하였다는 것이 확인되었다. 95%- 또는 98%-정백맥을 사 용하는 경우 높은 효소 생산성이 수득되었다. 그러나, 98%-정백맥 분쇄 생성물을 사용하는 경우, 효소 활성은 유의하게 감소하였다. 그러므로, 보리 껍질의 영양소 방출에 대한 영양소 방출 억제 효과가 식물 섬유 분해 효소의 고 생산성에 기여하는 것으로 제안된다.
<실시예 6>
다양한 도정률의 보리를 사용한 사상 진균 (Aspergillus aculeatus) 배양물의 제조
하기 기재되는 바와 같은 방법에 의해 다양한 정도의 정백맥 (Stirling, 호주산) 을 사용하여 셀룰로오스분해 효소를 제조할 수 있는 사상 진균 (Aspergillus aculeatus) 의 배양물을 제조하고, 그 안의 효소 활성을 측정하였다.
1. 배양 방법
(1) 전배양 방법
글루코오스 2%, 효모 추출물 0.5%, 질산칼륨 0.1%, 모노칼륨 수소 포스페이트 0.1%, 황산암모늄 0.07%, 황산마그네슘 헵타히드레이트 0.03%, 염화칼슘 0.02% (각 % 는 w/vol 임) 및 물을 함유하는 배지 100 ml 을 500-ml 배플 원뿔형 플라스크에 넣고, 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하여 전배양 배지를 제조하였다. 냉각후, 아스페르길루스 아큘레아투스 (Aspergillus aculeatus NBRC3530) 을 전배양 배지 내로 1 x 106/ml 로 접종하고, 진탕하면서 30℃ 및 100 rpm 에서 72 시간 동안 배양하여 전배양 액체를 수득하였다.
(2) 본배양 방법
정백맥 2%, 트립톤 0.08%, 황산암모늄 0.25%, 인산암모늄 0.1%, 염화칼슘 0.03%, 황산마그네슘 헵타히드레이트 0.03%, 질산칼륨 0.12% (각 % 는 w/vol 임) 및 물을 함유하는 배지 100 ml 을 500-ml 배플 원뿔형 플라스크에 넣고, 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하여 주배양 배지를 수득하였다.
65%-정백맥, 83%-정백맥, 95%-정백맥, 98%-정백맥 또는 98%-정백맥 분쇄 생성물을 상기 언급된 정백맥으로서 사용하였다.
냉각후, 전배양 액체 10 ml 을 주배양 배지에 접종하고, 30℃ 및 100 rpm 에서 96 시간 동안 진탕하면서 배양하였다.
2. 효소 활성의 측정 방법
배양 완료 후, 배양 액체를 원심분리하여 상청액을 수집하고, 상청액 중의 식물 섬유 분해 효소의 활성을 측정하였다.
(1) 셀룰라아제 활성의 측정 방법
셀룰라아제 (CEL) 활성을 기질로서 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 의 가수분해로부터 발생된 감소된 당류의 양을 디니트로살리실산 (DNS) 방법에 의해 정량화하는 방법에 의해 측정하였다. 좀더 구체적으로, 배양 액체 1 ml 을 1% CMC 기질 용액 1 ml (100 mM 아세트산 완충액 (pH 5) 중에 Sigma-Aldrich 에서 제조된 low viscosityTM 를 용해하여 수득된 용액) 에 첨가하고, 40℃ 에서 정확히 10 분 동안 효소 반응시킨다. 그 후, 디니트로살리실산 0.75%, 수산화나트륨 1.2%, 칼륨 나트륨 타르트레이트 테트라히드레이트 22.5% 및 락토오스 모노히드레이트 0.3% 를 함유하는 DNS 시약 4 ml 을 혼합물에 첨가하고 잘 혼합하여 반응을 종결시킨다. 반응 종료 후 액체 중의 감소된 당류의 양을 정량하기 위해, 반응 종료 후 액체를 끓는 수조에서 정확히 15 분 동안 가열하였다. 이어서, 액체를 실온으로 냉각시키고, 540 nm 에서의 흡광도를 측정하여 글루코오스의 것에 해당하는 감소된 당류의 양을 정량하였다. 1 단위의 셀룰라아제 (CEL) 활성은 분 당 1 μmol 의 글루코오스에 해당하는 감소된 당류의 제조에 필요한 효소의 양을 나타낸다.
(2) β-글루코시다아제 활성의 측정 방법
β-글루코시다아제 (BGL) 활성을 이하 기재되는 바와 같은 방법에 의해 측정하였다. 1 mM p-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드 (PNPG) 를 기질로서 사용하는 50 mM 아세트산 완충액 (pH 5) 에서 효소 반응을 37℃ 에서 정확히 10 분 동안 수행하였다. 반응 종료 후, 발생된 p-니트로페놀의 양을 410 nm 에서의 흡광도에 의해 정량하여 효소 활성을 계산하였다. 그곳에 200 mM 탄산나트륨 용액을 반응 액체의 2 배 양으로 첨가하여 반응을 종결하였다. 1 단위의 활성은 1 μmol 의 글루코오스가 분 당 방출되는 활성을 나타낸다.
3. 결과
도 14 및 15 는 측정 결과를 보여준다. 식물 섬유 분해 효소의 생산성이 또한 국균을 제외한 사상 진균인 아스페르길루스 아큘레아투스 (Aspergillus aculeatus) 에서 도정률에 따라 상이하였다는 것이 확인되었다. 98%-정백맥을 사용하는 경우 높은 효소 생산성이 수득되었다. 그러나, 그의 분쇄 생성물을 사용하는 경우, CEL 및 BGL 활성은 감소하였다. 그러므로, 보리 껍질의 영양소 방출에 대한 영양소 방출 억제 효과가 상기 효소의 고 생산성에 기여하는 것으로 제안된다.
<실시예 7>
다양한 도정률의 보리를 사용한 백색부후균 배양물의 제조
하기 기재되는 바와 같은 방법에 의해 다양한 정도의 정백맥 (Stirling, 호주산) 을 사용하여 셀룰로오스분해 효소를 제조할 수 있는 백색부후균 배양물을 제조하고, 그 안의 효소 활성을 측정하였다.
1. 배양 방법
(1) 전배양 방법
글루코오스 2%, 효모 추출물 0.5%, 질산칼륨 0.1%, 모노칼륨 수소 포스페이트 0.1%, 황산암모늄 0.07%, 황산마그네슘 헵타히드레이트 0.03%, 염화칼슘 0.02% (각 % 는 w/vol 임) 및 물을 함유하는 배지 100 ml 을 500-ml 배플 원뿔형 플라스크에 넣고, 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하여 전배양 배지를 제조하였다. 냉각후, 전배양 배지를 이르펙스 락테우스 (Irpex lacteus NBRC5367) 의 크기 5 mm × 5 mm 의 30 균사체 매트로 접종하고, 28℃ 및 120 rpm 에서 96 시간 동안 진탕하면서 배양하여 전배양 액체를 수득하였다.
(2) 본배양 방법
정백맥 2%, 폴리펩톤 0.1%, 황산암모늄 0.14%, 인산이수소칼륨 0.2%, 우레아 0.03%, 황산마그네슘 헵타히드레이트 0.03%, 염화칼슘 0.03%, Tween 80 0.1% (각 % 는 w/vol 임) 및 물을 함유하는 배지 100 ml 을 500-ml 배플 원뿔형 플라스크에 넣고, 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하여 주배양 배지를 수득하였다.
65%-정백맥, 83%-정백맥, 98%-정백맥 또는 98%-정백맥 분쇄 생성물을 상기 언급된 정백맥으로서 사용하였다.
냉각후, 전배양 액체 10 ml 을 주배양 배지에 접종하고, 28℃ 및 120 rpm 에서 96 시간 동안 진탕하면서 배양하였다.
2. 효소 활성의 측정 방법
배양 완료 후, 배양 액체를 원심분리하여 상청액을 수집하고, 상청액 중의 식물 섬유 분해 효소의 활성을 측정하였다.
(1) 셀룰라아제 활성의 측정 방법
셀룰라아제 (CEL) 활성을 기질로서 카르복시메틸셀룰로오스 (CMC) 의 가수분해로부터 발생된 감소된 당류의 양을 디니트로살리실산 (DNS) 방법에 의해 정량화하는 방법에 의해 측정하였다. 좀더 구체적으로, 배양 액체 1 ml 을 1% CMC 기질 용액 1 ml (100 mM 아세트산 완충액 (pH 5) 중에 Sigma-Aldrich 에서 제조된 low viscosityTM 를 용해하여 수득된 용액) 에 첨가하고, 40℃ 에서 정확히 10 분 동안 효소 반응시킨다. 그 후, 디니트로살리실산 0.75%, 수산화나트륨 1.2%, 칼륨 나트륨 타르트레이트 테트라히드레이트 22.5% 및 락토오스 모노히드레이트 0.3% 를 함유하는 DNS 시약 4 ml 을 혼합물에 첨가하고 잘 혼합하여 반응을 종결시 킨다. 반응 종료 후 액체 중의 감소된 당류의 양을 정량하기 위해, 반응 종료 후 액체를 끓는 수조에서 정확히 15 분 동안 가열하였다. 이어서, 액체를 실온으로 냉각시키고, 540 nm 에서의 흡광도를 측정하여 글루코오스의 것에 해당하는 감소된 당류의 양을 정량하였다. 1 단위의 셀룰라아제 (CEL) 활성은 분 당 1 μmol 의 글루코오스에 해당하는 감소된 당류의 제조에 필요한 효소의 양을 나타낸다.
(2) 자일라나아제 활성의 측정 방법
그 다음, 자일라나아제 (XYL) 활성을 기질로서 귀리 스펠트밀로부터의 크실란의 효소 가수분해에 의해 생성된 감소된 당류를 DNS 와 반응시키고, 540 nm 에서의 흡광도의 증가를 정량화하여 측정하였다. 좀더 구체적으로, 배양 액체 0.1 ml 을 1% 크실란 기질 용액 (크실란, 200 mM 아세트산 완충액 (pH 4.5) 에 용해된 Sigma-Aldrich 에서 제조된 귀리 스펠트밀로부터) 1.9 ml 에 첨가하고, 40℃ 에서 정확히 10 분 동안 효소 반응시킨다. 그 후, 디니트로살리실산 0.75%, 수산화나트륨 1.2%, 칼륨 나트륨 타르트레이트 테트라히드레이트 22.5% 및 락토오스 모노히드레이트 0.3% 를 함유하는 DNS 시약 4 ml 을 혼합물에 첨가하고 잘 혼합하여 반응을 종결시킨다. 반응 종료 후 액체 중의 감소된 당류의 양을 정량하기 위해, 반응 종료 후 액체를 끓는 수조에서 정확히 15 분 동안 가열하였다. 이어서, 액체를 실온으로 냉각시키고, 540 nm 에서의 흡광도를 측정하여 크실로오스의 것에 해당하는 감소된 당류의 양을 정량하였다. 1 단위의 자일라나아제 활성은 40℃ 및 10 분의 반응 조건하에서 분 당 1 μmol 의 크실로오스에 해당하는 감소된 당류 의 제조에 필요한 효소의 양을 나타낸다.
3. 결과
도 16 및 17 은 측정 결과를 보여준다. 식물 섬유 분해 효소의 생산성이 또한 백색부후균에서 도정률에 따라 상이하였다는 것이 확인되었다. 98%-정백맥을 사용하는 경우 최고 효소 생산성이 수득되었다. 그러나, 그의 분쇄 생성물을 사용하는 경우, 효소 활성은 유의하게 감소하였다. 그러므로, 보리 껍질의 영양소 방출에 대한 영양소 방출 억제 효과가 식물 섬유 분해 효소의 고 생산성에 기여하는 것으로 제안된다.
<실시예 8>
호화되지 않은 통보리를 사용한 백국균 배양물의 제조
(1) 전배양 방법: 통보리 (Stirling, 호주산) 8 g 및 물 100 ml 을 500-ml 배플 원뿔형 플라스크에 넣고, 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하여 전배양 배지를 수득하였다. 백국균 (Aspergillus kawachii NBRC4308) 을 전배양 배지 내로 1 x 106/ml 로 접종하고, 진탕하면서 37℃ 및 100 rpm 에서 24 시간 동안 배양하여 전배양 액체를 수득하였다.
(2) 본배양 방법: KNO3 0.2 g, KH2PO4 0.3 g, 및 물 100 ml 을 500-ml 배플 원뿔형 플라스크에 넣고, 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하였다. 냉각후, 클로르암페니콜 (Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.) 을 수득물에 농도가 50 μg/ml 이 되도록 첨가하고, 열에 의해 처리되지 않은 통보리 2 g 을 그 곳에 첨가하여 주배양 배지를 수득하였다. 전배양 액체 1 ml 을 주배양 배지에 접종하고, 진탕하면서 37℃ 및 100 rpm 에서 72 시간 동안 배양하여 국균 배양물을 수득하였다.
대조군으로, 국균 배양물을 호화된 배양 원료를 사용하여 제조하였다. 즉, 통보리 2 g, KNO3 0.2 g, KH2PO4 0.3 g, 및 물 100 ml 을 500-ml 배플 원뿔형 플라스크에 넣고, 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하였다. 냉각후, 클로르암페니콜을 수득물에 농도가 50 μg/ml 이 되도록 첨가하여 주배양 배지를 수득하였다. 전배양 액체 1 ml 을 주배양 배지에 접종하고, 진탕하면서 37℃ 및 100 rpm 에서 72 시간 동안 배양하여 국균 배양물을 수득하였다.
(3) 측정방법
각 시험 플롯에서 수득된 국균 배양물 중의 글루코아밀라아제, 산-안정성 α-아밀라아제, 및 α-아밀라아제의 활성을 측정하였다. 즉, 글루코아밀라아제 활성을 당화력 분별 정량화 키트 (Kikkoman Corporation 제조) 를 사용하여 측정하였다. 산-안정성 α-아밀라아제 활성의 측정을 위해, [Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng., 76, 105-110 (1993), Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng., 77, 483-489 (1994), 및 Shigetoshi Sudo et al: Journal of the Brewing Society of Japan, 89, 768-774 (1994)] 에 기재된 방법을 약간 변형하였다. 즉, 산-불안정성 α-아밀라아제 활성은 배양물에 산을 처리하여 불활성화시킨 다음, 산-안정성 α-아밀라아제 활성을 α-아밀라아제 측정 키트 (Kikkoman Corporation 제조) 로 측정하였다. 좀더 구체적으로, 100 mM 아세트산 완충액 (pH 3) 9 ml 을 배양 액체 1 ml 에 첨가하고, 산 처리를 37℃ 에서 1 시간 동안 수행하고, α-아밀라아제 측정 키트 (Kikkoman Corporation 제조) 로 측정하였다. α-아밀라아제 활성을 α-아밀라아제 측정 키트 (Kikkoman Corporation 제조) 로 측정하였다. 결과를 표 1 에 제시하였다.
(4) 결과
본 발명의 생 통보리 국균 배양물에서, 글루코아밀라아제 및 산-안정성 α-아밀라아제 모두가 양호하고 균형잡힌 방식으로 제조되었다. 반면 α-아밀라아제의 수율은 다소 낮았다.
대조적으로, 비교적 다량의 산-안정성 α-아밀라아제 및 α-아밀라아제가 제조되었다. 이것은 아마도 영양소 조건이 호화된 원료는 사용되었음에도 불구하고 KNO3 및 KH2PO4 의 존재로 인해 적합한 범위 내로 유지되었기 때문일 것이다.
그러므로, 발효 식료품의 제조에 사용가능한 국균 배양물이 본 발명에 따라 제조되었다는 것이 밝혀졌다.
시험 플롯

효소 활성		 생 통보리 국균 배양물
(껍질이 없고 호화되지 않음)		 대조군
(껍질이 없고 호화됨)
글루코아밀라아제 활성 (U/ml) 110.6 29.2
산-안정성 α-아밀라아제 활성 (U/ml) 3.6 3.7
α-아밀라아제 활성 (U/ml) 8.3 10.7
<실시예 9>
호화되지 않은 통보리를 사용함에 의한 백국균 배양물로 보리 소주의 제조
(1) 전배양 방법: 통보리 (Stirling, 호주산) 8 g 및 물 100 ml 을 500-ml 배플 원뿔형 플라스크에 넣고, 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하여 전배양 배지를 수득하였다. 백국균 (Aspergillus kawachii NBRC4308) 을 전배양 배지 내로 1 x 106/ml 로 접종하고, 진탕하면서 37℃ 및 100 rpm 에서 24 시간 동안 배양하여 전배양 액체를 수득하였다.
(2) 본배양 방법: 통보리 0.5 g, KNO3 0.2 g, KH2PO4 0.3 g, 및 물 100 ml 을 500-ml 배플 원뿔형 플라스크에 넣고, 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하여 주배양 배지를 수득하였다. 전배양 액체 1 ml 을 주배양 배지에 접종하고, 진탕하면서 37℃ 및 100 rpm 에서 24 시간 동안 배양하였다. 그 후, 열에 의해 처리되지 않은 통보리 1.5 g 을 그곳에 첨가하고, 진탕하면서 37℃ 및 100 rpm 에서 추가 48 시간 동안 배양하여 국균 배양물을 수득하였다.
(3) 효모: 가고시마 (Kagoshima) 효모를 YPD 배지 1 ml 에 100 rpm 에서 밤새 진탕하면서 배양하고, 원심분리하여 세포를 수집하고, 멸균수로 2 회 세척하였다.
(4) 으깸: 으깸 조합은 표 2 에 제시되는 바와 같았다. 추가 보리에 대해, 씻은 후 60-분 담금, 30-분 수배 및 40-분 찜을 거친 통보리를 사용하였다. 상기 언급된 효모의 전체양을 사용하였다.
1 차 2 차 합계
추가 보리 (g) 310 615 925
으깨는 물 (ml) 300 650 950
국균 배양물 (ml) 350 0 350
90% 락트산 (ml) 2 0 2
(5) 발효 조건: 25℃ 에서 20 일 동안 발효시켰다. 1 차 으깸 후 3 일에 2 차 으깸을 수행하였다.
(6) 증류: -650 mmHg 의 감압하에서 증류시켰다.
(7) 결과
발효를 연속적으로 수행하였고, 발효가 완료된 후 매시의 알코올 함량은 17.5% 였다.
증류 후 수득된 샘플은 알코올 음료에 대한 전문가 6 명의 패널에 의해 감각기관으로 평가되었다. 결과로서, 수득된 샘플은 알코올 음료로 양호한 품질을 갖는 것으로 높이 평가되었다.
상기 결과로부터, 본 발명의 방법에 따라 임의의 결점없는 품질을 가진 보리 소주를 제조하였다는 것이 밝혀졌다.
<실시예 10>
호화되지 않은 통보리를 사용한 황국균 배양물의 제조
(1) 전배양 방법: 통보리 (Stirling, 호주산) 8 g 및 물 100 ml 을 500-ml 배플 원뿔형 플라스크에 넣고, 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하여 전배양 배지를 수득하였다. 황국균 (Aspergillus oryzaei NRIB40) 을 전배양 배지 내로 1 x 106/ml 로 접종하고, 진탕하면서 37℃ 및 100 rpm 에서 24 시간 동안 배양하여 전배양 액체를 수득하였다.
(2) 본배양 방법: KNO3 0.8 g, KH2PO4 1.2 g, MgSO4 0.2 g, 및 물 100 ml 을 500-ml 배플 원뿔형 플라스크에 넣고, 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하였다. 냉각후, 클로르암페니콜 (Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd.) 을 수득물에 농도가 50 μg/ml 이 되도록 첨가하고, 통보리 2 g 을 그곳에 첨가하여 주배양 배지를 수득하였다. 전배양 액체 1 ml 을 주배양 배지에 접종하고, 진탕하면서 37℃ 및 100 rpm 에서 72 시간 동안 배양하여 국균 배양물을 수득하였다.
양성 대조군으로, 국균 배양물을 본 발명의 제 2 양상에 따른 방법에 의해 제조하였다. 즉, 95%-정백맥 (Stirling, 호주산) 2 g, KNO3 0.8 g, KH2PO4 1.2 g, MgSO4 0.2 g 및 물 100 ml 을 500-ml 배플 원뿔형 플라스크에 넣고, 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하였다. 냉각후, 클로르암페니콜을 수득물에 농도가 50 μg/ml 이 되도록 첨가하여, 주배양 배지를 수득하였다. 전배양 액체 1 ml 을 주배양 배지에 접종하고, 진탕하면서 37℃ 및 100 rpm 에서 72 시간 동안 배양하여 국균 배양물을 수득하였다.
(3) 결과
각 시험 플롯에서 수득된 국균 배양물 중의 글루코아밀라아제 및 α-아밀라아제의 활성을 실시예 8 에서와 동일한 방식으로 측정하였다. 표 3 에서 결과를 보여준다.
생 통보리 국균 배양물에서, 글루코아밀라아제가 양호한 정도로 제조된 반면, α-아밀라아제 활성은 다소 낮았다. 상기 모든 효소의 활성은 양성 대조군에서의 활성에 비해 열등했다. 그러나, 상기 모든 효소는 균형잡힌 방식으로 제조되었다. 그러므로, 발효 식료품의 제조에 사용할 수 있는 국균 배양물이 제공되었다는 것이 밝혀졌다.
시험 플롯

효소 활성		 생 통보리 국균 배양물
(껍질이 없고 호화되지 않음)		 양성 대조군 (껍질이 있고 호화됨)
글루코아밀라아제 활성 (U/ml) 37.8 96.2
α-아밀라아제 활성 (U/ml) 174.7 437.4
<실험예 2>
멸균시 다양한 무기 염 농도의 보리 기질 용액 중의 글루코오스 방출 속도의 측정.
보리를 함유하는 다양한 염 농도의 오토클레이브 무기 염 수용액으로 멸균하여 보리 기질 용액을 수득하였다. 각각의 보리 기질 용액을 국균 배양물 유래의 효소와 반응시키고, 보리로부터의 글루코오스 방출 속도를 측정하였다.
1. 보리 기질 용액의 제조 방법
첫번째로, 98%-정백맥 (Stirling, 호주산) 2 g 을 중량을 잰 다음, 물 50 ml 과 함께 500-ml 원뿔형 플라스크에 넣었다. 이것을 오토클레이브 (121℃ 에서 15 분 동안) 로 멸균하여 보리 기질 용액을 제조하였고, 이제 이것을 "No. 1: 대조 플롯" 이라고 나타낸다.
"No. 2: 염 사용 플롯" 에서, 물 대신 질산칼륨 0.1 g 및 인산이수소칼륨 0.15 g 을 함유하는 무기 염 수용액 50 ml 을 사용하였던 것을 제외하고는 "No. 1: 대조 플롯" 에서와 동일한 방식으로 오토클레이브 멸균을 수행하였다. 다른 말로는, 오토클레이브로 멸균시 염 농도는 질산칼륨 0.2% 및 인산이수소칼륨 0.3% 였다.
"No. 3: 멸균시 고농도의 염 사용 플롯" 에서, 물 대신 질산칼륨 0.1 g 및 인산이수소칼륨 0.15 g 을 함유하는 무기 염 수용액 10 ml 을 사용하고, 그 곳에 멸균수 40 ml 을 첨가하였던 것을 제외하고는 "No. 1: 대조 플롯" 에서와 동일한 방식으로 오토클레이브 멸균을 수행하였다. 다른 말로는, 멸균시 염 농도는 질산칼륨 1.0% 및 인산이수소칼륨 1.5% 였고, 이것은 시험 플롯 No. 2 에서의 것의 5 배였다. 그러나, 멸균 및 물 첨가 후 염 농도는, 질산칼륨 0.2% 및 인산이수소칼륨 0.3% 이 되도록 조정되었고, 이것은 시험 플롯 No. 2 에서의 것과 동일하였다.
2. 국균 배양 상청액의 제조 방법
이어서, 배양 원료로서 보리 (Stirling, 호주산) 를 사용하여 제조된 국균 배양물을 여과지로의 여과에 의해 고체-액체 분리시켜 "국균 배양 상청액" 을 수득하였다.
본 실험에서 사용된 국균 배양물의 제조 방법은 이하 기재되는 바와 같았다.
(1) 전배양 방법
65%-정백맥 8 g 및 물 100 ml 을 500-ml 배플 원뿔형 플라스크에 넣고, 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하여 전배양 배지를 수득하였다. 냉각후, 백국균 (Aspergillus kawachii NBRC4308) 을 전배양 배지 내로 1 x 106/ml 로 접종하고, 진탕하면서 37℃ 및 100 rpm 에서 24 시간 동안 배양하여 전배양 액체를 수득하였다.
(2) 본배양 방법
98%-정백맥을 질산칼륨 0.2% (w/vol) 및 인산이수소칼륨 0.3% (w/vol) 이 보충된 물에 첨가하여 98%-정백맥의 양이 2.0% (w/vol) 되도록 액체 배지를 제조하였다. 제조된 액체 배지 3,000 ml 을 5,000-ml 발효조 (B. E. Marubishi Co., Ltd. 제조) 에 넣고, 오토클레이브 (121℃ 에서 15 분 동안) 로 멸균한 후, 상기 언급된 방법에 의해 액체 배지에서 미리 전배양된 백국균 (Aspergillus kawachii NBRC4308) 의 전배양 액체 30 ml 로 접종하였다. 그 후, 37℃ 의 온도에서 42 시간 동안 진탕 속도 300 rpm 및 통기량 0.5 vvm 로 배양을 수행하여, 수득물을 여과지 (Toyo filter paper No. 2) 로 여과하여, "국균 배양 상청액" 을 수득하였다.
3. 글루코오스 방출 속도의 측정 방법
보리 기질 용액 50 ml 및 국균 배양 상청액 50 ml 을 37℃ 에서 5 분 동안 분리해서 유지시킨 다음, 혼합하여 반응을 시작하게하였다. 반응 개시 후 3 시간에 표본 추출된 각각의 반응 액체 중의 글루코오스 농도를 글루코오스 C-II Test Wako (Wako Pure Chemical Industries Co., Ltd. 제조) 로 측정하여, 글루코오스 방출 속도를 계산하였다.
4. 결과
반응 액체 중의 글루코오스 농도의 측정 결과로부터 계산된 글루코오스 방출 속도는 도 18 에 제시한 바와 같다. 글루코오스 방출 속도가 보리 기질 용액의 제조시 염 농도에 의해 상이하였다는 것이 확인되었다. 실험예 1 에서, 글루코오스 방출 속도가 보리의 도정률에 의해 조정되었다는 것이 이미 제시되었다. 실험예 2 에서는 또한 글루코오스 방출 속도가 오토클레이브 멸균과 같은 열처리시 염의 존재에 의해 낮아진다는 것이 밝혀졌다. 이것은 아마도 보리의 열처리시 염의 존재가 보리의 물리적 분해를 억제하기 때문일 것이다.
<실시예 11>
멸균시 다양한 무기 염 농도의 보리를 사용한 백국균 배양물의 제조
하기 기재되는 바와 같은 방법에 의해 다양한 정도의 정백맥 (Stirling, 호주산) 을 사용하여 백국균 배양물을 제조하고, 그 안의 효소 활성을 측정하였다.
1. 전배양 방법
65%-정백맥 8 g 및 물 100 ml 을 500-ml 배플 원뿔형 플라스크에 넣고, 121℃ 에서 15 분 동안 오토클레이브로 멸균하여 전배양 배지를 수득하였다. 냉각후, 백국균 (Aspergillus kawachii NBRC4308) 을 전배양 배지 내로 1 x 106/ml 로 접종하고, 진탕하면서 37℃ 및 100 rpm 에서 24 시간 동안 배양하여 전배양 액체를 수득하였다.
2. 본배양 방법
98%-정백맥 (Stirling, 호주산) 2 g 을 중량을 잰 다음, 물 100 ml 과 함께 500-ml 원뿔형 플라스크에 넣었다. 이것을 오토클레이브로 121℃ 에서 15 분 동안 멸균하여 주배양 배지를 제조하였고, 이제 이것을 "No. 1: 대조 플롯" 이라고 나타낸다.
"No. 2: 염 사용 플롯" 에서, 물 대신 질산칼륨 0.2 g 및 인산이수소칼륨 0.3 g 을 함유하는 무기 염 수용액 100 ml 을 사용하였던 것을 제외하고는 "No. 1: 대조 플롯" 에서와 동일한 방식으로 오토클레이브 멸균을 수행하였다.
"No. 3: 멸균시 고농도의 염 사용 플롯" 에서, 물 대신 질산칼륨 0.2 g 및 인산이수소칼륨 0.3 g 을 함유하는 무기 염 수용액 20 ml 을 사용하고, 그 곳에 멸균수 80 ml 을 첨가하였던 것을 제외하고는 "No. 1: 대조 플롯" 에서와 동일한 방식으로 오토클레이브 멸균을 수행하였다. 다른 말로는, 멸균시 염 농도는 질산칼륨 1.0% 및 인산이수소칼륨 1.5% 였고, 이것은 각각 시험 플롯 No. 2 에서의 것의 5 배였다. 그러나, 멸균 및 물 첨가 후 염 농도는, 질산칼륨 0.2% 및 인산이수소칼륨 0.3% 이 되도록 조정되었고, 이것은 시험 플롯 No. 2 에서의 것과 동일하였다.
냉각후, 전배양 액체 1 ml 을 그렇게 제조된 주배양 배지에 접종하고, 37℃ 및 100 rpm 에서 48 시간 동안 진탕하면서 배양하였다.
3. 측정방법
배양 완료 후, 녹말 가수분해성 효소인, 글루코아밀라아제 (GA) 및 산-안정성 α-아밀라아제 (ASAA) 의 활성을 측정하였다.
글루코아밀라아제 (GA) 활성을 당화력 분별 정량화 키트 (Kikkoman Corporation 제조) 를 사용하여 측정하였다.
산-안정성 α-아밀라아제 (ASAA) 활성의 측정을 위해, [Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng., 76, 105-110 (1993), Sudo S. et al: J. Ferment. Bioeng., 77, 483-489 (1994), 및 Shigetoshi Sudo et al: Journal of the Brewing Society of Japan, 89, 768-774 (1994)] 에 기재된 방법을 약간 변형하였다. 즉, 산-불안정성 α-아밀라아제 활성은 배양물에 산을 처리하여 불활성화시킨 다음, 산-안정성 α-아밀라아제 활성을 α-아밀라아제 측정 키트 (Kikkoman Corporation 제조) 로 측정하였다. 좀더 구체적으로, 100 mM 아세트산 완충액 (pH 3) 9 ml 을 배양 액체 1 ml 에 첨가하고, 산 처리를 37℃ 에서 1 시간 동안 수행하고, α-아밀라아제 측정 키트 (Kikkoman Corporation 제조) 로 측정하였다.
4. 결과
도 19 는 글루코아밀라아제 활성의 측정 결과를 보여주고, 도 20 은 산-안정성 α-아밀라아제 활성의 측정 결과를 보여준다.
도 19 및 20 에서 제시된 바와 같이, 배양시 동일한 염 농도를 갖는 플롯 No. 2 의 것과 비교시, 멸균시 염 농도가 높은 플롯 No. 3 에서 효소 생산성이 향상되었다. 실험예 2 에서, 가열시 보리 기질 용액 중의 무기 염 농도가 높아지면 원료 보리로부터의 당류 방출 속도가 낮아진다는 것이 확인되었다. 그러므로, 효소 생산성은 국균의 성장에 대한 염의 효과외에도 당류 방출 속도에 의해 영향을 받는다는 것으로 제시되었다. 플롯 No. 1 은 염을 함유하지 않아, 국균의 성장이 억제되었을 뿐 아니라, 높은 당류 방출 속도로 인해 그 안의 효소 제조가 유의하게 억제되었다는 것으로 여겨졌다.
지금까지, 배지를 제조하면서 첨가되는 무기 염은 배양 동안 국균의 성장에만 관여하는 것으로 생각되어왔다. 그러나, 본 실시예에 따르면, 국균의 액체 배양 중의 효소 제조가 원료 보리로부터 당류 방출 억제 효과에 의해 촉진된다는 가능성이 제시되었다.
본 발명의 방법에 따르면, 배양계 중의 영양소 농도는 낮게 조절되어, 영양소를 배양계의 외부로부터 조금씩 첨가하는 공급 배양을 수행하지 않고도, 간단한 배치식 배양에 의해 공급 배양과 동등한 배양 방식이 달성되도록 한다.
본 발명에 따르면, 다양한 산업에 사용하기 위한 것 뿐 아니라, 사상 진균 배양물로부터 제조된 발효 식료품, 효소 및 효소 제제의 제조에 사용하기 위한 안정적이고 비용이 적은 사상 진균 배양물의 제조 방법이 제공된다.
추가로, 본 발명은 녹말 가수분해성 효소 유전자 등의 프로모터 영역을 사용하는 헤테로단백질 제조에 적용되는 것으로 기대된다.
그러므로, 본 발명은 식품 제조업, 발효업, 약물 산업 등을 포함하는 넓은 범주의 산업에 적용가능하다.

Claims (16)

  1. 곡류의 도정률을 조정하여 배양 원료로부터 배양계 내로의 영양소의 방출 속도를 제어하면서 사상 진균을 배양하여 사상 진균 배양물 중의 효소의 생산성을 향상시키는 것을 포함하는,
    표면이 껍질로 전부 또는 일부 싸인 곡류를 배양 원료로서 함유하는 액체 배지를 사용하여 사상 진균 배양물을 제조하는 방법으로서,
    상기 곡류가 보리를 포함하고,
    상기 사상 진균이 국균, 속명 아스페르길루스(Aspergillus), 속명 트리코데르마 (Trichoderma) 및 백색부후균 (white rot fungi) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는,
    사상 진균 배양물의 제조 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 곡류가 93 % 이상의 도정률을 가진 보리를 포함하는 사상 진균 배양물의 제조 방법.
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 영양소가 배양 원료 중의 전분 유래의 당류 및/또는 배양 원료 중의 단백질 유래의 아미노산을 포함하는 사상 진균 배양물의 제조 방법.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 효소가 녹말 가수분해성 효소, 식물 섬유 분해 효소 및 단백질 가수분해성 효소로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 사상 진균 배양물의 제조 방법.
  7. 삭제
  8. 삭제
  9. 삭제
  10. 삭제
  11. 곡류의 도정률을 조정하여 배양 원료로부터 배양계 내로의 영양소의 방출 속도를 제어하면서 사상 진균을 배양하여 사상 진균 배양물 중의 효소의 생산성을 향상시키는 것을 포함하는,
    표면이 껍질로 전부 또는 일부 싸인 곡류를 배양 원료로서 함유하는 액체 배지를 사용하여 효소를 제조하는 방법으로서,
    상기 곡류가 보리를 포함하고,
    상기 사상 진균이 국균, 속명 아스페르길루스(Aspergillus), 속명 트리코데르마 (Trichoderma) 및 백색부후균 (white rot fungi) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는,
    효소 제조 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 곡류가 93 % 이상의 도정률을 가진 보리를 포함하는 효소 제조 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
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