CN113999799B - 解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于白酒酿造的解淀粉芽孢杆菌，菌剂及其强化大曲在发酵白酒中的应用。本发明提供的解淀粉芽孢杆菌具有高产耐酸性α‑淀粉酶活力和高产四甲基吡嗪等酱香风味的能力，同时又具有耐高温、耐酸和耐乙醇能力强的特性。该菌株可用于发酵生产白酒，提高白酒出酒率和白酒风味。

Description

解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于白酒酿造领域，具体地说涉及一种解淀粉芽孢杆菌，以及该解淀粉芽孢杆菌在白酒生产中的应用。

背景技术

酱香白酒生产过程中的制曲、堆积和发酵等工艺中可富集大量芽孢杆菌，它们是形成酱香型白酒风味成分的基础和关键。其中蜡样芽孢杆菌、泛酸枝芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌这五类菌株是酱香型白酒主要的产香功能菌(钟姝霞，等.现代食品科技，2017,33(4)：89-95)。酱香型大曲成品曲中芽孢杆菌最多，芽孢杆菌的种类和数量将直接决定曲的优劣，进而影响酒醅发酵程度和酒的风格特征。酱香酒醅具有堆积温度高、酒醅pH值较低(一般为pH3.5-5.0左右)并含5％左右乙醇的特点，因此，具有耐高温、耐酸、耐高乙醇浓度等特点的芽孢杆菌将具有明显的生存优势。吴徐建等(工业微生物.2014,44(04))报道了从酱香型酒醅中分离鉴定得到一株能够耐受12％(v/v)的乙醇的解淀粉芽孢杆菌，但该菌株的耐酸能力一般，在pH3-4的培养基中几乎不生长。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是产淀粉酶和蛋白酶的重要微生物，同时也是酱香型白酒中风味物质的主要产生菌之一。白酒中许多香味物质来源于蛋白质，蛋白质及其酶的作用对白酒的风味影响至关重要(聂慧芳，等.酿酒科技，2015,12:41-44)。林群等(酿酒科技,2013,11:30-32)从白酒生产用大曲和酒醅中分离纯化得到1株解淀粉芽孢杆菌,以高粱为发酵底物，从菌株发酵产香风味物质的GC-MS分析定性检测出30多种发酵代谢产物，包括吡嗪类、酸类、酯类、醇类、酮类及芳香族化合物等。芽孢杆菌的使用能有效提高酒基中总酸、总酯和各主要风味物质的含量(曾婷婷，等.酿酒科技,2012,7：32-34)。

白酒发酵酒醅的pH值一般在3.5-5.0左右，需要耐酸能力强的酶才能发挥较好的作用。目前市售的淀粉酶最适pH为6.0-7.0,而淀粉原料液的天然pH为4.5左右。耐酸α-淀粉酶其最适pH在4.0～5.0，且在较大pH值范围内稳定。耐酸耐α－淀粉酶在酒醅pH环境下可以发挥更好的作用。权淑静等(中国酿造，2014，33(5):104-108)从酿造大曲中筛选的产酸性α-淀粉酶菌株最适pH为3.6，且在pH 3.0～5.0之间有良好的酸稳定性。胡博等(天津科技大学学报，2012，27(6))报道了利用基因工程手段获得的产耐酸性高温α-淀粉酶基因枯草芽孢杆菌工程菌株pWB-amyd/WB600，耐酸性高温α-淀粉酶活力达到3,980,U/mL，但该酶的最适pH为6.0，耐酸能力不够强，且为基因工程菌株，活菌体不能直接用于食品生产。任世英等(中国饲料，2021，17)筛选获得1株产耐酸性α-淀粉酶的芽孢杆菌菌株Bacillus sp.SD-1，发酵产酸性α-淀粉酶活力达到74.6U/mL。丁长河等(河南工业大学学报，2016，37(5)报道了经优化后的枯草芽孢杆菌发酵产耐酸耐高温酶α-淀粉酶酶活由43.13U/mL提高到了89.15U/mL(pH5.5条件下)。史媛媛等(西北农业学报，2014，23(4))筛选出1株耐酸、耐胆盐、产蛋白酶和淀粉酶，且能高效降解豆粕抗原蛋白的解淀粉芽孢杆菌B9，其产生的淀粉酶活性达180u/g左右。杨坤明等(中国畜牧兽医2018，45(5))比较了几种商用益生芽孢的菌株特性，结果显示，分离的15株芽孢杆菌均能产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶，但不同菌株产酶能力差异较大，其中解淀粉芽孢杆菌S9菌株表现出较高的产蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶活力，并具有较高的耐酸能力。乔羽等(中国酿造，2018，37(1)：30-34)报道了一株产淀粉酶能力较高的菌株JT10-9，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌，其淀粉酶活力可达到228.73U/mL。该菌株能耐受9％的乙醇体积分数，在pH 3.5的条件下可生长。

通过人工诱变或基因工程等技术可以显著提高微生物菌株的淀粉酶活力。刘永乐等(中国食品学报,2009,12:55-59)报道了从某柠檬酸厂分离到1株耐酸性ɑ-淀粉酶的蜡状芽孢杆菌生产菌株YC,通过紫外诱变及紫外-硫酸二乙酯(DES)复合诱变，选育到1株产酶稳定的正向突变株YC-UV9-D13，其酶活达250.77U/mL，比野生菌株提高了4.9倍。纪亮等(精细化工，2021,38(07))采用低真空室温射频等离子体对解淀粉芽孢杆菌CICC 10035进行预处理,获得的突变株发酵48h后,α-淀粉酶酶活超过400U/mL,与对照样相比提高约20％。王兴吉等(中国酿造，2016，35(1))利用常压室温等离子体(ARTP)技术，对产中温α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌菌株进行诱变处理，通过平板、深孔板初筛及摇瓶复筛共筛选出3株酶活明显提高的菌株，其中产酶活力最高的突变株BS-12，摇瓶酶活达到了801U/mL，较出发菌株提高了32.2％。通过单因素试验，摇瓶酶活力达到1395U/mL。

四甲基吡嗪是一种含氮杂环化合物，广泛存在于食品原料、咖啡以及乳制品中，具有烘烤香气、甜香，是中国白酒中的重要香气化合物之一。张颖等(食品工业科技，2021，网络版)本研究从酱香大曲样品中分离出13株芽孢杆菌，通过蛋白酶透明圈试验初筛，选出5株产蛋白酶优良菌株。经过液态发酵试验筛选出一株高产四甲基吡嗪的功能菌，其发酵液中的四甲基吡嗪含量为12.22mg/L，鉴定为地衣芽孢杆菌GTBL-168，将该菌株的种子培养液接种到酱香型白酒堆积培养中与传统大曲协同发酵，堆积糟醅中乙偶姻和四甲基吡嗪的含量均有提高，接种量为7％时四甲基吡嗪产量比对照组提高24.88％。陈梦圆等(酿酒科技，2018(8)：24-29.)通过固态发酵法从高温大曲中筛选得到2株高产四甲基吡嗪菌株，分别为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)，发酵10d后产量最高可达150.92±0.783mg/L。王晓丹等(中国酿造，2017，36(2)：35-38.)对产四甲基吡嗪地衣芽孢杆菌进行了研究，结果表明，将筛选得到菌株按最佳添加量5％添加到窖池中层的糟醅中，发酵后的酒醅四甲基吡嗪含量达6.81μg/g，是对照组的3.03倍。张温清等(酿酒科技，2020，2:55-59)，从曲中筛选出10株高产四甲基吡嗪的功能菌株，通过鉴定分别属于枯草芽孢杆菌属、解淀粉芽孢杆菌属和地衣芽孢杆菌属，其中解淀粉芽孢杆菌XJB-104固态发酵生产麸曲中四甲基吡嗪的含量最高为202.54mg/kg。田源等(酿酒科技，2021，321(3))对芝麻香型白酒酿造用功能细菌麸曲6株芽孢杆菌产中性蛋白酶发酵培养基进行了优化，建立起了菌株混合发酵合成蛋白酶和四甲基吡嗪的最佳配比组合，其中组合A4的四甲基吡嗪含量最高为2.8245mg/L。王婧(贵州大学硕士论文，2016)报道了从酱香大曲中筛选到1株产吡嗪的地衣芽孢杆菌，应用到白酒发酵中，蒸馏酒样中的四甲基吡嗪含量达6.34mg/L。

白酒上使用的大曲应具有3种基本属性，即含酵母菌等活菌剂、具有淀粉酶、糖化酶等酶活性，以及含有白酒风味前提物质和营养物。大曲的质量对于白酒生产企业极为关键，直接决定传统酿造的白酒的出酒率和白酒的品质。其中大曲的淀粉酶活力与大曲的液化力呈正相关性，提高大曲的淀粉酶活力可以提高大曲对淀粉原料的液化和糖化水解能力，提高淀粉的利用率和白酒的出酒率。大曲的四甲基吡嗪含量与白酒的酱香风味呈正相关，其含量是影响酱香型和浓酱兼香型白酒品质的重要因子。如何提高大曲的质量，达到既能提高白酒产量又能改善白酒的品质和风味，是白酒生产企业面临的共同问题。

中国专利(CN201210277040.1)公布了一株解淀粉芽孢杆菌，其在蔗糖-豆饼粉-酵母膏等组成的液态培养基中产四甲基吡嗪能力可以达到2.4g/L,可用于四甲基吡嗪的生产。中国专利(申请号201710374672.2)报道了四甲基吡嗪解淀粉芽孢杆菌及芝麻香型白酒专用麸曲用途，制备的麸曲的四甲基吡嗪含量大于380mg/kg。中国专利(CN 102703358A)公布了一种芽孢杆菌高温大曲的制备方法。中国专利(CN 103865833A)公布了一种嗜热的解淀粉芽孢杆菌菌剂的制备方法。中国专利(CN 101445786A)公布了一株高产四甲基吡嗪的解淀粉芽孢杆菌及其发酵生产四甲基吡嗪的方法。中国专利(CN 104745503A)公布了一种解淀粉芽孢杆菌及其在淡雅型白酒中的应用。中国专利(CN 104388284A)公布了提高特香型白酒中丙酸乙酯含量的方法。中国申请专利(CN201811640572.0)公布了1株从酱香型窖内酒醅中分离得到的解淀粉芽孢杆菌,具有良好发酵能力和产蛋白酶、淀粉酶的能力,并且产酱香能力优良。中国专利(CN201110182244.2)公布了耐酸中温α-淀粉酶及其制备方法。中国专利(CN200510013865.2)公布了耐酸耐高温的α-淀粉酶及其制备方法。目前已报道的发酵白酒的解淀粉芽孢杆菌菌株仅涉及产四甲基吡嗪或产淀粉酶单一性状，存在菌株功能单一、综合性能不足等缺点。目前缺乏兼具产耐酸性淀粉酶活性高、产四甲基吡嗪等白酒酱香风味物质能力强、耐受性好的解淀粉芽孢杆菌及其在白酒中应用的报道。

发明技术内容：

本发明的一个目的是提供一株解淀粉芽孢杆菌菌株，该菌株兼具耐酸性α-淀粉酶活性和四甲基吡嗪活性的，产耐酸性α-淀粉酶活性高、产酱香风味能力好、具有较强耐受能力、可用于高温制曲和发酵生产白酒。

本发明的另一个目的是提供含有解淀粉芽孢杆菌的菌剂。

本发明的另一个目的是提供解淀粉芽孢杆菌发酵白酒的方法。

本发明的再一个目的是提供制备解淀粉芽孢杆菌固体菌剂的方法。

本发明的再一个目的是提供一种解淀粉芽孢杆菌及菌剂在制备强化大曲和发酵白酒中的应用。

本发明公开了一株新的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于,该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)DH1219，保藏于国家知识产权局指定的保藏机构-中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20211394。，保藏日期是2021年11月10日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话：027-68752319，Email:cctcc@whu.edu.cn。

解淀粉芽孢杆菌DH1219菌株是从湖北省某白酒厂发酵基质中经分离筛选获得。该菌株有如下特征：解淀粉芽孢杆菌DH1219在摇瓶中产中温α-淀粉酶活性达1875.2U/mL(U/mL)。该菌株对乙醇和高温具有较强的耐受性。该菌株在小麦粉固体发酵培养基中产四甲基吡嗪的含量达1630.5mg/L，并能产生纯正酱香风味，添加该菌株酿造的白酒原酒酱香突出，香味谐调，口感好。

解淀粉芽孢杆菌DH1219株形态特征是：菌落呈乳白色，表面粗糙、干燥，边缘不整齐，细胞为杆状，产芽孢。

解淀粉芽孢杆菌DH1219株生化特征是：可利用葡萄糖，蔗糖、甘露醇、木糖、淀粉。能在含8％NaCl的牛肉膏蛋白胨培养基中生长。

解淀粉芽孢杆菌DH1219株生长特征是：牛肉膏蛋白胨平板上划线接种，分别在37℃至45℃下培养均生长良好。

解淀粉芽孢杆菌DH1219株16S rDNA基因序列分析显示：解淀粉芽孢杆菌DH1219株与Bacillus amyloliquefaciens CICC 10036菌株的同源性大于99％。

本发明还公开了一种含解淀粉芽孢杆菌DH1219的菌剂，该菌剂主要成份是解淀粉芽孢杆菌DH1219株及其胞外产物和发酵基质。

本发明还公开了解淀粉芽孢杆菌DH1219及其微生物菌剂在高温大曲和发酵白酒中的应用。

在本发明中采用的参比菌株均为普通微生物菌种，其中解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)CICC 10036登载于中国工业微生物菌种保藏管理中心目录中，处于公开状态，科学工作者可向该菌种保藏中心索取。

本发明公开的菌剂为固态或液态。优先的，本发明公开的DH1219芽孢杆菌菌剂为固态。

本发明还公开了制备固态菌剂的方法，包括如下步骤：

(1)DH1219菌种活化：用接种环挑取一环DH1219菌种接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，置37℃恒温培养箱中培养20-24h。

(2)种子液的制备：挑取一环经活化的DH1219菌株接入装有80mL牛肉膏蛋白胨三角瓶液体培养基中，37℃、180r/min摇床培养20h备用。

(3)固体发酵培养基制备：按小麦粉50％，米糠30％，豆粕20％，料：水＝1:1，pH自然，混合均匀，配制成固体发酵培养基，并分装于耐高温的塑料盒中，121℃灭菌30min后冷却待用。

(4)固体菌剂培养：按5-10％接种量接入预先培养好的DH1219种子液至固体发酵培养基中，混合均匀后置37℃恒温培养箱中培养3天，每12h搅拌一次。

(5)干燥及粉碎：将上述发酵完毕的DH1219固体培养物置于55℃烘箱中烘至含水率低于15％，用万能粉碎机将干燥的培养物粉碎、过100目筛后，制备成固体粉末状菌剂并装入密封的塑料袋中，放置干燥、阴凉处或冰箱保鲜层中保藏。取样采用稀释平板测数法检测样品中DH1219芽孢杆菌的活菌数达50-300亿cfu/克。

(6)包装：将含DH1219株的固体菌剂装塑料袋封口后制成含单一菌种的酿酒菌剂。本发明的优点：

1、本发明提供的解淀粉芽孢杆菌DH1219株是一株新的菌株，该菌株具有很强的耐高温、耐酸和耐乙醇生长能力。该菌株在50℃下仍能生长良好，与37℃培养温度相比，其相对生长量达到65.8％，比标准菌株CICC10036高20.0％。DH1219菌株具有良好的耐乙醇生长特性,能够耐受12％(v/v)的乙醇,较标准菌株耐乙醇能力强。DH1219菌株可耐受的pH为4.0的酸性生长环境，较标准菌株耐酸能力强。

2、解淀粉芽孢杆菌DH1219株产耐酸性α-淀粉酶活性高，该酶的最适pH4.5。DH1219菌株摇瓶发酵产耐酸性α-淀粉酶活力达到1875.2U/mL，是标准菌株CICC10036的7.9倍。DH1219是目前已报道的解淀粉芽孢杆菌中产耐酸性α-淀粉酶活性最高的菌株。

3、解淀粉芽孢杆菌DH1219株产四甲基吡嗪含量高，在小麦粉固体发酵培养基中产四甲基吡嗪的含量达1630.5mg/kg，是标准菌株CICC10036的3.1倍。

4、接种解淀粉芽孢杆菌DH1219株的高温强化大曲液化力高，酱香风味突出，感官评价效果好。接种DH1219株的强化大曲的液化力达0.50g/gh，四甲基吡嗪含量达4500.1mg/L，分别是接种标准菌株的强化大曲的1.8倍和5.8倍。

5、接种解淀粉芽孢杆菌DH1219的强化大曲发酵的白酒出酒率和四甲基吡嗪含量高，感官评价好，其出酒率和四甲基吡嗪含量分别比接种标准菌株的白酒提高10.1％和202.9％。

即解淀粉芽孢杆菌DH1219株与标准菌株CICC10036相比具有较高的耐高温、耐酸、耐乙醇能力以及产耐酸性α-淀粉酶活性高、产白酒风味成分四甲基吡嗪的能力强、酱香风味突出并具有发酵白酒口感好等特点。

附图说明

图1是解淀粉芽孢杆菌DH1219菌株的系统发育树图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例来进一步阐述本发明。应当理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不能限制本发明的保护范围。

实施例

实施例1解淀粉芽孢杆菌耐受性好、产耐酸性淀粉酶活力和四甲基吡嗪含量高的突变株DH1219的分离、选育及鉴定

1.1耐酸、耐乙醇能力好、产耐酸性淀粉酶活力高的芽孢杆菌的分离

从湖北省某白酒厂采集大曲样品，称取酒醅样品10g，加至装有90mL无菌水的三角瓶中，振荡均匀后置于80℃恒温水浴锅中处理20min后，取10mL菌悬液加至添加有10％(v/v)乙醇浓度的用硫酸调至pH4.5的酸性牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、180rpm摇床富集培养40h,然后取富集培养后的菌液1mL用无菌水进行系列稀释，取10^-3、10^-4、10^-5三个稀释度涂布到产淀粉酶的细菌筛选平板上(培养基组成：淀粉10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，琼脂粉2％，pH 5.0)，每个稀释梯度做3个重复，置37℃恒温培养箱中培养36h，滴加碘液显色，观察各单菌落的水解圈直径大小。从平板上选取其中水解圈较大的29个单菌落经进一步划线分离纯化、保存用于α-淀粉酶活性测定。将分离获得的29株芽孢杆菌及1株标准解淀粉芽孢杆菌CICC10036菌株经牛肉膏平板活化后接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，37℃、170rpm摇床培养12h,将培养的种子液按照5％的接种量接种至产淀粉酶液体发酵培养基中(发酵培养基配方:玉米粉10.0％，豆粕粉4.0％，(NH₄)₂SO₄0.4％，K₂HPO₄0.8％，CaCl₂0.2％，pH5.0)37℃、220rpm摇床培养70h，离心(5000r，10min)，取上清液为待测样品，以50mmol/L的磷酸缓冲液(pH4.5)配制1％的可溶性淀粉溶液作为底物,按照DNS法测定各菌株发酵液的中性α-淀粉酶活力，每个菌株3瓶重复。各芽孢杆菌菌株α-淀粉酶活性测定结果如表1所示。采用此方法经筛选后获得能耐受10％乙醇浓度生长、产耐酸性α-淀粉酶性最高的8株芽孢杆菌，菌株编号分别为DH5、12、14、16、20、21、24、28(表1)。

表1不同芽孢杆菌菌株产耐酸性α-淀粉酶活性测定结果

1.2淀粉酶活力高、酱香风味突出的芽孢杆菌的筛选

选取上述表1中α-淀粉酶活性最高的8株芽孢杆菌菌株，分别接种至牛肉膏糖蛋白胨液体培养基中，37℃、180rpm培养20h，按照10％的接种比例接种至小麦固体培养基中，并设置空白组(未接种小麦固体培养基)，按照35℃→45℃→55℃升温培养，每个温度段各培养2d，参照香气、粘性的曲香感官评定标准,筛选出产酱香风味最好的功能芽孢杆菌。每个菌株3瓶重复，综合评分是重复3次试验的综合评价结果。8株芽孢杆菌及标准菌株发酵产酱香风味感官评价结果见表2。从表2可以看出：菌株DH12产酱香能力明显较其他菌株强，感官评价得分最高，该菌株的淀粉酶活性也比较高，但仍有进一步提高的空间和必要性。因此，选取芽孢杆菌菌株DH12为进一步诱变提高耐酸性淀粉酶活的出发菌株。

表2不同芽孢杆菌菌株产酱香能力比较结果

1.3高产耐酸性α-淀粉酶活性芽孢杆菌突变株DH1219的选育

以芽孢杆菌DH12为出发菌株，将紫外(UV)照射后的DH12菌悬液经过适当稀释后涂布到产淀粉酶的细菌筛选平板上，待其菌落比较明显时，从中挑出水解圈与菌落直径比最大的20个菌落(编号分别为1-20号)，分别接种到牛肉膏蛋白胨种子液培养基中,37℃、180rpm摇床培养12h,再按5％接种量转接到装有50mL产淀粉酶液体发酵培养基的250mL三角瓶中)，在37℃、220rpm条件下摇床培养70h后所得发酵液经离心，去除菌体得粗酶液。按照DNS法测定各菌株发酵液的α-淀粉酶活力，每个菌株3瓶重复。从中选取酶活最高的编号为5号的菌株DH12-5，作为进一步诱变的出发菌株。如此反复，经过第2轮UV诱变和筛选，共获得6株α-淀粉酶活性比出发菌株有显著提高的突变株，其中编号为19号的突变株的耐酸性α-淀粉酶摇瓶活性最高达1875.2U/mL，比出发菌株DH12的α-淀粉酶活性提高了200.3％，同时保留了出发菌株产酱香的优点，将该突变株命名为DH1219(见表3)。

表3 6株突变菌株的耐酸性α-淀粉酶活性测定结果

本发明人将分离的一株新的解淀粉芽孢杆菌DH1219株(Bacillusamyloliquefaciens DH1219)保藏于国家知识产权局指定的保藏机构-中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20211394，保藏日期是2021年11月10日。中国典型培养物保藏中心简称CCTCC，位于湖北省武汉市武汉大学校内，邮编430072，电话：027-68752319，Email:cctcc@whu.edu.cn。

1.4解淀粉芽孢杆菌DH1219株的鉴定：通过形态特征观察、生理生化测定及16SrDNA基因序列分析结果对DH1219进行鉴定。在鉴定中，本实验选择解淀粉芽孢杆菌Bacillus amyloliquefaciens CICC100361菌株作为对照菌株。解淀粉芽孢杆菌为常用普通微生物菌种，登载于中国工业菌种保藏中心目录中，处于公开状态，科学工作者可向保藏中心索取。1.2.1解淀粉芽孢杆菌DH1219株形态特征是：菌落呈乳白色，表面平整粗糙，不透明，边缘不整齐，细胞为短杆状，产芽孢。

1.2.2通过16S rDNA序列分析进行系统发育地位鉴定：

将分离纯化得到的细菌菌株接种到牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在37℃，180rpm的条件下振荡培养16h，再利用细菌基因组试剂盒提取基因组DNA。

采取试剂盒抽提得到细菌DNA后，通过PCR扩增16S rDNA，配置50μL的反应体系，细菌的16S rDNA引物为27F(5'-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3')。

PCR循环程序为：94℃预变性5min，94℃50s，54℃50s，72℃90s，30个循环；72℃延伸10min。扩增得到的细菌PCR产物送至金唯智生物科技有限公司测序，测序的长度在1400bp左右，测序结果采用BioaEdit软件序列图谱人工校对拼接，拼接后的序列在NCBI核酸序列数据库中进行同源序列搜索比对。根据同源序列搜索结果，选取测试菌株关系较近的模式菌株的16S rDNA序列区序列，用MEGA软件采取邻接法构建系统发育树。

实验得到1082bp的基因序列，在Genbank核酸序列数据库中进行同源序列搜索，DH1219与Bacillus amyloliquefaciens CICC10036的同源性超过99％，符合Kuttzman&Robnett所定的同种内不同菌株见差异不超过1％的标准。图1是根据16S rDNA序列所做的系统发育树。1.2.3：解淀粉芽孢杆菌DH1219株的生理生化实验测定结果：见表4。根据16SrDNA序列分析结果和生理生化实验测定结果，参照文献报道(东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京:科学出版社,2001,267-295.),可判断DH1219菌为解淀粉芽孢杆菌。

表4解淀粉芽孢杆菌DH1219株的生理生化实验结果

测定项目	结果	测定项目	结果
				接触酶	+	葡萄糖	+
厌氧生长	—	木糖	+
				甲基红试验	+	阿拉伯糖	+
硝酸盐还原	+	甘露醇	+
				50℃生长	+	乳糖	+
pH5.7生长	+	蔗糖	+
				8％NaCl生长	+	甘油	—
淀粉水解	+	发酵葡萄糖产气	—
				分解酪素	+	利用柠檬酸盐	—

实施例2解淀粉芽孢杆菌DH1219抗性能力比较分析

2.1解淀粉芽孢杆菌DH1219株与标准菌株CICC10036耐乙醇能力比较

将菌株DH1219和标准菌株CICC10036的种子液接入含有乙醇浓度(v/v)分别为0％、2％、4％、6％、8％、10％、12％的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于37℃、180rpm摇瓶培养24h后，菌液稀释10倍后用分光光度计测OD₆₀₀值。如表4所示，在添加了12％(v/v)乙醇的培养基中，DH1219仍生长较好，但CICC10036菌株则几乎不生长，表明DH1219耐乙醇的能力明显高于CICC10036菌株。

表5解淀粉芽孢杆菌DH1219株与标准菌株CICC10036耐酒精能力比较(OD₆₀₀)

2.2解淀粉芽孢杆菌DH1219耐酸生长能力测定(OD₆₀₀)

使用硫酸分别调节牛肉膏蛋白胨液体培养基pH至3.5、4.0、4.5、5.0、6.0。将菌株DH1219和标准菌株CICC10036的种子液分别转接到不同pH的牛肉膏蛋白胨液体培养基中，置于37℃、170rpm摇瓶培养24h，稀释10倍后测OD₆₀₀值。从表6可以看出，解淀粉芽孢杆菌DH1219在pH3.5的牛肉膏蛋白胨培养基中仍有一定生长，在pH4.0的培养基中有明显生长，而标准菌株CICC10036在这2种pH值条件下几乎不生长。DH1219株在pH4.5的培养基中已生长较好，而CICC10036株仅有微弱生长。表明DH1219株耐酸生长能力明显高于CICC10036菌株。

表6解淀粉芽孢杆菌DH1219与标准菌株CICC10036耐酸生长能力比较

注：“—”表示不生长

2.3解淀粉芽孢杆菌DH1219耐高温生长能力测定

将培养的两种解淀粉芽孢杆菌种子液按相同比例分别接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，分别在37℃、45℃和50℃下170rpm摇床培养24h，测定OD₆₀₀值。检测结果见表7，结果表明DH1219菌株具有很强的耐高温性，与37℃培养的生长量相比，45℃和50℃下的相对生长量分别达80.0％和56.9％，其耐高温能力比标准菌株CICC10036好。

表7DH1219与标准菌株CICC10036的耐高温生长能力测定结果

实施例3、解淀粉芽孢杆菌DH1219株产α-淀粉酶的耐酸能力测定

按照实施例1.1中描述的产α-淀粉酶发酵方法和测定方法，分别接种和培养菌株DH1219和标准菌株CICC10036，提取各菌株发酵后的离心上清液，并分别以50mmol/L的磷酸缓冲液(pH 4.0、4.5、5.0、7.0)配制1％的可溶性淀粉溶液作为底物,按照DNS法测定各菌株发酵液在不同pH缓冲液中的α-淀粉酶活力，每个菌株3瓶重复。测定结果如表8所示，DH1219菌株产的α-淀粉酶在pH4.5时酶活性最高达1875.2U/mL，比标准菌株CICC10036的酶活高7.9倍，并且DH1219菌株产的α-淀粉酶的最适pH值比标准菌株的pH值高，具有较好的耐酸能力。

表8两株芽孢杆菌发酵液在不同pH下的α-淀粉酶酶活测定结果(U/mL)

实施例4、解淀粉芽孢杆菌DH1219株固态发酵产四甲基吡嗪等含量测定

将解淀粉芽孢杆菌DH1219株及参比菌株CICC10036经牛肉膏蛋白胨液体培养基培养好后，按2％接种量分别接种于小麦粉固体培养基中(小麦经粉碎后按料水比1:0.4加水后浸润过夜，分装到三角瓶中，121℃，灭菌30min)，37℃发酵7d。取发酵样品经处理后用于气相-质谱(GC-MS)分析风味组分。样品处理方法：发酵样品50g加入50％乙醇100ml，30℃、170rpm震荡1h，结束后加入5ml CH2Cl2充分混匀静置，收集下层萃取相，8000rpm离心1min取上清液滤膜过滤后即为萃取样品。发酵样品的GC-MS分析结果表明(表9)：接种DH1219株的固态发酵小麦培养基产生的白酒健康因子四甲基吡嗪和风味物质丁酸、异戊酸、乙酸乙酯的含量均显著高于标准菌株CICC10036。其中，DH1219株产四甲基吡嗪的含量是CICC10036株的3.1倍。

表9两株芽孢杆菌固态发酵产物的GC-MS分析结果

实施例5DH1219芽孢杆菌酿酒菌剂的制备方法

按照如下步骤进行：

(1)DH1219菌种活化：用接种环挑取一环DH1219菌种接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，置37℃恒温培养箱中培养20-24h。

(2)种子液的制备：挑取一环经活化的DH1219菌株接入装有80mL牛肉膏蛋白胨三角瓶液体培养基中，37℃、180r/min摇床培养20h备用。

(3)固体发酵培养基制备：按小麦粉50％，米糠30％，豆粕20％，料：水＝1:1，pH自然，混合均匀，配制成固体发酵培养基，并分装于耐高温的塑料盒中，121℃灭菌30min后冷却待用。

(4)固体菌剂培养：按5-10％接种量接入预先培养好的DH1219种子液至固体发酵培养基中，混合均匀后置37℃恒温培养箱中培养3天，每12h搅拌一次。

(5)干燥及粉碎：将上述发酵完毕的DH1219固体培养物置于55℃烘箱中烘至含水率低于15％，用万能粉碎机将干燥的培养物粉碎、过100目筛后，制备成固体粉末状菌剂并装入密封的塑料袋中，放置干燥、阴凉处或冰箱保鲜层中保藏。取样采用稀释平板测数法检测样品中DH1219芽孢杆菌的活菌数达50-300亿cfu/克。

(6)包装：将含DH1219株的固体菌剂装塑料袋封口后制成含单一菌种的酿酒菌剂。实施例6解淀粉芽孢杆菌DH1219酿酒菌剂在生产白酒高温强化大曲中的应用

某白酒企业制曲车间，采用小麦为制曲原料，按照高温大曲的生产方法生产接种有实施例5制备的DH1219酿酒菌剂的强化大曲，具体方法：每组制曲小麦用量100Kg，料水比1:0.4。对照组只接种5％的母曲粉，两个实验组按照母曲重量的0.1％分别添加2种芽孢杆菌固体菌剂，即5％母曲粉+0.1％DH1219酿酒菌剂、5％母曲粉+0.1％CICC10036酿酒菌剂，每个处理三个平行样。按照白酒高温大曲生产的方法，大曲压块后在曲房中经45天发酵后，测定大曲的感官评价、理化指标及风味物质含量。液化力测定方法参照相关白酒企业标准执行。结果表明：接种DH1219菌剂的强化大曲的感官评价、液化力和四甲基吡嗪等风味含量测定结果均明显高于对照组和CICC10036组(表10)，其中DH1219组的大曲液化力分别是对照组和CICC10036组的2.5倍和1.8倍；四甲基吡嗪含量分别是对照组和CICC10036组的10.5倍和5.8倍。

表10接种两株芽孢杆菌的强化大曲的感官评价及分析测定结果

注：+++：酱香风味突出；+：酱香风味一般

实施例7接种解淀粉芽孢杆菌DH1219株的强化大曲在提高浓酱兼香型白酒出酒率和酒品质量中的应用

7.1试验方法

将上述实施例6中生产的DH1219组及CICC10036组芽孢杆菌强化大曲应用于某白酒企业进行酿酒效果比较，按照浓酱兼香型白酒酿酒工艺，酿酒车间蒸馏后的酒醅摊凉后按照200kg/组分堆，对照组接种为添加外源菌剂的普通高温大曲，两个实验组分别接种实施例6中生产的DH1219和CICC10036强化大曲，三组添加大曲的比例均为投料量的12％。接种后进行高温堆积发酵3-4天，堆料温度达45℃后入池发酵30d，取样蒸馏。每个处理三个平行样。对蒸馏的样品中的醇类、酸类、酯类等成分含量进行气相色谱分析。主要仪器：气相色谱分析仪。

7.2酒质色谱分析结果及感官品评

由表11可以看出：接种DH1219强化大曲的实验组原酒的酒精度可达60.2％，比CICC10036组提高了10.1％。DH1219组原酒中的四甲基吡嗪、总酸、总酯的含量分别较CICC10036组提高了202.9％、19.4％和18.5％。对提高原酒的酱香风味和改善口感作用明显。表明酒醅中添加含DH1219的强化大曲对于提高原酒出酒率和酒品质量有明显的促进作用。

表11发酵酒醅蒸馏酒样中各成分气相色谱分析结果

感官品评对比为：对照组酒样分数在85-90，评语是较醇厚、香味较谐调、酒体较丰满；CICC10036组酒样分数在90-95,评语为醇厚、香味较谐调、酒体较丰满；DH1219组酒样分数在95-100，评语为酱浓谐调、醇厚丰满、香味谐调、酒体丰满。表明使用含解淀粉芽孢杆菌DH1219的强化大曲不仅可以显著提高出酒率，还可以明显改善酒质，由于总酸、总酯和四甲基吡嗪等白酒的主要香味成分含量的增加，使浓酱兼香型白酒中的酱香风味得到加强，香气更加协调，口感更佳。

Claims (7)

1.一株兼具耐酸性α-淀粉酶活性和四甲基吡嗪活性的解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)DH1219株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M20211394。

2.一种含权利要求1中所述的解淀粉芽孢杆菌DH1219的微生物菌剂，其特征在于其活性成分为解淀粉芽孢杆菌DH1219菌体及其代谢产物。

3.一种含有权利要求1所示的解淀粉芽孢杆菌DH1219株的强化大曲，按重量百分比，解淀粉芽孢杆菌DH1219菌剂的加量是母曲的0.1％。

4.根据权利要求2中所述的微生物菌剂，其特征在于所述的菌剂为固态菌剂。

5.制备权利要求2中所述的菌剂的制备方法，该方法包括如下步骤：

(1)DH1219菌种活化：用接种环挑取一环DH1219菌种接种于牛肉膏蛋白胨斜面培养基中，置37℃恒温培养箱中培养20-24h；

(2)种子液的制备：挑取一环经活化的DH1219菌株接入装有80mL牛肉膏蛋白胨三角瓶液体培养基中，37℃、180r/min摇床培养20h备用；

(3)固体发酵培养基制备：按小麦粉50％，米糠30％，豆粕20％，料：水＝1:1，pH自然，混合均匀，配制成固体发酵培养基，并分装于耐高温的塑料盒中，121℃灭菌30min后冷却待用；

(4)固体菌剂培养：按5-10％接种量接入预先培养好的DH1219种子液至固体发酵培养基中，混合均匀后置37℃恒温培养箱中培养3天，每12h搅拌一次；

(5)干燥及粉碎：将发酵完毕的DH1219固体培养物置于55℃烘箱中烘至含水率低于15％，用万能粉碎机将干燥的培养物粉碎、过100目筛后，制备成固体粉末状菌剂并装入密封的塑料袋中，放置干燥、阴凉处或冰箱保鲜层中保藏，取样采用稀释平板测数法检测样品中DH1219芽孢杆菌的活菌数达50-300亿cfu/克；

(6)包装：将含DH1219株的固体菌剂装塑料袋封口，制成含单一菌种的酿酒菌剂。

6.权利要求2所述的解淀粉芽孢杆菌DH1219菌剂在白酒酿造中的应用。

7.权利要求3中所述的含有DH1219强化大曲在白酒酿造中的应用。